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MicroScan® 快速厌氧菌鉴定板操作手册

快速厌氧菌鉴定板操作手册

预期应用

MICROSCAN快速厌氧菌鉴定板是为从临床人体样本中分离出的厌氧菌进行快速鉴定而设计的。

摘要和原则

用改良的传统和染色实验进行厌氧菌的鉴定。实验中的生物体MCFARLAND3混悬液可从高压消毒的去离子水中得到。MICROSCAN快速厌氧菌鉴定板含24种脱水底物，再水化后接种细菌混悬液并在35-37℃有氧环境中培养4小时。因为MICROSCAN快速厌氧菌鉴定板可测定作用的酶，鉴定板中生物体的生长则不是必需的。培养后，pH变化，某些底物的利用或其他生化反应可解释鉴定结果。

预防

1．MICROSCAN快速厌氧菌鉴定板和试剂只用于体外诊断。

2．不要让肽酶试剂、艾利希氏试剂、二甲苯或任何鉴定底物接触眼睛、皮肤或衣物。

3．在整个过程中注意无菌技术并预防微生物危害，特别注意接种后的鉴定板是否含有潜在的致病微生物。

4．所有材料在丢弃前必须先进行高压消毒。

储存

在2-8℃储存鉴定板和试剂。

样品的采集和准备

合适的样品，没有一般厌氧菌类，应根据V.P.I.、厌氧菌实验室手册、WADSWORTH厌氧菌手册、C.D.C.的细菌学实验室方法和临床微生物手册所介绍的程序，在原始隔离的媒质中采集、运输、放置。

注意：含抗生素媒质如LKV（卡那霉素/万古霉素），或类细菌胆汁七叶树甘糖（BBE）琼脂，苯乙基酒精（PEA）等上的菌落不能应用于鉴定板接种的准备。

提供的材料

快速鉴定板

20张工作表单

操作手册

需要但未提供的材料

矿物油

盖盘

肽酶试剂

0.5%N-N-二甲基- -萘胺

0.8%磺胺酸

艾利希氏试剂

二甲苯

50 L带无菌吸头的吸管

过氧化氢

接种液3ML高压消毒的去离子水

无菌棉签或无菌接种环

木制涂药棒

3，4和5MCFARLAND硫酸钡标准混悬液

搅拌器

培养器，不含CO₂（35℃）

快速厌氧生物型密码本

微生物质量控制：

产气荚膜杆菌

sordellii

fragilis

magnus

操作过程

A准备鉴定板

1．从冰箱中取出鉴定板。如果干燥剂缺失或破损，或包装的完整性被破坏（已开启，被刺破或撕裂）鉴定板就不能使用了。

2．打开包装取出鉴定板，立即从铂纸包中取出鉴定板。再水化之前让鉴定板温度与室温一致。鉴定板可以堆放在干净的盖盘下。

B准备接种

1．给鉴定板接种之前先要观察测试微生物的耐氧性、纯度、革兰氏染色反应和菌落的形态。

2．用无菌棉签或接种环，从经24-48小时培养的无选择性媒质中取足够的菌落放入含3ML培养液（经高压消毒的去离子化水）的试管，形成相当于至少是MCFARLAND 3标准液但小于等于MCFARLANGD 5标准液的混悬液。如果需要摇匀以使其乳化。一旦混悬液准备好，就应在15分钟内接种鉴定板。

C接种鉴定板

1．将鉴定板从铂纸包中取出并在标签上注明样本号。

2．加50 L细菌混悬液到每个含底物的小孔以及两个控制小孔。在此不推荐用巴斯德吸管来接种。

D生化油物覆盖

滴1-2滴矿物油覆盖尿素及吲哚。

E培养

1．将鉴定板3-5成组堆放与盖盘下以避免水分蒸发。

2．将接种后的鉴定板放入35-37℃的无二氧化碳培养箱中培养4小时。

F解读鉴定板

1．至少在解读鉴定板之前30分钟将肽酶试剂从冰箱中取出。在4℃时肽酶会沉淀，但在室温下它会重新溶解。不要将肽酶试剂暴露在升高的温度中以促使其结晶沉淀物的溶解，因为高温会使其变质。

2．鉴定板应在白色背景下用间接光线解读。

3．在培养4小时后记录所有底物的结果，不要加任何其他试剂：BGAL，……URE和TRE。比较硝基苯基孔和BGAL……AFU，MNP。任何黄色应被记为阳性。

（非选择性媒质包括TSA，布鲁氏菌，心脑灌输或哥伦比亚琼脂，都含5%羊血。）

4．加一滴肽酶到LEU，……TRY和BNAC小孔。

A）至少让颜色变化30分钟然后记录结果。在加入试剂后不要等3分钟后才记录结果。存在任何粉色或红色应解释为阳性。这些小孔的颜色会随时间变暗所以阴性的黄色会变成比较暗的橘黄色，但这仍应解释为阴性反应。只有出现粉色或红色反应才能被记录为阳性。一些小孔和控制小孔比较会是较暗的橘色，但仍应记为阴性。

B）在 –萘胺控制小孔加入肽酶后，小孔的颜色应是黄色的。如果有任何粉色或红色存在，则肽酶试剂就应丢弃，以避免错误的阳性结果。

5．两个控制小孔辅助解释反应。

A）BNAC= -萘胺控制。加入肽酶试剂后此小孔应为黄色或橘色。

B）NPC=硝苯基控制。此小孔应为无色的。

6．加一滴二甲苯到吲哚小孔。用木制药签搅动此小孔内容物，在2-3分钟后解读。

7．各加一滴磺胺酸先到N-N二甲基- -萘胺后到硝酸盐小孔，2-3分钟后解读。

8．加2-3滴3%过氧化氢到BGAL小孔，等2-5分钟记录结果。有泡沫形成表示为阳性反应。

质量控制

MICROSCAN快速厌氧菌鉴定媒质的可接受性应通过用已知反应来检测微生物来查明。通过用50 L高压消毒去离子水来再水化鉴定板可获得阴性结果。所有底物在表格中都应是阴性的。培养的纯度应由用于接种合适琼脂媒质的混悬液的次培养测出。如果检测出混合培养那实验结果是有缺陷的。（见表2）

结果

A生化解释表

B鉴定反应的原则

硝苯基底物（）：邻位或旁位硝苯基底物是无色的。如果存在合适的酶，底物就裂解释放游离的邻位或旁位硝苯基，显示黄色。

氨基酸 –萘氨基底物（）：当底物被合适的酶水解（通常是氨基酸芳基酰胺酶）， -萘氨基被释放。加入P-二甲基胺基*（肽酶试剂中）可检测出 -萘氨，形成粉色到紫色的复合物。

注意；裂解氨基酸萘氨基的酶是氨基酸芳基酰胺酶。氨基肽酶一词通常是芳基酰胺酶同义词但事实上代表了有不同特征的酶。（氨基肽酶从肽链上裂解N-终端氨基酸）。芳基酰胺酶和氨基肽酶可以水解同一氨基酸 –萘氨基底物。这样，鉴定板就不用测定不同和独特的酶了。一个芳基酰胺酶可以水解几个氨基酸-萘氨基。

吲哚磷酸盐：吲哚磷酸盐被磷酸酶裂解释放出吲哚基。吲哚基与氧结合形成靛青，它是不溶的蓝色或蓝绿色沉淀物。

海藻糖：海藻糖的利用导致了随后的PH值下降形成酸，由酚红指示剂从桔色变为黄色检测出。

尿素：尿素被尿素酶分裂为氨和碳水化合物。氨（碳酸铵形式）使pH上升，由酚红指示剂从黄色变为粉色检测出。

吲哚：色氨酸的新陈代谢导致吲哚的形成。二甲苯从培养基中吸取吲哚并将其浓缩。艾利希氏试剂与吲哚反应形成红色。

硝酸盐：生物体降解硝酸盐到亚硝酸盐的能力可通过加入磺氨酸和N-N二甲基- -萘胺检测出，亚硝酸盐的存在会造成红色。

过氧化氢酶使过氧化氢裂解为水和氧气，它会释放泡沫。

生物体鉴定

MICROSCAN快速厌氧菌生物型密码本用于鉴定未知的实验微生物。这本密码本从MICROSCAN本身的实验（包括鉴定板实验）数据库中形成。

MICROSCAN快速厌氧菌密码本基于24个实验（包括快速厌氧菌鉴定板实验）的电脑分析。实验结果被转变为8个字节的生物型数字，密码本列出了鉴定种类和积累的鉴定相关性。所有可能的鉴定以可能性的降序排列，最高累积为99.9%。当生物型数字在密码本上找不到时首先考虑过程错误。通常使生物型数字错误加入或是错误记录反应如果生物型数字是正确的，应查一下混合培养的可能且微生物应重新测试，特别强调用充足的细胞混悬液。如果重新实验的结果与前相同，致电MICROSCAN生物型电脑或技术服务部（美国或加拿大——1（800）677-7226。

限制

1．实验微生物应在非选择性媒质如 TSA……哥伦比亚琼脂，都含5%羊血。选择性媒质含抗生素如（卡那霉素/万古霉素），类细菌胆汁七叶树甘糖（BBE）琼脂，苯乙基酒精（PEA）不应使用。

2．微生物混悬液的浑浊度应相当于至少MCFARLAND 3标准液但不大于MCFARLAND 5标准液。如果实验的微生物混悬液浑浊度小于MCFARLAND 3标准液，反应会减弱或出现错误的阴性反应结果。

3．快速厌氧菌鉴定板只用于坚定厌氧菌。实验之前每个微生物应先检测耐氧性，纯度革兰氏染色反应和菌落形态。当要求多于一种鉴定以列出详细的生物型数字时，正确的鉴定结果需要增加实验。

4．快速厌氧菌鉴定板应只用于那些在生物型密码本中列出的微生物。

5．MICROSCAN快速厌氧菌鉴定板还未被FDA通过用于MICROSCAN仪器系统，因此鉴定板只能人工解读。

临床实验用厌氧微生物代替现在临床不同的分离株，快速厌氧菌鉴定板对分离菌落的正确鉴定达92%。

表1

底物

P-硝苯基- -D-吡喃(型)半乳糖

P-硝苯基- -D-吡喃(型)半乳糖

二-P-硝苯基-磷酸盐

P-硝苯基-N-乙酰基- -D-葡萄糖胺

P-硝苯基- -D-吡喃(型)葡萄糖

O-硝苯基- -D-吡喃(型)葡萄糖

P-硝苯基-磷酸盐

P-硝苯基- -L-FUCOPYRANOSIDE

P-硝苯基- -D-吡喃甘露糖

L-亮氨酸- -萘胺

DL-蛋氨酸- -萘胺

L-丝氨酸- -萘胺（碱）

L-丝氨酸- -萘胺（酸）

双甘氨肽- -萘胺

L-脯氨酸- -萘胺

L-精氨酸- -萘胺

L-吡咯烷酮- -萘胺

L-色氨酸- -萘胺

3-吲哚磷酸盐

海藻糖

吲哚

硝酸盐

表2 质量控制表

产气荚膜杆菌 SORDELLII FRAGLLIS MAGNUS

为了得到最合适的结果，产气荚膜杆菌必须培养24小时

美国典型培养协会

美国典型培养协会控制微生物推荐的每个反应的结果列在质量控制表中

表3

生化解释表

底物 试剂 阳性 阴性

与硝苯基比较 任何黄色 澄清

控制小孔

加一滴肽酶试剂让颜色反应进行至少30秒但不超过3分钟 任何粉色到洋红 黄色到橘色

-萘胺控制小孔应是黄色的

蓝色/蓝色沉淀 澄清

黄色 橘色/红色

粉红到红色 黄色到橘色

加一滴二甲苯摇匀，再加一滴艾利希氏试剂2-3分钟后解读 粉色 黄色/澄清

各加一滴0.8%磺胺酸和0.5%N，N-二甲基- -萘胺，2-3分钟后解读 红色 澄清到淡粉红

加2-3滴3%过氧化氢到BGAL，等2-3分钟形成泡沫 大泡沫 无泡沫（或很少的小泡/所有小孔差不多）