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MicroScan® MicroSTREP Plus链球菌抗微生物剂敏感性的实验操作指南

MICROSTREP plus 反应盘操作及质控手册

适用范围

该试剂盒为定量或定性测定在培养基上生长的包括肺炎链球菌在内的好氧性链球菌菌落抗微生物剂敏感性的试剂。

综述及反应原理

此抗生素的敏感性试验是肉汤培养敏感试验，是用微量的用水稀释或脱水后的肉汤做的药敏试验。

大部分的抗生素可溶于水、缓冲液或符合临床要求的低浓度的肉汤。反应盘中加入115μl已接种过标准敏感菌株的含2%-5%已溶血马血（LHB)的M-H肉汤，在无二氧化碳的温箱内孵育20-24小时，检测细菌的MIC，通过观察读出抑制细菌生长的最低抗生素的浓度。

MicroSTREP Plus Panel Type(B1027-201) 抗链球菌敏感性

抗微生物剂	简写	稀释 ug/ml
Ampicillin	Am	≤0.06-4
Amoxicillin/K Clavulanate	Aug	≤0.5/0.25-4/2
Azithromycin	Azi	0.25-2
Cefaclor	Cfr	0.5-4
Cefepime	Cpe	0.25-2
Cefotaxime	Cft	0.25-2
Ceftriaxone	Cax	0.25-2
Cefuroxime	Crm	0.25-2
Chloramphenicol	C	1-16
Clindamycin	Cd	0.06-0.5
Erythromycin	E	0.06-0.5
Gatifloxacin	Gat	0.12-2
Levofloxacin	Lvx	0.25-4
Meropenem	Mer	0.06-0.5
Penicillin	P	0.03-4
Tetracycline	Te	0.5-4
Trimethoprim	T/S	0.25/4.75-2/38
Sulfamethoxazole
Vancomycin	Va	0.12-1

注意事项：

1.仅供体外诊断用。

2.按照无菌技术及建立预防措施以防范整个操作过程中的微生物的污染，并应重视对使用过的反应盘的处理。

3.所有器材须经灭菌后，再处理。

贮存条件：

保存于2-30℃。

产品的保质期

贮藏于规定条件以外的环境，可能会使抗生素的效价降低。不要使用已经过期的试剂盒。盘中所有的孔除定位孔外，在加样前应该清澈。

标本的采集和预处理

按照微生物手册上的规定进行适当的收集、运输及接种于初始的分离平板。

操作过程

材料：

1型MicroSTREP plus板（B1027-201）。

操作及质控手册。

1型MicroSTREP plus盘工作标签。

可选材料

1. 0.5 McFarland 硫酸钡标准浊液。

2.100μl消毒吸头

3.盖板（B1010-56B）。

4.普通实验室装备。

D号接种针 60/pk(B1013-5)或240/pk(B1013-4)。

3ml 加样用盐水（B1015-12）。

25ml 3%溶血的马血的M-H肉汤。

微量稀释观察仪（Ｂ１０１０－６）。

质控菌株（参见手册质控章）。

MicroSTREP plus盘1型质控报告（B1014-347）。

RENOK复溶加样系统。

比浊仪。

离心机。

操作步骤：

A． 反应盘的准备

１．从储藏处取出反应盘，不要使用包装不完整如已撕开或破损的。

２．将袋打开取出盘，若冰箱内储存，请尽快打开包装取出反应盘。

３．如有以下情况，反应盘应弃去。

a．干燥剂已消失或破裂。

b． 反应孔已变色。

４．反应盘应平衡到室温再复溶，反应盘可以叠起并在上面用清洁的盖板盖上。所有已打开的反应盘应当天使用，否则弃去。

B． 接种准备

NCCLS认为通过定时菌落数检查接种密度（参照NCCLS M7－A5文件）。

标准浊度技术

用标准浊度技术指示敏感菌株是此反应盘唯一的使用方法。

１．使用接种针或接种环从形态上分离，大菌落上碰４、５下，链球菌在琼脂平板（如５％血平板、巧克力平板）上生长１６－２０小时的小菌落５到１０下。

２．用３毫升盐水稀释细菌，使最终的浊度达0.5 Macfarland 的硫酸钡标准浊度，这一浊度能使Microscan 的比浊仪的浊度范围在0.08±0.02。

３．盖紧后离心标本２－３秒。

４．吸0.1毫升标准的悬浊液到２５毫升LHB肉汤。盖紧后颠倒混匀８－１０次。

５．１５分钟内加入反应盘内。

C．反应盘的复溶和加样。

使用具备D型加样器的RENOK复溶和加样系统，每孔加入115±10μl的上述悬液

要确认分离的细菌是能生长的且是纯的，需将接种液划线接种在干净的血平板或巧克力平板上，孵育过夜，若两种或以上的细菌共存于平板上，应重新分离和检测

１．从工作台上打开转移管的盖子，到孵育槽内加入25毫升LHB肉汤

２．盖好盖子，轻拍在孵育槽内的四个角上的盖子，至少20秒，将其中的气泡排尽

３．打开renok复溶加样仪，加入培养液，按操作手册开始操作

注意：由于溶血马血的物理性质，第一步应尽可能平稳的加入每个孔内，进行这一步，首先加入接种液，当转移管的盖子还盖在孵育槽上的时候，按槽中心的打开按钮，将接种液加入槽中，然后在转移管里加入接种液

４．把RENOK复溶加样仪中的转移管内液体加入Microstrep plus盘内

５．检查一下加样孔的量以确定加样的准确性

D．孵育

１．为了保证热量的分布的均匀，反应盘可３－５个一叠。

２．为了防止蒸发，用干净的盖子把盘盖好，不要让酒精污染盘盖，可用肥皂和水洗净。清洗后室温干燥。

３．在无二氧化碳的孵育箱内孵育２０－２４小时，温度控制在３４－３６℃。

E．数据读取

反应盘通过间接光人工读取（如使用Ｍicroscan的微量稀释观察仪），结果可记录在反应盘工作表上。

１．经２０－２４小时的孵育，从孵箱内取出反应盘。

２．用无尘布擦去盘底的水汽和杂质。

３．仅当生长于质控孔中浑浊方可读盘，如果小孔中培养液清亮或有一点模糊，这是细菌没有完全生长的表现。

４．按照表格记录数据。

５．记录药敏结果（MIC）。

a.小孔生长变混浊，可能是小孔全部混浊，如小孔中心有浑浊，或小孔中的遍布颗粒。用间接光比浊。

b.按以下记录MIC：

１）孵育２０－２４小时，记录MIC，即小孔开始抑制细菌生长的最高浓度。

２）如果在所有的浓度的抗微生物剂中都出现细菌生长MIC应记录为大于最高浓度。

３）若各个小孔都无细菌生长,MIC应记录为小于等于最低浓度。

４）在一系列的生长孔中（如１、２、８μg/dl孔生长，４μg/dl孔不生长）有一个清晰的不生长孔，该现象称为跳孔，该孔应忽略。

５）在分离孔中有污点，提示有污染，应重做。

典型说明

控制性底物澄清，而在生长性底物中有较大点状生长。

在第1和第2列是典型的生长；

第2列显示了生长性底物中的“跳跃”生长，其应被忽略；

第3列中的单独一点与上下的控制性底物相联系说明此点已污染，应忽略；

第1列中的MIC=2μg/ml（最低浓度控制底物）。

第2列中的MIC=>16μg/ml（在所有底物中生长）。

第3列中的MIC=≤0.12μg/ml（所有底物中均无生长）。

第4列中的MIC=2μg/ml（在底物2-8中有拖曳效应）。

（典型的t/s拖曳效应）。

第5列中的MIC=≤0.12μg/ml（所有底物中都有拖曳效应，所以MIC应≤0.12μg/ml）。

（一些药物/微生物组合的典型效应）

第6列中的MIC=≤0.12μg/ml。

质控

合格的抗生素试剂需检测已知MIC范围的菌种。如果结果不符，仔细评估病人的结果，如果是已知的错误，如一些影响病人的结果和因素，有一些问题需要注意，如对个别抗生素的结果进行处理，对一些特殊病例，回顾一下过去的数据，进行一些替代试验或参考实验室的数据，直到问题解决。

MicroSTREP Plus Panel Type(B1027-201)

(肺炎链球菌（ATCC 49619）

抗微生物剂	简写	范围＊＊
Ampicillin	Am	≤0.06-0.25
Amoxicillin/K Clavulanate	Aug	≤0.5/0.25
Azithromycin	Azi	≤0.25
Cefaclor	Cfr	≤ 1-4
Cefepime	Cpe	≤0.25
Cefotaxime	Cft	≤0.25
Ceftriaxone	Cax	≤0.25
Cefuroxime	Crm	≤0.25-1
Chloramphenicol	C	≤2-8
Chloramphenicol	C	≤2-8
Clindamycin	Cd	≤0.06-0.12
Erythromycin	E	≤0.06-0.12
Gatifloxacin	Gat	≤ 0.12-0.5
Levofloxacin	Lvx	≤ 0.5-2
Meropenem	Mer	≤ 0.06-0.25
Penicillin	P	0.25-1
Tetracycline	Te	≤0.5
Trimethoprim	T/S	≤0.25/4.75-1/19
Sulfamethoxazole
Vancomycin	Va	≤ 0.12-0.5

结果

MIC结果判断敏感性是由血中或尿中细菌与该菌的MIC比较得到的。在盘中的抗生素包括那些未被证明在所有机体内安全但在临床治疗感染有效的抗微生物剂。药敏结果的报告所显示的是在体外抗微生物剂对细菌的活性（参照NCCLS M100表１和２或抗微生物剂包装说明）

链球菌解释标准

抗微生物剂	敏感	中介	抗药性
Ampicillin（氨苄西林） Β溶血性链球菌 草綠色链球菌	≤0.25 ≤0.25	0.5-4	≧8
Amoxicillin/K Clavulanate (阿莫西林/克拉维酸钾) 肺炎链球菌	≤2/1	4/2	≧8/4
Azithromycin(阿齐红霉素)	≤0.5	1	≧2
Cefaclor(头孢克罗) 肺炎链球菌	≤1	2	≧4
Cefepime(头孢吡肟) 肺炎链球菌 Β溶血性链球菌 草綠色链球菌	≤1 ≤0.5 ≤1	2 - 2	≧4 - ≧4
Cefotaxime(头孢噻肟) 肺炎链球菌(脑膜炎) 肺炎链球菌(非脑膜炎) Β溶血性链球菌 草綠色链球菌	≤0.5 ≤1 ≤0.5 ≤1	1 2 2	≧2 ≧4 ≧4
Ceftriaxone(头孢曲松) 肺炎链球菌(脑膜炎) 肺炎链球菌(非脑膜炎) Β溶血性链球菌 草綠色链球菌	≤0.5 ≤1 ≤0.5 ≤1	1 2 2	≧2 ≧4 ≧4
Cefuroxime(口服头孢呋辛) 肺炎链球菌	≤1	2	≧4
Cefuroxime(非口服头孢呋辛) 肺炎链球菌	≤0.5	1	≧2
Chloramphenicol（氯霉素） 肺炎链球菌 其它链球菌	≤4 ≤4	8	≧8 ≧16
Clindamycin(克林霉素) 其它链球菌	≤0.25	0.5	≧1
Erythromycin(红霉素)	≤0.25	0.5	≧1
Gatifloxacin 肺炎链球菌 Β溶血性链球菌	≤1 ≤1	2 2	≧4 ≧4
Levofloxacin(左旋氟沙星)	≤2	4	≧6
Meropenem 肺炎链球菌 草綠色链球菌	≤0.25 ≤0.5	0.5	≧1
Penicillin 肺炎链球菌 Β溶血性链球菌 草綠色链球菌	≤0.06 ≤0.12 ≤0.12	0.12-1 0.25-2	≧2 ≧4
Tetracycline(四环素)	≤2	4	≧8
Trimethoprim Sulfamethoxazole 肺炎链球菌	≤0.5/9.5	1/19-2/38	≧4/76
Vancomycin	≤1

操作限制

１．一些苛性菌需其它基质，可能在Microstrep plus盘内不能生长，如果在生长孔内没细菌生长，此盘数据是无效的。

２．Microstrep 盘仅检测链球菌（包括肺炎链球菌）。

３．在一些孔内出现轻度浑浊，可能是一些抗微生物剂未充分溶解所致，这不能算做生长．

４． MIC数据的判断需经训练具备专业判断细菌敏感各项知识的临床人员。

５． 此盘不能在二氧化碳培养箱内培养。

６． 几种混合的细菌产生的数据是无效的。

７． 此盘具备检测抗安比西林、Gatifloxacin、利复星的链球菌和未知的缺乏充足比较试验的链球菌。

８． 当使用Microscan MHB溶血马血应按规定完成。用其它厂家的马血可能引起变异的结果。

９． 在加样准备和加样间的时间延长超过１５分钟，可能对链球菌的生长产生的负效应。

１０． 不要报告肺炎链球菌的克林霉素的敏感性。

期望值

Microstrep盘被外部实验室评估通过一些新鲜或保存的菌株。耐药菌株可从盘内获得。结果判断是对其形态等的描述的综合。细菌敏感率通过细菌的形态和菌种的试验各有分别。

完成性

Microstrep plus盘完成性在各个临床试验室建立。

抗生素试剂在此盘中测试使用标准浊度技术且需人工判读，需参照NCCLS所规定的稀释盘MIC量在此盘浓度±１管对倍稀释方被认可。应无条件接受Microstrep盘和NCCLS参考解释的数据。

当一个实验成为一个经典实验，会出现有大量的机体的MIC的一大串围绕判读点的解释错误的数据。高度一致的经典实验应证明在判读点的所有可能出现的波动应在一个稀释度内。

链球菌临床实验报告与参考方法百分比符合率

抗微生物剂	必要符合率 %	絕對符合率 %
Ampicillin	299/320(93.4)	265/267(99.3)
Amoxicillin/K Clavulanate	293/296(99.0)	288/296(97.3)
Azithromycin	558/562(99.3)	552/562(98.2)
Cefaclor	291/296(98.3)	282/296(95.3)
Cefepime	542/563(96.3)	544/563(96.6)
Cefotaxime	549/563(97.5)	533/563(94.7)
Ceftriaxone	549/563(97.5)	533/563(94.7)
Cefuroxime	295/296(99.7)	281/296(94.9)
Chloramphenicol	562/562(100)	560/562(99.6)
Clindamycin	307/319(96.2)	317/319(99.4)
Erythromycin	531/562(94.5)	556/562(98.9)
Gatifloxacin	475/475(100)	475/475(100)
Levofloxacin	559/562(99.5)	562/562(100)
Meropenem	380/383(99.2)	368/383(96.1)
Penicillin	521/563(92.5)	543/563(96.4)
Tetracycline	523/563(92.9)	559/563(99.3)
Trimethoprim	296/296(100)	290/296(98.0)
Sulfamethoxazole
Vancomycin	559/562(99.5)	562/562(100)

参考文献

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抗耐药性研究的扩展

我们生活在一个细菌对抗生素抵抗力比预期的要强的时代...由于抵抗力的增加，就需要我们临床微生物实验室提供更准确的实验结果来配合临床有效地诊治细菌感染。

肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌所产生的超广谱β-内酰胺酶（ESBL）可能会对临床上的青霉素、头孢菌素和氨曲南产生耐药性，尽管体内对这些抗微生物剂较敏感。

基于此，NCCLS准则提供了筛选和确诊这些菌株的方法。据报道，确诊为产生ESBL的菌株对青霉素、头孢菌素和？都有抵抗力。

面临挑战

ESBL微量筛查试剂盒能准确地检测出大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌所产生的ESBL。

按照NCCLS标准推荐的是头孢氨噻、头孢他啶单独应用和其分别与克拉维酸联合应用。由于细菌产生ESBL，经三次对倍稀释显示，加入克拉维酸联合应用的最小抑菌浓度（MIC）比分别单独应用两种抗微生物剂要低。

*（表2）提供了泰能和美罗培南（碳青霉烯类）的敏感性结果，被推荐为临床对ESBL释放细菌所致疾病的治疗方法。

*（表2）还为临床提供了另外一些不能释放ESBL细菌的治疗选择。

*通过明确的稀释终点以证明其准确性。

*具有97.3%的敏感度和90.1%的精确度。