[转发]DADE BEHRING 干性革兰阳性菌鉴定ID 2型实验操作指南

MicroScan®干性革兰阳性菌鉴定ID 2型实验操作指南

注意：阴影表明操作步骤的变化

应用范围

用于MicroScan干性革兰阳性菌鉴定,ID 2型板。MicroScan Pos板应用于：测定鉴别快速生长的需氧和兼性需氧的革兰阳性球菌，一些需特殊营养的需氧革兰阳性球菌以及单核细胞增多性李司特氏菌属的种类水平。另请参阅用于需特殊营养链球菌的操作限制部分。

简要原则

改良的传统和染色实验用于鉴别微球菌科、链球菌科及单核细胞增多性李司特氏菌属。这都依据检测pH值的变化、底物的利用情况和在有抗微生物剂的环境中于35℃下温育16-44小时后的生长情况而定。

*β-内酰胺酶产物可由碘定量法检测出。

注意事项

1． 只用于体外诊断中。

2． 无菌操作和预防微生物的危害要贯穿整个过程。

3． 所有材料必须先用高压锅消毒后再处理。

4． 所有测定报告必须与病人病史,临床显示,及其它一起做解释。

储存

MicroScan 干板应在2-30℃的环境中储存。

物品变质

如果暴露在以上推荐储存环境之外会导致抗微生物剂丧失抗菌力和生化污染，使用不要超出产品有效期。

样品的采集和准备

合适的样品应根据临床微生物学指南的介绍采集,运输并放置在原始分离媒介中。

操作

材料的提供

革兰阳性菌鉴定,ID 2型板(B1027-121)。

需要但未提供的材料

0.5McFarland硫酸钡标准混悬液。

0.5%N,N-α-1 甲基萘基胺30ml(B1010-45A)或250ml(B1015-45)。

0.8%磺胺酸,对氨基苯磺酸30ml(B1010-44A)或250ml(b1015-44)。

10 μ l或100μl带一次性无菌吸头的吸管或10 μl校准环。

5%α-萘酚10ml(B1010-42) 或30ml(B1010-42A)。

40%氢氧化钾30ml(B1010-43A) 或250 ml(B1015-43)。

盖盘(B1010-56B)

一般的实验室仪器

一套D型接种器(B1013-4)

接种液3ml(B1015-2)

碘试剂30ml(B1010-94)

操作报告表格,最小抑制浓度(B1014-92)或转效点(B1014-47)

微稀释观察器(B1010-6)

Microscan革兰阳性生物型密码本(B1014-46B)

矿油60ml(B1010-6)

矿油250ml——只适用于WalkAway系统的仪器,其仪器也具有升级的自动化油叠特征

人工测试板工作窗体(用来记录操作结果)

提升的接种系统(B1026-10D)

生物体质量控制(请参阅本手册质量控制的分类数字)

质量控制报告表格

革兰阳性菌鉴定,ID 2型板(B1014-195)

青霉素溶液(3万单位/ml)(B1010-93)

肽酶试剂30ml(B1012-30B)或250ml(B1015-30)

Pos接种培养基0.5ml(B1013-12A)

Todd-Hewitt培养基4-5ml

试剂滴管成套工具(B1013-12A)

RENOK再水化器/接种器(B1018-14)或相应的计量器

搅拌器

WalkAway系统密码标签纸条(B1011-16)

WalkAway盖盘(B1018-18)

Pos ID Type 2 鉴定底物 简写 鉴定底物 简写

龙胆紫 CV 乳糖 LAC 球菌筛网 MS 海藻糖 TRE 硝酸盐 NIT MANNOSE MNS 新生霉素 NOV 6.5%氯化钠 NACL 糖苷酶 PGR 山梨糖 SOR 吲哚酚磷酸酶 IDX 阿拉伯糖 ARA 沃-普反应 VP 核糖 RBS 双乙奎宁 OPT 菊粉 INU 磷酸酶 PHO 棉子糖 RAF 胆汁七叶甙 BE 枯草杆菌肽 ²BAC 吡咯烷-β-萘胺 PYR 丙酮酸盐 PRV 精氨酸 ARG β-内酰胺酶 BL 糖苷酶 PGT 尿素 URE 甘露糖 MAN

-

步骤概要

A 测试板的准备

1. 从储存库中取出测试板,如果包装不完整一旦出现以下情况测试板就不能使用:

a..(没封口、被刺破或被撕裂)就不能应用。

b 干燥剂缺失或损坏。

c 测试板被污染(例如:有磷酸酶、不同的抗微生物剂)。

2. 打开包装袋取出测试板,如果是储存在冰箱里的,立即从箔袋中取出测试板。于再水化之前应让测试板与室温相适应,测试板可堆放于盖盘下,所有打开的测试板应在当天使用，否则就应丢弃。

B 接种物的准备

(注意:参阅操作指南上的限制)

NCCLS推荐定期通过计算生物群体数来检查接种体密度.。请参阅NCCLS M7-A4文件。期望值应在3-7×10⁵CFU/ml。

1. 标准混悬技术——初步的接种方法

标准混悬技术用于需氧革兰阳性球菌的直接接种和检测耐甲氧苯青霉素的葡萄球菌。

a. 用无菌的木制涂药棒或细菌接种环从18-24小时无抑制的琼脂平板表面取得菌落，它们必须是形态相近且完全孤立的4-5个大的或5-10个小的成簇。

b. 使之在3ml接种液(高压灭菌后除去离子的水)中乳化,最后的混悬液应该相当于0.5McFarland硫酸钡标准混悬液,盖紧盖子。

c. 搅拌混悬液2-3秒

d. 吸0.1 ml(100μl)标准混悬剂放入25ml含PLURONIC的接种液,盖紧盖子,翻转8-10次以让其混合。

**PLURONIC是表面活性剂,为BASF公司（Parsippany,NJ,USA）的注册商标。

***3M,St,Paul,MN,USA

2.提升系统

提升系统可用于生长更快的革兰阳性球菌,为合理运用提升系统请参阅提升接种操作指南。

注意:谨慎使用,生物体不符合型号所致的接种失败会造成鉴定结果的误差,此外,葡萄球菌的菌落数在提升的方法下会激增甚至超过NCCLS的预期范围。

3.log相技术

log相技术,当细菌混悬液加入与之相当的0.5McFarland标准混悬液之后稀释到理想浓度，此技术适用于相对生长较慢的细菌及当天较迟到达的样品

a. 用无菌的木制涂药棒或细菌接种环从18-24小时无抑制的琼脂平板表面取得菌落，它们必须是形态相近且完全孤立的4-5个大的或5-10个小的成簇。

b.使之在4-5mlTodd-Hewitt培养基中被乳化并在35℃下培养2-4小时,这被称为 log 相细菌混悬液.。

c.在培养之后,接种到测试板之前重新搅拌此混悬液2-3分钟.

d.用Todd-Hewitt 培养基,稀释log相混悬液到相当于0.5McFarland硫酸钡标准混悬液。

e. 吸0.1ml(100μl)标准混悬液至25ml含PLURONIC的接种液,盖紧盖子翻转8-10次以使其混合。

C 测试板的再水化/接种

测试板的再水化和接种是用RENOK系统的D型接种器(B1013-4)来进行的，使用时请参阅RENOK操作手册,如果使用另外的系统,用115+10μl 接种液(PLURONIC)再水化，最后的底物浓度应在3-7×10⁵CFU/ml。 为了确定生物的生存能力和纯度,无污染的培养板由接种物完全暴露在血琼脂平板培养一夜后准备而成。如果无污染的培养板上出现两种或两种以上菌落类,就要重新分离菌落并再次试验。

D 生化覆盖

1．用一个滴瓶，滴至少三滴矿油覆盖精氨酸和尿素底物(这些底物是衬在测试板里的)。

2．矿油必须完全覆盖底物的中层，但不能盖满底物。

注意：WalkAway 系统/仪器具有升级的自动化油叠特征自动，自动为相应标本加油。

E 培养

1保证培养期间热量均衡分布，将3-5个测试板堆放在一起。

2在每组测试板上放上干净的盖盘以防水分蒸发，盖盘可重复使用，但不要用酒精来消毒，可以用水和肥皂清洗，仔细冲洗然后风干。

3将测试板放入35℃无二氧化碳的培养箱中培养16-20小时。

F解读测试板

测试板可用MicroScan的微稀释观察器人工分析，然后将结果记录在测试板操作窗体或MicrpScan仪器记录表上（touchScan-SR,autoScan-4和WalkAway 系统）。使用MicroScan仪器来分析测试板请参阅相应的操作指南。

1．培养16-20小时后，将测试板从培养箱中取出。

2．用纱布擦去测试板底部的结合物和碎片。

3．只有在控制性底物澄清，生长性底物变浑浊时可解读测试板，如果控制性底物变浑浊或生长性底物中无细菌生长则不要解读此抗微生物剂。细菌在底物中的生长表现为变浑浊，会在底物中形成白色絮状物，标本中央出现白色点状物，或在标本中出现颗粒样物质生长。如果底物中有少量的白色或培养基澄清表明生长不足。

4．如果人工分析这些结果，就记录在合适的工作窗体上。

5．分析鉴定底物

a．在白色底版上分析除CV，MS，NOV，OPT，NACC和BAC（它们应在黑色底版上分析）的所有鉴定底物。

b．IDX,PHO,BL的结果在培养16-20小时后的记录。

c． PGT阴性和碳水化合物小于三个阳性的测试板在最后分析鉴定前应重新培养。

d．只有碳水化合物三个阳性或PGT反应阳性的测试板应在16-20小时内加试剂，如无须考虑其阳性试验数，就在40-44小时内加入试剂。

e．在加试剂之前记录下所有的阳性反应。

f．加试剂步骤如下

1）只对葡萄球菌进行β–内酰胺酶试验，加1滴青霉素溶液（30000单位/ml）至BL底物，用涂药棒混合，在35℃下培养30分钟，之后加入1滴碘试剂，再用涂药棒混合，在5分钟内读出结果。

2）加1滴40%氢氧化钾和1滴5% α-萘酚至VP底物中，至少等20分钟，让VP反应进行后读取。

3）各加一滴0.8%磺胺酸和0.5%N-N–甲基萘基胺至NIT标本中，至少等5分钟，让NIT反应进行后读取。

4）加2滴肽酶试剂至PYR标本中等2分钟再解读。

g．需生化解释请参阅结果部分。

质量控制

用已知反应及最小抑菌浓度范围进行微生物测试以此来确认鉴定媒质和抗微生物剂的可接受性，美国典型培养物集合的微生物结果列表如下：

2.干性革兰阳性菌鉴定底物质量控制表

金黄色葡萄球菌 粪肠球菌 牛链球菌 M.Iuteus³

ATCC¹ 29213 ATCC 29212 ATCC 49147 ATCC 49732

B1010-23B B1010-22A B1010-28E B1010-28G

龙胆紫 CV - + N/A N/A

微球菌筛网MS + + + -

硝酸盐NIT + - - N/A

新生霉素² NOV - N/A - N/A

糖苷酶PGR - - - N/A

吲哚酚磷酸酶IDX + N/A N/A -

沃-普反应VP + + + -

双乙奎宁² OPT + + + N/A

磷酸酶 PHO + N/A - N/A

胆汁七叶甙BE - + + N/A

吡咯烷-β-萘胺PYR N/A + - N/A

精氨酸 ARG + + - N/A

糖苷酶PGT + + + -

尿素URE + - - N/A

甘露糖MAN + + + -

乳糖LAC + N/A + -

海藻糖TRE N/A + + -

MNS N/A + + -

6.5%氯化钠NACL N/A + - N/A

山梨糖SOR N/A + - N/A

阿拉伯糖²ARA N/A - - N/A

核糖RBS N/A + - N/A

菊粉INU N/A - + N/A

棉子糖RAF N/A - + N/A

枯草杆菌肽²BAC N/A + + N/A

丙酮酸盐PRV N/A + - N/A

β-内酰胺酶BL + N/A N/A -

1. 美国典型培养物集合，Manassas，VA USA

2. 其它细菌的阳性或阴性生化反应请参阅附加试验表。

3. M.Iuteus ATCC 49732 经MicroScan仪器辨认16-18小时后，在质量控制报告MIC部分显示为N/R。这不影响在任何辨认时间的底物鉴定质量控制结果。

4. 不适用于数据管理系统V23.05以下版本。

N/A=不适用

注意：质量控制表中的微生物是为所有鉴定底物提供阳性或阴性反应而选出的。因此，这些微生物的鉴定结果随质量控制表指定的底物改变而改变。产物结果的可接受性是非确定性的，应通过试验结果的比较来决定。

另外检测表

微生物 底物 期望报告

S.saprophyticus(腐生葡萄球菌)ATCC 49907 新生霉素NOV +

S.xylosus (木糖葡萄球菌)ATCC49148 糖苷酶PGR +

S.pneumoniae(肺炎链球菌)ATCC 49136 双乙奎宁² OPT -

- 枯草杆菌肽²BAC -

E.avium (鸟肠球菌)ATCC 49464 - 阿拉伯糖²ARA +

结果

A. 生化结果

1. 生化分析

底物 试剂 阳性 阴性

龙胆紫CV

微球菌筛网MS

新生霉素NOV 生长 不生长

双乙奎宁OPT

5%氯化钠NACL

枯草杆菌肽BAC

硝酸盐NIT 加入1滴对氨基苯磺酸和1滴 黄色 澄清（无色）

0.5%N，N-二甲基-α-萘胺， 可能为极淡的粉红色

等5分钟以使反应进行。

PGR 任何深浅的黄色出现即为 黄色 澄清（无色）

磷酸酶PHO 阳性。以新生霉素作为阴性

PGT 对照

吲哚酚IDX 任何深浅的蓝色 澄清（无色）或

磷酸酶 VP 可能为沈淀 白色沉淀

沃-普VP 加入1滴40%KOH和 由粉红变为红色 由澄清（无色）变

反应 1滴5% α-萘酚，等20分钟 为棕色。可能为混

以使反应进行。 浊的或极淡粉红色

胆汁七叶甙 BE 由深棕色变为黑色 由澄清（无色）变为淡棕色

底物 试剂 阳性 阴性

吡咯烷-PYR 加入2滴肽酶试剂。等反应 红色或由橙色 由黄色变为橙色

β-萘胺 发生需2分钟 变为红色 或红色

精氨酸ARG 粉红或由橙变红 由黄变橙

.尿素URE 粉红 由黄变橙

棉子糖RAF

乳糖LAC

海藻糖TRE

MNS

山梨糖SOR 出现任何橙色即 黄色 橙色或红色

阿拉伯糖ARA 为阴性

核糖RBS

菊粉INU

甘露糖MAN

丙酮酸盐PRV

β-内酰 BL 加入1滴青霉素溶液。培养 无色 黑色

胺酶 30分钟。加入1滴碘试剂。

5分钟后记录

溶血反应 HEM β αor γ

LOC 只用于4型自动扫描和WalkAway系统模板的识别

2. 鉴定反应的原理

龙胆紫（CV）：利用能够在低浓度龙胆紫中生长以区分链球菌（阳性）和葡萄球菌（阴性）。

微球菌筛查（MS）：能够在低浓度枯草杆菌肽（0.05μg/ml）中生长以区分葡萄球菌（阳性）和微球菌（阴性）。

硝酸盐（NIT）：硝酸盐还原为亚硝酸盐的过程可通过加入0.8%Sulfanilic Acid和0.5%N，N二甲基-α-萘酚后形成一种红色物质而检测出。链球菌表现为阴性而大多数葡萄球菌为阳性。

新生霉素（NOV）：对低浓度（1.6μg/ml）的新生霉素耐受是一些葡萄球菌的特点。

糖苷酶（PGR，PGT）：有的微生物能够产生一种特殊的糖苷酶，它能分解磷酸-硝基苯碳水复合物释放颜色为黄色的磷酸-硝基酚。

吲哚酚磷酸酶（IDX）：在吲哚酚磷酸酶的作用下吲哚酚磷酸盐水解，产生一种不溶解的蓝色化合物。大多数凝固酶和脱氧核糖核酸酶阳性的葡萄球菌IDX阳性。

沃-普反应（VP）：由葡萄糖产生的acetylmenthylcarbinol与40%KOH和5%α-萘酚发生反应形成红色物质。

双乙奎宁（OPT）：对双乙奎宁敏感是肺炎链球菌的特性。其它链球菌和葡萄球菌不会受双乙奎宁的抑制。

磷酸酶（PHO）：碱性磷酸酶分解磷酸硝基苯成为无机磷酸盐和磷酸硝基苯酚结果显示为黄色。

胆汁七叶甙（BE）： 一些微生物能够在40%的胆汁中生长并水解七叶甙，其水解产物七叶甙原与枸橼酸铁反应可产生黑色沉淀物。以此来检测这些微生物。 D群链球菌，一些草绿色链球菌和一些葡萄球菌为BE阳性。

吡咯烷-β-萘胺（PYR）：能产生吡咯烷酶的微生物分解L-吡咯烷-β-萘胺为L-吡咯烷和β-萘胺，产物与肽酶试剂（磷酸二甲基氨基肉桂醛）结合产生一种红色物质。

精氨酸（ARG）：精氨酸的去水化导致培养基的碱性化，在酚红指示剂中表现为由黄色变为红色。

尿素（URE）：尿素酶分解尿素形成氨。结果使PH升高通过酚红指示剂可检测出。

碳水化合物（RAF，LAC，TRE，MNS，SOR，ARA，RBS，INU，MAN）：一种特殊碳水化合物发酵后形成酸，结果使pH值下降，酚红指示剂变为黄色。

5%氯化钠（NACL）：在6.5%氯化钠中可生长说明有耐受能力。利用耐盐性以区分肠球菌和非肠球菌。

丙酮酸盐（PRV）：丙酮酸盐可形成酸，结果使pH值下降，酚红指示剂变为黄色。

β-内酰胺酶（BL）：在内酰胺酶底物中加入青霉素和碘至可说明是否存在β-内酰胺酶。β-内酰胺环分解后形成比淀粉分子更能竞争碘的结合位点。如果存在β-内酰胺酶，碘与β-内酰胺环结合后产生无色的反应。如果不存在β-内酰胺酶，碘将和淀粉分子结合显示蓝黑色。

溶血反应（HEM）：由链球菌产生的链球菌溶血素S和O在有羊血的琼脂上可发生完全或部分溶血反应。

3. 微生物鉴定

Microscan 干性革兰阳性生物编码册是用于鉴定未知实验微生物的。这本编码册来自于MicroScan自建的数据库。革兰阳性生物编码册为27种链球菌科实验和18种微球菌科实验的计算机分析而提供信息。这些实验结果分别被翻译成一种9位或6位的生物型数字。记录结果的方法请参考编码册。其中列出了微生物的鉴定方式和有关的可能性。所有的都是以最大可能性的顺序排列，累积总共达99.9%。该编码册分为两个部分：微球菌科和链球菌科。

如果出现一种不在编码册中的其它生物型数字，应首先考虑可能是程序的错误。如果重试后仍旧是同样的结果，请致电MicroScan生物型服务部门。

1. 不同于生产者提出的转效点。

2. NCCLS转效点只在说明中出现。用Microscan干性革兰阳性板得出的肺炎链球菌和草绿色链球菌的结果不予报道。

3. NCCLS及生产者提出的关于链球菌的转效点。

Microscan测试板中链霉素和庆大霉素协同筛检法与NCCLS介绍的微稀释培养法有异曲同工之处。出现任何浑浊的迹象即认为细菌能够生长，或者再次培养以确定结果。将用庆大霉素筛检法培养18小时与用微稀释法培养24小时所获得的结果进行比较，两者是相当的。为了达到检测对链霉素协同筛检耐药性的最佳效果，Microscan测试板应该培养24-48小时。

胸腺嘧啶自由生长基（TFG）底物

一些细菌的生长需要胸腺嘧啶。由于Mueller-Hinton培养基中存在胸腺嘧啶磷酸化酶，这些细菌可能表现出对磺胺类的假性易感。如果某种微生物不能在TFG底物中生长，

操作过程限定

1. NCCLS M7-A4文件补充介绍了试验需特殊营养的链球菌时使用的含有溶化马血的Mueller-Hilton培养基。与Microscan干性革兰阳性板程序指南有所不同。如果细菌在生长底物中没有充分生长，生化结果是无效的，需使用另一种替代方法。

2. POS ID 板不适用于试验厌氧革兰阳性球菌。

3. 当鉴定结果的可能性较低（〈85% 〉时，必须进行附加实验以确定最后鉴定结果。（请参阅Microscan 生物型编码册关于需氧革兰阳性微生物或微生物手册）

4. 解释实验结果需要由受过训练的临床工作者来进行，他们会利用判断力、知识及附加的确定试验对一种微生物鉴定结果进行解释。

5. 生物型数字不能用于从同一个患者的各种标本中分离出的菌株的表型鉴定。

6. 最新鉴定系统尚无法使用固定接种物法。必须用混悬法，提升法或Log相准备接种物。

7. 抗万古霉素屎肠球菌及母鸡肠球菌的区别可藉由检测机动性及色素产物,请参考附加微生物实验手册及需氧革兰阳性微生物型编码册中

期望值

若需了解生化底物的期望值，请参阅需氧革兰阳性微生物的Microscan生物型编码册中或微生物指南中的百分表。

特点

1. 鉴定

操作过程要求Microscacn干性革兰阳性2型板用于多中心研究。临床分离株及储存株在2型ID板上及用传统试管方法的实验，用于代替除常规临床实验室以外的细菌类型。详细内容请参阅Microscan系统微生物信息手册（第四部分：干性革兰阳性菌2型ID板），其完整列出了数据库中的生物。

干性革兰阳性菌2型ID板微球菌科的结果与97%(157/161)的分离株的种类水平相一致。仅5.6%(9/161)的分离株需要附加实验以确定种类水平鉴定的低可能性。

干性革兰阳性菌2型ID板链球菌科的结果与91.3%(230/252)的分离株的种类水平相一致。仅14.3%(36/252)的分离株需要附加实验以确定种属水平鉴定的可能性及4.4%(11/252)的分离株需要附加实验以确定类别水平鉴定的可能性。