红细胞抗体测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号:
200 年 月 日起实施
第1版
(共2页)
本规程每2年复审一次
复审日期: 年 月 日
复审人:
规程编写者:
审 批 者:
批准日期: 年 月 日
文件分发部门和/或个人
院档案室保管者:
检验科 主任:
检验科 实验室:
红细胞膜蛋白结构测定
(红细胞抗体)
方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特) |
原理:
直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体,加到全血中,与红细胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合,经过洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析。 |
标本采集与处理
受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态,空腹采血。
采集部位 静脉采血
抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血
要求 1.样本量至少1ml。
2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用。
3.溶血样本不能用。
|
试剂
品牌 剂型 规格 贮存
联科
成分 1:单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃
2:全血溶血试剂 液体
A:甲酸 液体 70ML 室温
B:碳酸钠等 液体 32ML 室温
C:多聚甲醛 液体 14ML 室温
3:鞘液 液体 20L 室温
4:清洗液 液体 5L 室温
5:荧光微球 液体 10ML 2-8℃
质控品 BEKAMANCOULTER产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;每天校准一次:遇特殊情况随时进行校准。 |
仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra |
操作:
1)按照要求,分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)
2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血(1:200稀释后)。
3)混匀,避光,室温孵育20-30分钟
4)上机测样 |
报告结果
报告百分数 |
操作性能
精密度 批内五次重复CV<2%
灵敏度 500—1000个荧光素分子 |
参考值
IgA<2.78% IgG<2.98%
IgM<2.52% IgD<2.88% |
临床意义
自身溶血性贫血的分型诊断 |
方案(Protocol)
|
粒细胞抗体测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号:
200 年 月 日起实施
第1版
(共2页)
本规程每2年复审一次
复审日期: 年 月 日
复审人:
规程编写者:
审 批 者:
批准日期: 年 月 日
文件分发部门和/或个人
院档案室保管者:
检验科 主任:
检验科 实验室:
粒细胞抗体测定
方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特) |
原理:
直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体,加到经溶血处理后的样本中,与粒系胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合,经过洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析 |
标本采集与处理
受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态,空腹采血。
采集部位 静脉采血
抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血
要求 1.样本量至少1ml。
2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用。
3. 样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L,样本需要稀释,用PBS稀释;若<4.0×109/L,应分离单个核细胞。
4.溶血样本不能用。
|
试剂
品牌 剂型 规格 贮存
联科
成分 1:单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃
2:全血溶血试剂 液体
A:甲酸 液体 70ML 室温
B:碳酸钠等 液体 32ML 室温
C:多聚甲醛 液体 14ML 室温
3:鞘液 液体 20L 室温
4:清洗液 液体 5L 室温
5:荧光微球 液体 10ML 2-8℃
质控品 BEKAMANCOULTER产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;每天校准一次:遇特殊情况随时进行校准。 |
仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra |
操作:
1) 溶血:a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)
b. 使用COULTER Q—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
(*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体)
2)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)
2)分别向试管中加入经溶血处理得样本100u1。
3)混匀,避光,室温孵育20-30分钟,洗涤离心
4)上机测样 |
报告结果
报告百分数 |
操作性能
精密度 批内五次重复CV<2%
灵敏度 500—1000个荧光素分子 |
参考值
IgA<2.68% IgG<2.66%
IgM<2.49% IgD<3.4% |
临床意义
白细胞减少症的分型诊断,大多数白细胞减少症患者抗体为阳性 |
方案(Protocol)
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白血病免疫分型测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号:
200 年 月 日起实施
第1版
(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期: 年 月 日
复审人:
规程编写者:
审 批 者:
批准日期: 年 月 日
文件分发部门和/或个人
院档案室保管者:
检验科 主任:
检验科 实验室:
白血病免疫分型测定
方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特) |
原理:
三色直接免疫荧光法。正常血细胞的分化成熟过程中,细胞膜、细胞浆有抗原的表达与血细胞的分化发育阶段密切相关,因此这些抗原的表达与否可作为鉴别细胞和其分化阶段的基础。利用荧光素标记的单克隆抗体对血液或骨髓进行染色,通过FCM对白血病细胞细胞膜和细胞浆抗原进行分析,由此了解所测白血病细胞的系列属性及其分化程度。三色染色在白血病免疫分型中较为常用。根据分型需要,选择相应抗原的标记抗体,一般FITC标记抗体和PE标记抗体搭配为一组,再加PC5标记抗原CD45单克隆抗体,共三种抗体加入一管 |
标本采集与处理
受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态,腰穿采骨髓。
采集部位 腰穿采骨髓
抗凝剂 肝素抗凝
要求 1.样本量至少3ml。
2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本或已固定的标本不能用。
3.样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L, 样本需要稀释,用PBS稀释;若<4.0×109/L,应分离单个核 细胞。
4.溶血样本不能用。 |
试剂
品牌 剂型 规格 贮存
贝克曼库尔特
成分 1:单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃
2:全血溶血试剂 液体
A:甲酸 液体 70ML 室温
B:碳酸钠等 液体 32ML 室温
C:多聚甲醛 液体 14ML 室温
3:IntraPrep Permeabilization Reagent
成分1(固定剂) 液体 5ml 室温
成分2(透膜剂) 液体 5ml 室温
4:鞘液 液体 20L 室温
5:清洗液 液体 5L 室温
6:荧光微球 液体 10ML 2-8℃
质控品 BEKAMANCOULTER产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;每天校准一次:遇特殊情况随时进行校准。 |
仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra |
操作-样本制备:
细胞膜表面抗原
1.首先准备所需的管,并在管上标记上欲加入的抗体。
2.首先每管中加入5ul CD45-PC5抗体。
3.然后,按管上的标记,加入相应抗体各10ul(注意:必须是FITC和PE标记的抗体搭配)
4.各管中加入标本(骨髓或外周血)30~100u1(根据细胞的多少决定),振荡混匀,室温避光20~30分钟。
5.溶血:a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)
b. 使用COULTER Q—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
(*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体)
细胞浆和核抗原
1.准备所需的管,并在管上标记上欲加入的抗体,其中一管是同型对照。
2.首先每管中加入标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定),5ulCD45-PC5抗体。室温避光20分钟。
3.每管中加入固定液100ul,剧烈振荡混匀,室温避光15分钟。
4.各管中加入PBS4ml。
5.300g离心5分钟后,弃去上清液,振荡混匀。(1500r/min*5min)
6.各管中加入透膜剂100ul,轻轻混匀,室温避光5分钟。
7.加抗体,阴性对照管中加入10ul,其余各管加入相应抗体各10ul,室温避光15分钟。
8.各管中加入4mlPBS,振荡混匀。
9.300g离心5分钟后,弃去上清液。
10.各管中加入PBS500ul,振荡混匀。
11.上机测样 |
报告结果
报告百分数 |
操作性能
精密度 批内五次重复CV<2%
灵敏度 500—1000个荧光素分子 |
参考值
CD34+<5% MPO+<5%
粒系<20% 淋系<30% |
临床意义
用于血液病的诊断和分型诊断 |
方案(Protocol)
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T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号:
200 年 月 日起实施
第1版
(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期: 年 月 日
复审人:
规程编写者:
审 批 者:
批准日期: 年 月 日
文件分发部门和/或个人
院档案室保管者:
检验科 主任:
检验科 实验室:
T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测
方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特) |
原理:
直接免疫荧光法。肝素钠抗凝全血在PMA,Ionomycin和Monensin存在下短期培养(辅助性T细胞通过细胞因子IFN-γ、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子,且迅速分泌到细胞外。因此,利用刺激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞,然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外,使细胞因子在细胞内滞留到一定的量),然后进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色,使用流式细胞仪对CD4+细胞内的IFN-γ和IL-4进行测定。 |
标本采集与处理
受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态,空腹采血。
采集部位 静脉采血
抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血
要求 1.样本量至少1ml。
2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用。
3.样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L, 样本需要稀释,用PBS稀释;若<4.0×109/L,应分离单个核 细胞。
4.溶血样本不能用。 |
试剂
淋巴细胞培养体系(自配)
成分:刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。
选白美国SIGMA公司。
单克隆抗体
CD4—PC5、IL-4-PE、IFN-γ-FITC选自美国BeckmanCoulter公司。
质控品 BEKAMANCOULTER产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;每天校准一次:遇特殊情况随时进行校准。 |
仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra |
操作:
细胞培养与染色
取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5单抗,室温避光孵育30分钟,RPMIl640洗涤一次,将细胞加入培养体系中,5%C02 37℃孵育18小时,取出后以PBS洗一次。用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。将细胞分成两管,其一为测定管加入抗人IL-4-PE和IFN-γ-FITC,另一管加入同型对照,室温避光20分钟,PBS洗涤一次,待测。
流式细胞仪测定
打开流式细胞仪及氩激光光源(488nm)预热20min,同时仪器自动初始化;用标准荧光微球校正光路和流路,然后依次检测标本,每份标本检测50000以上细胞,在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群,然后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-γ-FITC的表达。
●淋巴细胞在FS/SSC散点图中位置,即A门内细胞;
●A门内CD4阳性细胞,即B门内细胞;
●B门内TH细胞亚群分布:
1区数值---Th 1细胞 (%)
4区数值---Th 2细胞 (%)
2区数值---Th 0细胞 (%) |
报告结果
报告百分数 |
操作性能
精密度 批内五次重复CV<2%
灵敏度 500—1000个荧光素分子 |
正常参考值
Thl(IFN-γ):17.39±5.52% Th2(IL-4):1.50±0.44%
ThO :0.51±0.26% |
临床意义
淋巴细胞均分泌多种细胞因子:Thl细胞主要分泌IL-2,IL-12,IFN-γ和TNF-b/a等,Th2细胞主要分泌IL-4.IL-5.IL-6,IFN-γ为Thl最特异分泌的细胞因子,IL-4为Th2最特异分泌的细胞因子,所以可根据分泌的细胞因子来区分Thl与Th2。Thl为IFN-γ+,Th2为IL-4+。静息状态(人的正常生理状态、即未受到任何刺激下Th0分化为Thl和Th2的能力非常弱,在外周血中仅含有极少量的Thl和Th2细胞,这时我们所能检测的胞内的IFN-γ和IL-4也微乎其微。当Th细胞受到外界因素,如刺激素、病原体等刺激,其中Th0即会向Thl或Th2大量分化,此时我们检测到的IFN-γ和IL-4也较多。本实验的检测实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。 |
方案(Protocol)
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细胞周期检测
1.细胞制备和染色:
--收获细胞并PBS洗涤,10*4-6个,染色过程之前要经过100-300目滤网过滤,离心弃上清待用;
--使用BECKMAN COULTER DNA-PREP 试剂盒(LPR:打孔\固定\溶血; DNA STAIN: PI,RNAase):上述细胞内加入LPR 100 ul,室温避光20 MIN,再加入DNA STAIN 1000 ul,室温避光20 MIN,上机检测.
--使用酒精固定和PI: 上述细胞内加入70%预冷酒精,4 C过夜; 离心弃上清后加入PI工作液室温避光30MIN.
2.从PROTOCOL中找出DNA CONTENTS |