[转发]荧光定量PCR仪的选购

作者：田云

田 云
(广东省动物防疫监督总所广州市510230)

摘要 荧光定量PCR技术已成为临床分子检测的重要手段之一，其以敏感性、特异性而被越来越多的科研人员所看好，荧光定量PCR仪的性能与检测结果的准确性密切相关。现将PCR仪选购过程中需注意的几点问题做一简单介绍。
关键词 荧光定量PCR仪；选购；检测

Select：ion and purchase of fluorescence ration PCR instrum ent
TlAN Yun
(General institute of Guangdong Animal Epidemic Prevention and Supervision，Guangzhou 51 0230，China)
Abstract As an important method for clinical molecule inspection，fluorescence ration PCR has become preferable for more and more scientific researchers for its good sensitivity and distinctness．Since the inspection accuracy is closely related to the performance of fluorescence ration PCR，this paper introduces some attention—deserved problems in PCR instrument purchase．
Keywords fluorescence ration PCR instrument；selection and purchase；inspection

2003年非典型肺炎和2004年禽流感的爆发，使荧光定量PCR技术在临床检验中的应用前景大为提升。为了提升科研水平和检验水平，各单位争先恐后购人荧光定量PCR仪。如何选择更适合本单位实际情况的PCR仪，就摆在了许多科研人员的面前。针对上述疑问，结合各款PCR仪的特征，本人提出一些个人的看法。

1 PCR仪的分类及特性
1992年，日本人Higuchi首次发现实时荧光定量PCR技术。他在原有的普通PCR仪的基础上，加以改进，添加一个激发和检测装置，并通过在PCR反应液中添加染料溴化乙锭(EB)的方法，来实时监测整个PCR反应的全过程，这就是世界上第一台实时荧光PCR仪。
目前为止。商品化的PCR仪种类繁多。国外的品牌主要有ABI、Roche、MJ、Bio—Rad、Stratagene、Corbtt、Cepheid等，国内也有一些医疗公司在生产销售。
按照仪器的加热性能可以将它们划归为2类。
(1)一类是半导体(半导体+电热丝)加热。硅加热是使用最普遍的一种，导热好，易自动化，速度快，直接加热降温，效果好，但由于其使用的介质是金属，与反应管很难做到无缝接触。ABI、MJ、Bio—Rad等都属于这一种。
ABI(美国应用生物)公司主要销售Prism^®7000、7300、7500、7900HT 4种实时荧光定量PCR仪。其中，Prism^®7000为四色荧光，只能用于2种染料，TaqMan^®和SYBR^®Green I；Prisr^® 7300为四色荧光，能够有效地分辨包括FAM ™SYBR^®Green I、VICnq/J0E 、TAMRA ™和ROX™在内的多种荧光染料；Prism^®7500为五色荧光。能够有效地分辨包括FAM SYBR^®Green I、VIC ^®/JOE、NED™/TAMRA™ Cy3 ^®、ROX™/TexasRed^®和Cy5^®在内的多种荧光染料。实时荧光定量PCR系统的全部96个样品孔采用同一卤钨灯作为光源，可发出全光谱的光源，易更换，但是寿命短。高效平台-7900HT系统是为支持高通量而构建的，光学系统经优化以适用于384~L板荧光信号的激活和实时检测。7300、7500、7900均可进行基因表达分析，病原体绝对定量分析，SNP基因型分析以及以阳性内对照为基础的阳性/阴性结果判定。但是所有定量实验都依赖于染料ROX，用于校正。

Bio—Rad(伯乐)公司的iCycler iQ实时定量PCR系统可4波长同时检测，定性和定量部分可独立工作，可完成梯度PCR，用于快速优化实验条件。第一个采用激发光与发射光双滤光片盘设置。结合荧光干扰校正技术。完全避免信号间的交叉干扰。独特的开放性加样误差校正技术，不依赖于ROX，避免人为加样误差，保证定量结果的准确性。5组滤光片位置使用户可以自由选择不同的检测波长。

MJ的Opticon、Opticon2和chromo4是采用LED光源PMT光电倍增管荧光检测器。96个单色LED光源对应96孔板，但是单色LED激发波长范围窄。Opticon是单道单个光电倍增管荧光检测器，升级的Opticon2是双通道~XPMT光电倍增管荧光检测器。chromo4~l0是四通道PCR系统。PMT灵敏度高但一次只能扫描一个样品，所I)~Opticon系列是逐孔扫描而非同时检测96个样品。梯度功能是它的主要优势之一。

Cepheid公司的Smart CycleflI．~0以其独特的功能，入选精彩生物通2004年度产品评选中年度科技进步产品前3名，是世界上唯一允许不同条件的PCR反应同时进行的定量PCR仪器。Smart CyclerII获得过1998年美国研发R&D100金奖， 机型小巧。有16个样品槽，它的独到之处在于这16个样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，也就是说，这16个样品槽相当于16台独立的定量PCR仪，表明可以在同一定量PCR仪上分别进行不同条件的定量PCR反应，或者表明不同的实验人员可以在不同时间使用同一台仪器，节省时间。其允许不同条件PCR同时进行的独一无二的优点，是其它任何PCR仪都不具备的。升降温速度更快，高达10℃/s，整合有4通道光学检测系统，分别可以检测FAM/SYBR Green I、Tell Cy3、Texas Red和Cy5．可在同一样本中进行多靶点分析，同时检测4种荧光信号；可使用多种检测方法，包括Taqman探针、分子信标、荧光内插染料等。除了这些，美国Stratagene公司的Mx3000P定量PCR仪口碑也不错，4个检测通道，性能稳定。此外，国产的定量PCR仪种类也有很多，在此不再累述。
(2)另一类是空气加热。用空气做介质有优点，与反应体系无缝接触，但是空气的导热性差、比热小的弱点也很明显。
Roche罗氏诊断主推LightCycler和LightCycler2．0 2种荧光定量PCR仪。2oo5年7月份正在全新推出新一代高通量的LightCycler^® 480 system。LightCycler2．0已由LightCycler的3个荧光检测通道升级为6个荧光检测通道，独特的离心、空气加热、毛细管等设计，使其成为很有特色的PCR仪。空气加热通过离心使空气流动，增强导热性，同时使用毛细管，加大接触面积、试剂微量化来弥补不足。加样量的多少对于反应的结果是有影响的，加样量越大，空气比热小的弱点就越明显，所以空气加热的仪器标本量都比较小。使用毛细吸管，试剂的专一性高，通用性差。LightCycler^®480是一款针对高通量实验需要而设计开发的创新一代96/384互换式实
时荧光定量系统，秉承了LightCycler系列一贯的高速、准确的特质，采用革新的Therma—BaseTM模块加热技术和独特快速散热装置，确保了孑L间温度的均一性；同时匹配以先进光学检测系统，确保信号的整体采集和检测灵敏度最大化，消除了传统模块加热式系统中的“边界效应”；具有5个激发光道。6个检测通道。

Corbett的Roar—Gene也是离心式、空气加热的定量PCR仪。Corbett的Rotor-Gene3000标准型是真正独立的4通道(可建立新通道)，4个独立LED激发光源(470rim/530nm/585nm/625nm)，保证最少的光谱交叉(<1％)。PMT检测，6个检测滤光片，可检测荧光包括FAM/SYBR Green I、TET、VIC/JOE、HEX、Max、NED/TAMRA/Cy3、ROX/Texas Red和Cy5，Cy5．5等，机器的适用性非常宽，开放的试剂系统使得机器可适用Taqman探针、荧光染料SYBR Green I检测、分子信标、FRET探针等。Rotor-Gene3000灵敏度高，宽达12个数量级的线性范围，可正确区分1、2、3个拷贝的基因，重复性极佳(R>0．99935)。由于转子在反应过程之中一直以恒定的低速旋转，使得样品间的温度均一性极佳，同一热反应室提供完全相同的反应条件，同一光学通路提供完全相同的测量通道，每标本每循环检测32次，满足高精度和一致性要求。Rotor-Gene3000提供了36x0．2ml和72x0．1ml 2种转子，检测是通过薄壁管侧壁而非管底进行的，因而可以使用普通的0．2ml PCR管，并允许在试管盖上标记，这降低了使用成本。Rotor—Gene3000的温控速度不如Light．Cycler，但优于多数的固定加热模块的机型，能达到5℃，8(管内实际升温速度达到2．5℃/s)。Corbett还有一个光学变性专
利——让待扩增样品预先进行一次熔解曲线程序，检测荧光染料信号大小的变化，找到代表全部双链DNA解链的峰值对应温度，在其后的反应中就无需总是将变性温度设为94。，也不需要延长孵育时间。这个专利使得反应过程大大缩短。Rotor-Gene主要的问题也是可容纳的样品数量少，只能靠反应速度快，同样的时间可以多运行几轮反应来弥补。

2 选购PCR仪的关键因素
除了PCR仪的性能外，仍有一些关键因素是不能被忽视的，主要有：
(1)仪器的检测量。针对不同的实验目的(检测数量的大小，检测时间的长短、检测项目的多少、仪器的多少等)，应配备不同检测量的PCR仪。在上面所述的几种PCR仪中，ABI的Prism^®7000、7300和7500；Bio—Rad(伯乐)公司的iCycler iQ；MJ的Opticon、Opticon2和chromo4；Cepheid公司的Smart CycledI可一次容纳96个样品。Corbett的Rotor-Gene3000每次的最大样本数为36(0．2m1)或72(0．1m1)，LightCycler2．0的每次最大样本
数为32个。ABI的Prism^® 7900HT，Roehel~LightCyeler~ 480可同时检测96/384个样品，对于需要高通量的实验具有很大的应用价值。
(2)仪器的灵活性。针对多数科研实验室的仪器使用频率高、时间长的问题，仪器的灵活性就显得至关重要。如何能够充分利用人力与物力的问题就摆在了我们面前，此时Cepheid公司的Smart CyclerII不失为明智的选择，其允许不同条件的PCR反应同时进行的优点也就格外突出。
(3)仪器的检测通道。目前，复合PCR实验已成为一种流行趋势，它能节省试剂和时间，在短时间内获得结果。其中罗氏的LightCycler2．0和LightCyclerR480具有6个检测通道，剩下的仪器则以4通道检测的居多。
(4)仪器的温度梯度功能。新的定量PCR实验方法的建立，往往离不开反应条件的优化。梯度PCR可以对解链、退火和延伸均设置温度梯度，使你在摸索实验条件时，将本应进行的多次实验简化为一次，大大缩短实验时间。
(5)耗材、试剂的开放性。耗材、试剂的开放性可显著降低实验成本。上述仪器中，Roche使用的耗材的通用性差，成本高(毛细管)，且每次的检测数量低，在高样品量时，无疑叉增加了阴、阳性样品的费用。
(6)软件功能，除硬件的比较之外，软件的功能也不能被忽视。目前，所有的荧光定量PCR仪均能完成绝对定量过程。但是部分软件还可以进行项对定量，SNP分析等。针对不同的实验目的，可选择不同的试验目的和软件，以完成预期的目标。

参考文献
1 Higuchi R．Kinetic PCR alysis real-time monitoring of DNA amplification
reactions．Bioteehnology，1993，1 1(9)：1026~1030