[转发]结核分枝杆菌核酸扩增荧光定量检测标准操作规程

三、结核分枝杆菌核酸扩增荧光定量检测标准操作规程

采用一对PCR引物和一个荧光双标记的探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，从而将PCR技术和荧光检测技术结合起来，实现了对TB核酸的自动化检测；检测灵敏度为10个TB菌/毫升，反应管在PCR循环结束后无需开盖；采用了dUTP-UNG酶防污染系统。 可用于可疑结核病患者经处理的痰液标本结核分支杆菌核酸的定性检测，可用于结核病的辅助诊断。

1、储存条件及有效期

本试剂盒贮存于-20℃的条件下有效期为12个月（请于有效期内使用）

2、自备试剂

4% NaOH、灭菌生理盐水

3、样本采集

3.1 以清晨第一口痰为宜。

3.2 先用清水漱口，嘱患者用力咳出深部的痰于无菌样本保存管，密封送检。

4、样本存放

4.1 待测样本在2-8℃保存不应超过24小时。

4.2 -20℃保存不超过三个月；。

4.3 -70℃以下长期保存。

4.4 应避免反复冻融。

5、样本运输

采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。

6、扩增试剂准备（PCR前准备区）

6.1 从试剂盒中取出TB PCR反应液、Taq酶及UNG，室温融化并振荡混匀后，2,000rpm离心10sec。

6.2 设所需要的PCR反应管管数为n（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：

6.21 Roche LightCycler ,Roter-Gene2000/3000仪器，准备相应数量的毛细管

试 剂	TB PCR反应液	Taq酶	UNG
用 量	17.8 ul	0.2 ul	0.03 ul

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，充分混合均匀，2000rpm离心10sec，向设定的n个Roche毛细管(LightCycler)中或普通PCR反应管(Roter-Gene2000/3000)中分别加入18ul，转移至样本处理区。

6.22 PE Gene Amp 5700，PE Gene Amp 7700，ABI-7000，ABI-7300，BIO-RAD iCycler，Line-GeneⅠ，Line-GeneⅡ，MJ OpticonⅠ，MJ Opticon Ⅱ等仪器，准备好相应的反应管

试 剂	TB PCR反应液	Taq酶	UNG
用 量	37．8 ul	0.2 ul	0.06 ul

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，充分混合均匀，2000rpm离心10sec，向设定的n个PCR 反应管中分别加入38ul，转移至样本处理区。

7、样本处理（样本处理区）

7.1 首先对痰液样本进行目测，若样本中唾液占绝大部分，则需重新采集样本。

7.2 目测合格后，在样本中加入2～3倍体积4％的NaOH溶液。

7.3 37℃恒温处理30min或常温下1hr，使其充分液化，无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全。

7.4 若液化不完全，可适当再加入少量4％的NaOH溶液直至液化完全。

7.5 取液化后的标本900ul以及试剂盒中的阴性对照、阳性对照各500ul于1.5ml无菌离心管中，13,000rpm离心10min。

7.6 弃上清（先倒出大部分液体，再用移液器尽量吸干至无明显液滴为止）。

7.7 沉淀中加入1ml灭菌生理盐水，振荡悬浮（注意：按紧离心管盖后，横向按在漩涡振荡器上将沉淀振起）。

7.8 13,000rpm离心10min。

7.9 弃上清，用1ml灭菌生理盐水洗涤沉淀。

7.10 13,000rpm离心10min。

7.11 弃上清，向沉淀中加入DNA提取液30ul，振荡混匀。

7.12 2,000rpm离心5sec，放37℃温浴30min。

7.13 再放入100℃水浴/干浴10min。

7.14 13,000rpm离心10min，保留上清备用。

7.15 如果样本裂解产物当天不使用，请于-20℃保存。

8、加样（样本处理区）

8.1 若样本及对照品裂解产物保存在-20℃，使用前置室温解冻，以13,000rpm离心5min。

8.2 Roche仪器

8.21在所设定的n个Roche毛细管中分别加入步骤7中处理过的样本、阴性对照、阳性对照上清液各2ul。

8.23 盖紧管盖，连同Roche专用金属反应管套放在离心机中，于2,000rpm离心10sec。

8.24 将毛细管排好放入Roche PCR仪内，记录样本摆放顺序。

8.3 非Roche仪器

8.31 向所设定的n个PCR反应管中分别加入步骤6中处理过的样本、阴性对照、阳性对照上清液各2ul。

8.32 盖紧管盖，将PCR 反应管转移至检测区，置于PCR仪上，记录样本摆放顺序。

9、PCR扩增（检测区）

9.1 循环扩增条件

9.1.1 Roche Lightcycler

a) 37℃：3 min； 93℃：1 min；

b) 93℃：5 sec, 60℃：40 sec（Acquisition Mode为Single）40个循环，Analysis Mode为Quantification。

9.1.2 Roter-Gene2000/3000

a) 37℃：5 min； 94℃：1 min；

b) 95℃：5 sec, 60℃：30 sec，40个循环。反应体系设为20ul。荧光信号收集设在60℃。

9.1.3 PE Gene Amp5700，7700，ABI-7000，7300，

a) 37℃：5 min； 94℃：1 min；

b) 95℃：5 sec, 60℃：30 sec，40个循环。反应体系设为40ul。

9.1.4 Line-GeneⅠ,Ⅱ

a) 37℃：5 min； 94℃：1 min；

b) 95℃：5 sec, 60℃：40 sec，40个循环。反应体系设为40ul。

9.1.5 BIO-RAD iCycler

a) 37℃：5 min； 94℃：1 min；

b) 95℃：5 sec, 60℃：30 sec，42个循环。反应体系设为40ul。

9.1.6 MJ OpticonⅠ,Ⅱ

a) 37℃：5 min； 94℃：1 min；

b) 95℃：5 sec, 60℃：30 sec，40个循环。反应体系设为40ul。荧光信号收集设在60℃。

9.2 仪器检测通道选择

9.21 Roche Lightcycler

选择F1通道。

9.22 Roter-Gene2000/3000

Acquisiton选择Fam。

9.23 PE Gene Amp 5700，7700，ABI-7000，7300

a) PE Gene Amp 5700是单通道荧光PCR检测仪，无需选择检测通道。

b) PE Gene Amp 7700, ABI-7000，7300 Reporter设为FAM，Quencher设为TAMRA。Passive Reference设为None（ABI-7000，7300）。

9.24 BIO-RAD iCycler

荧光素选择FAM-490。

9.25 Line-GeneⅠ,Ⅱ

选择F1通道，增益值批间有所不同，应按每批试剂建议值设定。（每一批试剂的增益值详见试剂盒中给定值）

9.26 MJ OpticonⅠ,Ⅱ

a) OpticonⅠ是单通道荧光PCR检测仪，无需选择荧光通道。

b) Opticon Ⅱ是双通道荧光检测仪，由于实验只需要单荧光，选择Single Color Experiment。

10、结果分析条件设定

10.1 Roche Lightcycler

10.11 选择F1或F1／F2通道（建议选择F1通道），点击Quantification进入定量分析窗口。

10.12 在Quantification窗口中，设定Analysis 方式为Fit points，Adjustment 方式为 proportional。

10.13 选定Noise band项, 阈值（Noise band cursor）设定以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值不出现任何数值为准。

10.14 也可根据仪器的实际情况进行调整。

10.2 Roter-Gene2000/3000

阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值无数值为准。

10.3 PE Gene Amp 5700，7700，ABI-7000，7300

10.31 PE Gene Amp 5700 结果分析时基线（baseline）的确定：取6—10或6—15个循环的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值=40.0为准。

10.32 PE Gene Amp 7700，ABI-7000，7300结果分析时基线（baseline）的确定：取3—10或3—15个循环的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值=40.0为准。

10.4 BIO-RAD iCycler

10.41 果分析时基线（baseline）的确定，基线（baseline）取为2—10或2—15个循环的荧光信号。

10.42 阈值(threshold) 设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值=0.0为准。也可根据仪器噪音情况在15.0—40.0之间调整。

10.5 Line-GeneⅠ,Ⅱ

10.51击数据分析进入结果分析界面。

10.52选择样点拟合法进行结果分析：零点调整取1－10或1－15个循环的荧光信号。

10.53在噪声容限界面下调整基线位置，其设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增线（无规则的噪音线）的最高点为准。

10.54选择定量分析，对样本进行结果分析。

10.6 MJ OpticonⅠ,Ⅱ

10.61击Quantitation进入结果分析窗口

10.62在Option选项区域进行基线以及阈值线的调整。

10.63取为2—10或2—15个循环的荧光信号，阈值(threshold) 设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值显示为none为准。

10.64也可根据仪器噪音情况在15.0—40.0之间调整。

10.65在用PE5700/7700,ABI-7000,7300/BIO-RAD, OpticonⅠ,Ⅱ/ Line-GeneⅠ,Ⅱ iCycler荧光定量PCR检测仪进行分析的过程中，为避免漏检强阳性样本，

a) 应首先将基线定为6—10/3—10/2—10/1－10个循环的荧光信号观察分析Ct值。

b) 如果没有Ct值＜16.0的样本，则将基线改定为6—15/3—15/2—15个循环的荧光信号进行结果分析。

c) 如有Ct值＜16.0的样本，则应将该样本剔除此次结果分析。

d) 同时仍将基线改定为6—15/3—15/2—15个循环的荧光信号进行结果分析。

11、质控标准

11.1 阴性对照的Ct值均应等于40.0(PE5700和7700)或无数值。

11.2 阳性对照的Ct值应小于等于30.0。

11.3 否则，此次实验视为无效。

12、结果判断

12.1 Ct值等于40或0的样本为阴性样本。

12.2 检测样本Ct值≤37.0者判为阳性。

12.3 Ct值大于37.0的样本建议重做。

12.4 重做结果Ct值＜40者为阳性，否则为阴性。

13、试剂盒使用注意事项

13.1 有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管 理规范执行。

13.2 本试剂盒仅用于体外检测。

13.3 阳性工作标准品具体拷贝数请参照试剂盒内给定值。

13.4 实验请严格分区操作：

13.41 第一区：PCR前准备区 — 准备扩增所需试剂；

13.42 第二区：样本处理区 — 待测样本和对照品处理；

13.43 第三区：检测区 — PCR扩增检测。

13.5 各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染，实验后即请清洁工作台。

13.6 试剂盒内各试剂使用前，充分融化并振荡混匀后请稍事离心。

13.7 在－20℃保存的样本裂解产物，应在加样前置室温解冻，作短暂离心后使用。

13.8 分装有反应液的反应管应扣盖或装入密实袋内再转移至样本区。

13.9 加样时应使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。

13.10扩增完毕立即取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。

13.11反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。

13.12实验中用过的吸头请直接打入盛有1%次氯酸钠的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。

13.13工作台及各物品定期用1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消毒。