[转发]人乳头瘤病毒（16型/18型）核酸扩增荧光定量检测标准操作规程

六、人乳头瘤病毒（16型/18型）核酸扩增荧光定量检测标准操作规程

采用PCR核酸扩增方法结合荧光探针检测技术，通过荧光自动PCR仪实现在全封闭反应体系中进行核酸扩增与检测；能分型检测人乳头瘤病毒（HPV）16型和18型核酸 。

适用于临床尖锐湿疣患者疣体表面脱落细胞及妇女宫颈上皮细胞。可用于临床可疑尖锐湿疣患者的确诊，及HPV感染的早期辅助诊断。

1、贮存条件及有效期

本试剂盒贮存于-20℃的条件下有效期为一年（请于有效期内使用）

2、样本采集

2.1 采集分泌物标本。

2.2 要求患者在采样前2小时不能排尿。

2.3 对于生殖器或肛周有疣状体增生，怀疑为尖锐湿疣的患者

2.31采集疣体表皮脱落细胞。

2.32用生理盐水浸润的棉拭子，用力来回擦拭疣状组织表面三次，取得脱落细胞。

2.33将取样后的棉拭子，放入备有1ml无菌生理盐水的样本管中， 充分漂洗后，将棉拭子贴壁挤干丢弃。

2.4 对于其他可疑感染者，采集女性宫颈口或男性尿道口分泌物棉拭子样本。

2.41采样前，用棉拭子将宫颈口或尿道口过多的分泌物轻轻擦拭干净。

2.42更换棉拭子，用生理盐水浸润的棉拭子，紧贴宫颈口或尿道口粘膜，稍用力转动两周，以取得分泌物及脱落细胞。

2.43将取样后的棉拭子，放入备有1ml无菌生理盐水的样本管中，。

2.44充分漂洗后，将棉拭子贴壁挤干丢弃。

3、样本存放

3.1 采集的样本在室温放置不超过3小时。

3.2 4℃保存不超过24小时。

3.3 -20℃保存不超过三个月。

3.4 -70℃可长期保存。

3.5 应避免反复冻融。

4、样本运输

采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。

5、扩增试剂准备（PCR前准备区）

5.1 从试剂盒中取出HPV16 PCR反应液、HPV18 PCR 反应液、Taq酶及UNG,室温融化并混合均匀后，2000rpm离心10sec。

5.2 设所需要的PCR反应管管数为n（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：

5.21Roche LightCycler ,Roter-Gene2000/3000仪器，准备相应数量的毛细管

试 剂	PCR反应液	Taq酶	UNG
HPV16 型	17.8 ul	0.2 ul	0.03 ul
HPV18 型	17.8 ul	0.2 ul	0.03 ul

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，充分混合均匀，2000rpm离心10sec，向设定的n个Roche毛细管(LightCycler)中或普通PCR反应管(Roter-Gene2000/3000)中 分别加入18ul，转移至样本处理区。

5.22PE Gene Amp 5700，PE Gene Amp 7700，ABI-7000，ABI-7300，BIO-RAD iCycler，Line-GeneⅠ，Line-GeneⅡ，MJ OpticonⅠ，MJ Opticon Ⅱ等仪器，准备好相应的反应管

试 剂	PCR反应液	Taq酶	UNG
HPV16 型	37.8 ul	0.2 ul	0.06 ul
HPV18 型	37.8 ul	0.2 ul	0.06 ul

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，充分混合均匀，2000rpm离心10sec，向设定的n个PCR 反应管中分别加入38ul，转移至样本处理区。

6、样本处理（样本处理区）

6.1 取出待测样本以及试剂盒阴性对照，置于室温解冻，并振荡混匀。

6.2 各取100ul样本，13,000rpm离心10min。

6.3 小心吸弃上清，保留沉淀物。

6.4 向沉淀物中加入50ul DNA提取液2，振荡混匀。

6.5 100℃沸水浴/干浴10min。

6.6 13,000rpm离心10min，保留上清备用。

6.7 如样本裂解产物当天不使用，请于-20℃保存）。

6.8 阳性对照品无须用提取液处理

7、加样（样本处理区）

7.1 若样本及对照品裂解产物保存在-20℃，使用前置室温解冻，以13,000rpm离心5min。

7.2 Roche仪器

7.21 在所设定的n个Roche毛细管中分别加入步骤5中处理过的样本、阴性对照和阳性对照上清液各2ul。

7.22 盖紧管盖，连同Roche专用金属反应管套放在离心机中，于2,000rpm离心10sec。

7.23 将毛细管排好放入Roche PCR仪内，记录样本摆放顺序。

7.3 非Roche仪器

7.31向所设定的n个PCR反应管中分别加入步骤6中处理过的样本、阴性对照和阳性对照上清液各2ul。

7.32盖紧管盖，将PCR 反应管转移至检测区，置于PCR仪上，记录样本摆放顺序。

8、PCR扩增（检测区）

8、1循环扩增条件

8.11 Roche Lightcycler

a) 37℃：3 min； 93℃：1 min；

b) 93℃：5 sec, 60℃：40 sec（Acquisition Mode为Single）40个循环，Analysis Mode为Quantification。

8.12 Roter-Gene2000/3000

a) 37℃：5 min； 94℃：1 min；

b) 95℃：5 sec, 60℃：30 sec，40个循环。反应体系设为20ul。荧光信号收集设在60℃。

8.13 PE Gene Amp5700，7700，ABI-7000，7300

a) 37℃：5 min； 94℃：1 min；

b) 95℃：5 sec, 60℃：30 sec，40个循环。反应体系设为40ul。

8.14 Line-GeneⅠ,Ⅱ

a) 37℃：5 min； 94℃：1 min；

b) 95℃：5 sec, 60℃：40 sec，40个循环。反应体系设为40ul。

8.15 BIO-RAD iCycler

a) 37℃：5 min； 94℃：1 min；

b) 95℃：5 sec, 60℃：30 sec，42个循环。反应体系设为40ul。

8.16 MJ OpticonⅠ,Ⅱ

a) 37℃：5 min； 94℃：1 min；

b) 95℃：5 sec, 60℃：30 sec，40个循环。反应体系设为40ul。荧光信号收集设在60℃。

9、2 仪器检测通道选择

9.21 Roche Lightcycler

选择F1通道。

9.22 Roter-Gene2000/3000Acquisiton选择Fam。

9.23 PE Gene Amp 5700，7700，ABI-7000，7300

a) PE Gene Amp 5700是单通道荧光PCR检测仪，无需选择检测通道。

b) PE Gene Amp 7700, ABI-7000，7300 Reporter设为FAM，Quencher设为TAMRA。 Passive Reference设为None（ABI-7000，7300）。

9.24 BIO-RAD iCycler

荧光素选择FAM-490。

9.25 Line-GeneⅠ,Ⅱ

选择F1通道，增益值批间有所不同，应按每批试剂建议值设定。（每一批试剂的增益值详见试剂盒中给定值）

9.26 MJ OpticonⅠ,Ⅱ

a) OpticonⅠ是单通道荧光PCR检测仪，无需选择荧光通道。

b) Opticon Ⅱ是双通道荧光检测仪，由于实验只需要单荧光，选择Single Color Experiment。

10、结果分析条件设定

10.1 Roche Lightcycler

10.11 择F1或F1／F2通道（建议选择F1通道），点击Quantification进入定量分析窗口。

10.12 在Quantification窗口中，设定Analysis 方式为Fit points，Adjustment 方式为 proportional。

10.13 选定Noise band项, 阈值（Noise band cursor）设定以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值不出现任何数值为准。

10.14 也可根据仪器的实际情况进行调整。

10.2 Roter-Gene2000/3000

阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值无数值为准。

10.3 PE Gene Amp 5700，7700，ABI-7000，7300

10.31 PE Gene Amp 5700 结果分析时基线（baseline）的确定

a) 取6—10或6—15个循环的荧光信号。

b) 阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值=40.0为准。

10.32 PE Gene Amp 7700，ABI-7000，7300结果分析时基线（baseline）的确定

a) 取3—10或3—15个循环的荧光信号。

b) 阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值=40.0为准。

10.4 BIO-RAD iCycler

10.41 结果分析时基线（baseline）的确定，基线（baseline）取为2—10或2—15个循环的荧光信号。

10.42 阈值(threshold) 设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值=0.0为准。

10.43 也可根据仪器噪音情况在15.0—40.0之间调整。

10.5 Line-GeneⅠ,Ⅱ

10.51 点击数据分析进入结果分析界面。

10.52 选择样点拟合法进行结果分析：零点调整取1－10或1－15个循环的荧光信号。

10.53 在噪声容限界面下调整基线位置，其设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增线（无规则的噪音线）的最高点为准。

10.54 选择定量分析，对样本进行结果分析。

10.6 MJ OpticonⅠ,Ⅱ

10.61点击Quantitation进入结果分析窗口

10.62在Option选项区域进行基线以及阈值线的调整。

10.63取为2—10或2—15个循环的荧光信号，阈值(threshold) 设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值显示为none为准。

10.64也可根据仪器噪音情况在15.0—40.0之间调整。

10.65 在用PE5700/7700,ABI-7000,7300/BIO-RAD, OpticonⅠ,Ⅱ/ Line-GeneⅠ,Ⅱ iCycler荧光定量PCR检测仪进行分析的过程中，为避免漏检强阳性样本。

a) 应首先将基线定为6—10/3—10/2—10/1－10个循环的荧光信号观察分析Ct值。

b) 如果没有Ct值＜16.0的样本，则将基线改定为6—15/3—15/2—15个循环的荧光信号进行结果分析。

c) 如有Ct值＜16.0的样本，则应将该样本剔除此次结果分析。

d) 同时仍将基线改定为6—15/3—15/2—15个循环的荧光信号进行结果分析。

11、质控标准

11.1 阴性对照无Ct值

11.2 阳性对照的Ct值＜30。

11.3 否则视本次实验无效，建议重新进行样本的裂解。

12、判断结果

12.1 无Ct值显示的样本为阴性样本。

12.2 检测样本Ct值≤37.0者判为阳性。

12.3 Ct值大于37.0的样本建议重做。

12.4 重做结果Ct值＜40者为阳性，否则为阴性。

13、试剂盒使用注意事项

13.1 有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管理规范执行。

13.2 本试剂盒仅用于体外检测。

13.3 阳性工作标准品具体拷贝数请参照试剂盒内给定值。

13.4 实验请严格分区操作：

13.41 第一区：PCR前准备区 — 准备扩增所需试剂；

13.42 第二区：样本处理区 — 待测样本和对照品处理；

13.43 第三区：检测区 — PCR扩增检测。

13.5 各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染，实验后即请清洁工作台。

13.6 试剂盒内各试剂使用前，充分融化并振荡混匀后请稍事离心。

13.7 在－20℃保存的样本裂解产物，应在加样前置室温解冻，作短暂离心后使用。

13.8 分装有反应液的反应管应扣盖或装入密实袋内再转移至样本区。

13.9 加样时应使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。

13.10 扩增完毕立即取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。

13.11 反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。

13.12 实验中用过的吸头请直接打入盛有1%次氯酸钠的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。

13.13 工作台及各物品定期用1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消毒。

14．各区域内必备物品一览表

PCR前准备区	样本处理区	检测区
1． 离心机 2． 混匀器 3． 冰箱（4℃、-20℃） 4． 微量加样器一套 5． 离心管架 6． 消耗品:一次性手套，带滤芯吸头、离心管和玻璃器皿 7． 紫外灯 8． 专用工作服和办公用品	1． 台式高速离心机 2． 混匀器 3． 冰箱（4℃、-20℃） 4． 微量加样器一套 5． 通风柜、紫外灯 6． 离心管架 7． 消耗品:一次性手套，带滤芯吸头、离心管和玻璃器皿 8． 专用工作服和办公用品	1．荧光PCR检测仪 2．紫外灯 3．专用工作服、办公用品、一次性手套

15．建议使用离心管和吸头一览表

名称	规格	生产厂家	Cat.No
吸头	10ul	美国AXYGEN公司	TF-300
	200ul		TF-200
	1000ul		TF-1000
离心管	0.5ml		MCT-060-C
	1.5ml		MCT-150-C