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[转发]流式细胞仪操作规程

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郑振寰 发表于 2007-2-10 09:48 | 显示全部楼层 |阅读模式

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流式细胞仪操作规程目录

1:淋巴细胞亚群测定

2HLA-B27测定

3CD55CD59测定

4:血小板抗体测定

5:红细胞抗体测定

6:粒细胞抗体测定

7:白血病免疫分型测定

8:淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定

9XL操作步骤

淋巴细胞亚群测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号:

200 日起实施

第1版

(共3页)

本规程每2年复审一次

复审日期:

复审人:

规程编写者:

审 批 者:

批准日期:

文件分发部门和/或个人

院档案室保管者:

检验科 主任:

检验科 实验室:

淋巴细胞亚群测定

(CD系列)

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)

原理

双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中,与白细胞膜上相应的抗原结合,经过溶血、洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析,从而得到淋巴细胞亚群的百分数。淋巴细胞表面抗原分布如下:T淋巴细胞:CD3+;B淋巴细胞:CD5+,CDl9+;辅助性T淋巴细胞:CD3+CD4+;抑制性T淋巴细胞:CD3+CD8+;NK细胞:CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同,流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群,利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态,空腹采血。

采集部位 静脉采血

抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血

要求 1.样本量至少1ml。

2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用。

3.样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L, 样本需要稀释,用PBS稀释;若<4.0×109/L,应分离单个核 细胞。

4.溶血样本不能用。

试剂

品牌 剂型 规格 贮存

贝克曼库尔特

成分 1:单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃

2:全血溶血试剂 液体

A:甲酸 液体 70ML 室温

B:碳酸钠等 液体 32ML 室温

C:多聚甲醛 液体 14ML 室温

3:鞘液 液体 20L 室温

4:清洗液 液体 5L 室温

5:荧光微球 液体 10ML 2-8℃

质控品 BEKAMANCOULTER产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;每天校准一次:遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

样本制备

1)按照要求,分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照

2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

3)混匀,避光,室温孵育20-30分钟

4)溶血:a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)

b. 使用COULTER Q—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

(*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体)

5)上机测样(可根据样本情况选择洗或不洗上样)

报告结果

报告百分数(和绝对值)

操作性能

精密度 批内五次重复CV<2%

灵敏度 500—1000个荧光素分子

参考值(百分数(绝对值))

CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072)

CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567)

Th/Ts 1.05-2.03

临床意义

1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标,在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染,自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。

临床常用Th/Ts比值来判断病人的免疫状况。

Th/Ts比值升高:表示免疫功能亢进:见于自身免疫性疾病,如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。

Th/Ts比值减低:表示免疫功能下降:艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。

2:NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞,所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂,疲劳综合征病人等,NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应,白介素-2治疗后;外周血NK细胞增加。

方案(Protocol

HLA-B27测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号:

200 日起实施

第1版

(共3页)

本规程每2年复审一次

复审日期:

复审人:

规程编写者:

审 批 者:

批准日期:

文件分发部门和/或个人

院档案室保管者:

检验科 主任:

检验科 实验室:

HLA-B27测定

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)

原理

双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中,与白细胞膜上相应的抗体结合,经过溶血、洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析,测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态,空腹采血。

采集部位 静脉采血

抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血

要求 1.样本量至少1ml。

2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用。

3.样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L, 样本需要稀释,用PBS稀释;若<4.0×109/L,应分离单个核 细胞。

4.溶血样本不能用。

试剂

品牌 剂型 规格 贮存

贝克曼库尔特

成分 1:单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃

2:全血溶血试剂 液体

A:甲酸 液体 70ML 室温

B:碳酸钠等 液体 32ML 室温

C:多聚甲醛 液体 14ML 室温

3:鞘液 液体 20L 室温

4:清洗液 液体 5L 室温

5:荧光微球 液体 10ML 2-8℃

质控品 BEKAMANCOULTER产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;每天校准一次:遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

样本制备

1)按照要求,分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照(IgG2a-FITC/IgG1-PE)

2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

3)混匀,避光,室温孵育20-30分钟

4)溶血:a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)

b. 使用COULTER Q—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

(*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体)

5)洗、离心、上机测样(备注: 测B27一定要至少洗一遍方可上机检测

报告结果

报告阴阳性

操作性能

精密度 批内五次重复CV<2%

灵敏度 500—1000个荧光素分子

参考值

阳性:HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在8.0以上。

临床意义

HLA复合体位于第6号染色体的短臂上,该区DNA片段长度约3000-4000KB,占人体整个基因的1/3000,HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因,与多种疾病具有相关性,尤其是强直性脊柱炎。

方案(Protocol

CD55/CD59测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号:

200 日起实施

第1版

(共3页)

本规程每2年复审一次

复审日期:

复审人:

规程编写者:

审 批 者:

批准日期:

文件分发部门和/或个人

院档案室保管者:

检验科 主任:

检验科 实验室:

CD55/CD59测定

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)

原理

双色直接免疫荧光法。近年的研究表明,红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态,空腹采血。

采集部位 静脉采血

抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血

要求 1.样本量至少1ml。

2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用。

3.溶血样本不能用。

试剂

品牌 剂型 规格 贮存

贝克曼库尔特

成分 1:单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃

2:全血溶血试剂 液体

A:甲酸 液体 70ML 室温

B:碳酸钠等 液体 32ML 室温

C:多聚甲醛 液体 14ML 室温

3:鞘液 液体 20L 室温

4:清洗液 液体 5L 室温

5:荧光微球 液体 10ML 2-8℃

质控品 BEKAMANCOULTER产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;每天校准一次:遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

样本制备:

(一)白细胞CD55/CD59检测

1.准备2支流式细胞仪专用管,分别标记。分别向二管中加入样品100ul。

2.溶血:a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)

b. 使用COULTER Q—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

(*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体)

3.离心后分别加入CD55/CD59 10ul和相应的同型对照10ul。避光20-30分钟。

4.洗涤离心

5.上机测样

(二)红细胞CD55/CD59检测

1.准备2支流式细胞仪专用管,分别标记

2.分别加入CD55/CD59 10ul和相应的同型对照10ul。

3.向二管中加入1:200稀释的样品100ul(可根据红细胞的数量调整),避光20-30分钟。

4.洗涤离心。

5.混匀、上机测样。

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度 批内五次重复CV<2%

灵敏度 500—1000个荧光素分子

参考值

CD55>97% CD59>97%

PNH的临界值:RBC CD59>95% WBC CD59>90%

PNH的诊断值:RBC CD59>91% 大部分>80%

中性粒细胞CD59>84%

临床意义

用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。

方案(Protocol

血小板膜表面抗体测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号:

200 日起实施

第1版

(共2页)

本规程每2年复审一次

复审日期:

复审人:

规程编写者:

审 批 者:

批准日期:

文件分发部门和/或个人

院档案室保管者:

检验科 主任:

检验科 实验室:

血小板膜表面抗体测定

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)

原理

直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体,加到经离心富集的血小板中,与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合,经过洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态,空腹采血。

采集部位 静脉采血

抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血

要求 1.样本量至少1ml。

2.样本应在采集后6小时内完成,冷冻的标本或已固定的标本不能用。

3.样本血小板计数应在150-450×109/L之间。若>450×109/L, 样本需要稀释,用PBS稀释;若<150×109/L,应多采集进行富集达到流式检测的细胞数。

4.溶血样本不能用。

试剂

品牌 剂型 规格 贮存

联科

成分 1:单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃

2:全血溶血试剂 液体

A:甲酸 液体 70ML 室温

B:碳酸钠等 液体 32ML 室温

C:多聚甲醛 液体 14ML 室温

3:鞘液 液体 20L 室温

4:清洗液 液体 5L 室温

5:荧光微球 液体 10ML 2-8℃

质控品 BEKAMANCOULTER产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;每天校准一次:遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

操作

富集血小板法:

1)800r/min*15min,取上清,

2)加4-5ml鞘液,2000r/min*3min,弃上清,重复一次。

3)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)

4)分别向试管中加入准备好的10u1含血小板的PBS(血小板的量约为106)(血小板若在正常范围,稀释到原量直接取10u1。)。

5)混匀,避光,室温孵育20-30分钟

6)洗或不洗,上机测样

全血法:

1)加4-5ml鞘液,1500r/min*15min,弃上清,后同上3)-6)

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度 批内五次重复CV<2%

灵敏度 500—1000个荧光素分子

参考值

IgA<2.98% IgG<3.04%

IgM<3.0% IgD<2.91%

临床意义

为免疫性血小板减少性紫癜(ITP)诊断、治疗、预后估计的重要指标,在ITP、胶原性疾病时升高。

方案(Protocol

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 楼主| 郑振寰 发表于 2007-2-10 09:48 | 显示全部楼层

红细胞抗体测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号:

200 日起实施

第1版

(共2页)

本规程每2年复审一次

复审日期:

复审人:

规程编写者:

审 批 者:

批准日期:

文件分发部门和/或个人

院档案室保管者:

检验科 主任:

检验科 实验室:

红细胞膜蛋白结构测定

(红细胞抗体)

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)

原理

直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体,加到全血中,与红细胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合,经过洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态,空腹采血。

采集部位 静脉采血

抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血

要求 1.样本量至少1ml。

2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用。

3.溶血样本不能用。

试剂

品牌 剂型 规格 贮存

联科

成分 1:单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃

2:全血溶血试剂 液体

A:甲酸 液体 70ML 室温

B:碳酸钠等 液体 32ML 室温

C:多聚甲醛 液体 14ML 室温

3:鞘液 液体 20L 室温

4:清洗液 液体 5L 室温

5:荧光微球 液体 10ML 2-8℃

质控品 BEKAMANCOULTER产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;每天校准一次:遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

操作

1)按照要求,分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)

2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血(1:200稀释后)。

3)混匀,避光,室温孵育20-30分钟

4)上机测样

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度 批内五次重复CV<2%

灵敏度 500—1000个荧光素分子

参考值

IgA<2.78% IgG<2.98%

IgM<2.52% IgD<2.88%

临床意义

自身溶血性贫血的分型诊断

方案(Protocol

粒细胞抗体测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号:

200 日起实施

第1版

(共2页)

本规程每2年复审一次

复审日期:

复审人:

规程编写者:

审 批 者:

批准日期:

文件分发部门和/或个人

院档案室保管者:

检验科 主任:

检验科 实验室:

粒细胞抗体测定

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)

原理

直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体,加到经溶血处理后的样本中,与粒系胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合,经过洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态,空腹采血。

采集部位 静脉采血

抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血

要求 1.样本量至少1ml。

2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用。

3. 样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L,样本需要稀释,用PBS稀释;若<4.0×109/L,应分离单个核细胞。

4.溶血样本不能用。

试剂

品牌 剂型 规格 贮存

联科

成分 1:单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃

2:全血溶血试剂 液体

A:甲酸 液体 70ML 室温

B:碳酸钠等 液体 32ML 室温

C:多聚甲醛 液体 14ML 室温

3:鞘液 液体 20L 室温

4:清洗液 液体 5L 室温

5:荧光微球 液体 10ML 2-8℃

质控品 BEKAMANCOULTER产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;每天校准一次:遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

操作

1) 溶血:a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)

b. 使用COULTER Q—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

(*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体)

2)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)

2)分别向试管中加入经溶血处理得样本100u1。

3)混匀,避光,室温孵育20-30分钟,洗涤离心

4)上机测样

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度 批内五次重复CV<2%

灵敏度 500—1000个荧光素分子

参考值

IgA<2.68% IgG<2.66%

IgM<2.49% IgD<3.4%

临床意义

白细胞减少症的分型诊断,大多数白细胞减少症患者抗体为阳性

方案(Protocol

白血病免疫分型测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号:

200 日起实施

第1版

(共3页)

本规程每2年复审一次

复审日期:

复审人:

规程编写者:

审 批 者:

批准日期:

文件分发部门和/或个人

院档案室保管者:

检验科 主任:

检验科 实验室:

白血病免疫分型测定

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)

原理

三色直接免疫荧光法。正常血细胞的分化成熟过程中,细胞膜、细胞浆有抗原的表达与血细胞的分化发育阶段密切相关,因此这些抗原的表达与否可作为鉴别细胞和其分化阶段的基础。利用荧光素标记的单克隆抗体对血液或骨髓进行染色,通过FCM对白血病细胞细胞膜和细胞浆抗原进行分析,由此了解所测白血病细胞的系列属性及其分化程度。三色染色在白血病免疫分型中较为常用。根据分型需要,选择相应抗原的标记抗体,一般FITC标记抗体和PE标记抗体搭配为一组,再加PC5标记抗原CD45单克隆抗体,共三种抗体加入一管

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态,腰穿采骨髓。

采集部位 腰穿采骨髓

抗凝剂 肝素抗凝

要求 1.样本量至少3ml。

2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本或已固定的标本不能用。

3.样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L, 样本需要稀释,用PBS稀释;若<4.0×109/L,应分离单个核 细胞。

4.溶血样本不能用。

试剂

品牌 剂型 规格 贮存

贝克曼库尔特

成分 1:单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃

2:全血溶血试剂 液体

A:甲酸 液体 70ML 室温

B:碳酸钠等 液体 32ML 室温

C:多聚甲醛 液体 14ML 室温

3:IntraPrep Permeabilization Reagent

成分1(固定剂) 液体 5ml 室温

成分2(透膜剂) 液体 5ml 室温

4:鞘液 液体 20L 室温

5:清洗液 液体 5L 室温

6:荧光微球 液体 10ML 2-8℃

质控品 BEKAMANCOULTER产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;每天校准一次:遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

操作-样本制备

细胞膜表面抗原

1.首先准备所需的管,并在管上标记上欲加入的抗体。

2.首先每管中加入5ul CD45-PC5抗体。

3.然后,按管上的标记,加入相应抗体各10ul(注意:必须是FITC和PE标记的抗体搭配)

4.各管中加入标本(骨髓或外周血)30~100u1(根据细胞的多少决定),振荡混匀,室温避光20~30分钟。

5.溶血:a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)

b. 使用COULTER Q—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

(*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体)

细胞浆和核抗原

1.准备所需的管,并在管上标记上欲加入的抗体,其中一管是同型对照。

2.首先每管中加入标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定),5ulCD45-PC5抗体。室温避光20分钟。

3.每管中加入固定液100ul,剧烈振荡混匀,室温避光15分钟。

4.各管中加入PBS4ml。

5.300g离心5分钟后,弃去上清液,振荡混匀。(1500r/min*5min)

6.各管中加入透膜剂100ul,轻轻混匀,室温避光5分钟。

7.加抗体,阴性对照管中加入10ul,其余各管加入相应抗体各10ul,室温避光15分钟。

8.各管中加入4mlPBS,振荡混匀。

9.300g离心5分钟后,弃去上清液。

10.各管中加入PBS500ul,振荡混匀。

11.上机测样

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度 批内五次重复CV<2%

灵敏度 500—1000个荧光素分子

参考值

CD34+<5% MPO+<5%

粒系<20% 淋系<30%

临床意义

用于血液病的诊断和分型诊断

方案(Protocol

T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号:

200 日起实施

第1版

(共3页)

本规程每2年复审一次

复审日期:

复审人:

规程编写者:

审 批 者:

批准日期:

文件分发部门和/或个人

院档案室保管者:

检验科 主任:

检验科 实验室:

T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)

原理

直接免疫荧光法。肝素钠抗凝全血在PMA,Ionomycin和Monensin存在下短期培养(辅助性T细胞通过细胞因子IFN-γ、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子,且迅速分泌到细胞外。因此,利用刺激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞,然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外,使细胞因子在细胞内滞留到一定的量),然后进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色,使用流式细胞仪对CD4+细胞内的IFN-γ和IL-4进行测定。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态,空腹采血。

采集部位 静脉采血

抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血

要求 1.样本量至少1ml。

2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用。

3.样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L, 样本需要稀释,用PBS稀释;若<4.0×109/L,应分离单个核 细胞。

4.溶血样本不能用。

试剂

淋巴细胞培养体系(自配)

成分:刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。

选白美国SIGMA公司。

单克隆抗体

CD4—PC5、IL-4-PE、IFN-γ-FITC选自美国BeckmanCoulter公司。

质控品 BEKAMANCOULTER产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;每天校准一次:遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

操作

细胞培养与染色

取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5单抗,室温避光孵育30分钟,RPMIl640洗涤一次,将细胞加入培养体系中,5%C02 37℃孵育18小时,取出后以PBS洗一次。用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。将细胞分成两管,其一为测定管加入抗人IL-4-PE和IFN-γ-FITC,另一管加入同型对照,室温避光20分钟,PBS洗涤一次,待测。

流式细胞仪测定

打开流式细胞仪及氩激光光源(488nm)预热20min,同时仪器自动初始化;用标准荧光微球校正光路和流路,然后依次检测标本,每份标本检测50000以上细胞,在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群,然后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-γ-FITC的表达。

●淋巴细胞在FS/SSC散点图中位置,即A门内细胞;

●A门内CD4阳性细胞,即B门内细胞;

●B门内TH细胞亚群分布:

1区数值---Th 1细胞 (%)

4区数值---Th 2细胞 (%)

2区数值---Th 0细胞 (%)

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度 批内五次重复CV<2%

灵敏度 500—1000个荧光素分子

正常参考值

Thl(IFN-γ):17.39±5.52% Th2(IL-4):1.50±0.44%

ThO :0.51±0.26%

临床意义

淋巴细胞均分泌多种细胞因子:Thl细胞主要分泌IL-2IL-12IFN-γ和TNF-ba等,Th2细胞主要分泌IL-4IL-5IL-6IFN-γ为Thl最特异分泌的细胞因子,IL-4Th2最特异分泌的细胞因子,所以可根据分泌的细胞因子来区分ThlTh2ThlIFN-γ+Th2IL-4+。静息状态(人的正常生理状态、即未受到任何刺激下Th0分化为ThlTh2的能力非常弱,在外周血中仅含有极少量的ThlTh2细胞,这时我们所能检测的胞内的IFN-γ和IL-4也微乎其微。当Th细胞受到外界因素,如刺激素、病原体等刺激,其中Th0即会向ThlTh2大量分化,此时我们检测到的IFN-γ和IL-4也较多。本实验的检测实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。

方案(Protocol

细胞周期检测

1.细胞制备和染色:

--收获细胞并PBS洗涤,10*4-6个,染色过程之前要经过100-300目滤网过滤,离心弃上清待用;

--使用BECKMAN COULTER DNA-PREP 试剂盒(LPR:打孔\固定\溶血; DNA STAIN: PI,RNAase):上述细胞内加入LPR 100 ul,室温避光20 MIN,再加入DNA STAIN 1000 ul,室温避光20 MIN,上机检测.

--使用酒精固定和PI: 上述细胞内加入70%预冷酒精,4 C过夜; 离心弃上清后加入PI工作液室温避光30MIN.

2.从PROTOCOL中找出DNA CONTENTS

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