[转发]显微摄影技术

来源：山东农业大学

本文由生物秀根据山东农业大学的演示文档汇编而成，真诚的感谢原作者。
Ø利用显微摄影装置拍摄显微镜(或解剖镜)视野中物象的技术称为显微摄影。
Ø显微摄影技术主要包括两个方面：
1)拍摄： 需要一套完备的显微摄影装置
2)洗印放大：需要一个较好的暗室和成套的洗印放大设备。

一、显微摄影
•(一)仪器与设备
•进行显微摄影最基本的仪器是：
•显微镜
•显微镜摄影仪

1.显微摄影的要求
•(1)载物台能在照相进行时粗微调，且坚固，不松动。载物台最好能作平面转动。
•(2)座架和支架均需稳固，能稳固地安装显微摄影仪，不易受外部振动的影响。
•(3)能进行聚光器的定心调整，并有孔经光阑与视场光阑。
•(4)须有内藏式光源，可调节光亮度，从低倍到高倍都能得到均称的照明，在高倍时能得到十分明亮的光。并备有放置滤色镜的地方。
•(5)具有优质的物镜和目镜。

2.显微摄影仪的必备条件
•(1)要有能够连接显微照相机的装置。
•(2)有一观察镜，能对显微镜视野进行观察，从观察镜中能清晰地看标本。
•(3)物象在观察镜中调至清晰时，也是胶片成象最清晰之时。
•(4)成象质量好，能较好地体现出原标本的情况。
• (好的显微摄影仪还附有测光强、测色温、自动控制曝光时间的装置)
•(5)显微摄影装置应放置在灰尘少，振动少，干燥，半暗的房间中。放显微镜的桌子要坚固平稳。

(二)材料与试剂

•1.材料
•(1)活植物材料如幼小器官，活的组织切片，细胞和原生质体，细胞团、愈伤组织、植物表面等。材料新鲜无异物。
•(2)死植物材料如各种植物组织的永久切片(见树脂切片)，被分离的细胞与细胞器，染色体的压片等。切片清洁无尘，无气泡。所摄部份完整清晰。

2.试剂
Ø显微摄影后胶卷需冲冼，显微摄影常用显定影液的配方见表1
Ø表1几种显微摄影常用显定影液的配方


(三)操作方法及注意事项
•1.安装显微摄影装置
•将相机，显微镜和照明设备连一起，并能在观察镜中看到所要拍摄的标本。
•安装时，需先细读说明书，熟悉仪器结构和功能，连接部位要稳固。

2.调整好显微镜
•(1)聚光器和光源灯的调中
–显微摄影通常采用中心亮视野透射照明法，摄影前，要把聚光器和光源灯调中，使聚光器中心与视场光阑的中心处于同一光轴上。光源灯的灯丝照明于视野中心。

聚光器的调中步骤：
•①转动聚光器升降旋钮使聚光器升至顶点位置；
•②接通光源灯的电源开关；
•③将被摄的制片标本，放在载物台上，用4×或10×低倍镜聚焦在样品上；
•④缩小镜座上的视场光阑，在视野中可见边缘模糊的视场光阑图象；
•⑤微降聚光器，至视场光阑的图象清晰聚焦止；
•⑥用聚光器两个调节螺杆推动聚光器，使缩小的视场光阑图象调至视野中心；
•⑦开放视场光阑，使多角形的周边与视野边缘完全重合；
•⑧反复缩放视场光阑数次，确认光阑中心和边缘与视野完全重合；
•⑨使聚光器回复顶点位置。
光源灯调中方法可采用下法：
•在视场光阑上面的滤色镜座上，放一毛玻璃，用以观察灯丝位置，转动光源灯位置，使灯丝位于视场光阑中心，然后固定光源灯。
(2)正确使用光阑
•显微镜的两种可变光阑，
•即孔径光阑和视场光阑。
•①视场光阑的调节使用：

视场光阑位于镜座之中，其作用：
一是根据物镜的倍率给予不同直径的光束面积
二是在显微摄影时起着增减影象反差的作用。
当光扩大到一定程度，照射到标本上的光即会有反射与不规则的散射，造成影象反差的损失。
当视场光阑收缩到取景框边缘外的时候，摄影图象的反差就会改进。
如果视场光阑收缩得过于接近取景框，图象的四角将被切去。因此，视场光阑应比取景框稍大些。
②孔径光阑的调节：
安装在聚光镜中的光阑叫孔径光阑。它的作用是使图象的分辨率、反差和焦深处在最佳状态。大多数的标本，如想得到高质量的照片，孔径光阑要调节在物镜数值孔径的60%～80%之间(见图)。

在显微摄影时，通常用缩小孔径光阑方法来提高影象反差。
视场光阑随孔径光阑而变，总是外切孔径光阑。

•孔径光阑的功能

Ø孔径光阑放大，照片反差变小。
Ø孔径光阑收缩过小，照片反差增大，但分辨率变小。
Ø孔径光阑收缩不得低于物镜数值孔径的60%。

3.底片选择 •(1)底片种类： •摄影用的底片有硬片(透明玻璃上涂以感光乳剂而成)和软片(胶片与胶卷)。胶卷常用的规格有135和120。
(2)底片性能：
•彩色底片：反转片和负片，又可分别分为日光型、灯光型和日光灯光两用型。
•黑白底片：
Ø色盲片 只感受蓝紫和紫外光的底片称为 (适用于黑白、蓝紫色色光影象的摄影，而不能用来拍摄红、绿、黄等色的影象)；
Ø分色片 能感受蓝紫、黄绿光的底片 (除红橙色标本外，可广泛用于显微摄影)；
Ø全色片 能感受光谱中全部可见光的底片称 (对景物明暗层次能较好表现，黑白层次多，反差小)。
•感光度：底片对光的敏感程度。感光度单位：
Ø定(DIN)制，每相差三定感光速度就相差一倍，如21定为18定的二倍，依次类推。
Ø标准制(ASA)，它规定数值增一倍，感光速度也增加一倍，如ASA 100为ASA 50的二倍。 21定相当于ASA 100。
Ø显微摄影力求使用感光度低的胶片。
(3)底片的选择和应用
•①大型显微摄影机选用硬片，小型显微摄影机选用软片。
•②小型机相所拍底片需要放大，所以选用银粒细的底片。
•③显微摄影要求反差大就选中速(17～19)定和慢速(14～16)定，甚至特慢速(9～13)定底片，一般以18定(ASA 50)以下为宜。
•④色盲片和分色片很适合于显微摄影，特别是显微摄影以分色片最好，全色片也可用于显微摄影，但往往要用适当颜色的滤光片，以增加反差，才能达到良好效果。
•⑤选用灯光型或日光灯两用型彩色底片拍摄具有色彩的样本。
4.曝光的确定
•曝光是显微摄影的一个关键。
Ø曝光过度，使底片密度很大，昏暗不清，丧失影纹细节，反差太小。
Ø曝光不足，整个底片密度很小，比较透明，虽然最大密度部分影纹分明，但最小密度和灰雾密度一样，没有影纹存在，缺乏正常反差。这类底片，根本不能印放出合格的照片。
•曝光最重要的问题就是判定曝光时间，确定快门速度。
Ø显微摄影的视野，亮度变化极大，曝光时间的变化范围宽广，正确估计曝光时间比普通野外摄影要困难得多。
Ø常用的估计影象亮度来确定曝光时间的方法，往往因人眼对光强度的显著变化不会有科学的定量分析而致使发生错误。
(1)影响曝光的因素
•考虑影响曝光因素的着眼点是分析它们对被摄影象的还是削弱。亮度是加强时要减少曝光量。
①照明光源 电压高，功率大的灯泡，光强度高，色温高，使胶片感光快，曝光时间要短。
②胶片的感光度 感光度高的胶片对光敏感，曝光时间可短一些。胶片超过有效期，或保存条件不佳，胶片的感光度会降低，使用时要酌情增加曝光时间。
③物镜的数值孔径和目镜的放大倍数 物镜的数值孔径大，进光量多，影象亮度大，曝光时间要短；目镜放大倍数大，视野相对加大，影象的亮度相应的减小，曝光时间要长。
④滤光片的颜色 滤光片减弱了光源的照明强度。在摄影时必须给予补偿，以达正确的曝光。
⑤标本的差异 标本的厚度与颜色的变化影响到光的透过和吸收。另外，在同一标本中，各部分的光量程度也不同，因而也影响曝光时间。
(2) 确定曝光时间的方法

Ø①经验法：除经验非常丰富的人外，一般不宜采用。
Ø②试摄法：这是一种简单、易行、准确、可靠的确定曝光时间的方法。方法是用同一标本在相同条件下，按几何级数增加曝光时间拍得不同曝光时间的试摄底片，经显影和定影后，根据底片情况决定正确的曝光时间。
Ø③测光表法：显微摄影中可使用的测光表有四种类型：⒈手持光电测光法；⒉显微摄影用的光电测光表；⒊显微摄影装置内装或外接式全自动曝光控制表；⒋装在普通相机内部的测光表。前两种可以通用，但不够精确，后两种方便而准确。

显微摄影曝光参考表

5.取景对焦和拍摄

•(1)屈光度的调节
•在侧视目镜取景器内有一玻璃屏，上刻双十字线。调节时，左右转动屈光度调节环，使侧视目镜取景器镜筒的前端伸缩，改变焦距，至清晰地分辨出双十字线止(见右图)。双十字线校准后，不能随意变动屈光度调节环，以防焦距改变。取景聚焦，只需使用显微镜调焦螺旋。
•在显微摄影中要根据研究目的进行取景，取景的涵义是确定拍摄范围和物体影象在底片上大小(倍数)。专用显微摄影设备，在刻有双十字线的侧视目镜取景器的玻璃屏上刻有数种规格的长方形取景框。底片所能摄下的范围，并非视野所见的全部，仅是圆形视野中长方形部分(见右图)。
•取景时，要使被摄的物体影象中心位于长方形取景框的对角线中心，并使两者的长短相应。需要90°调整时，转动载物台或摄影装置，让影象的长轴和取景框横轴平行。影象的大小可采用调换物镜和目镜来控制。
(2)取景
(3)聚焦与拍摄
Ø转动显微镜的粗细调焦螺旋，改变物镜和被检物体的距离，使视野中物体影象的焦点聚于暗箱的焦平面上。
Ø纵横移动镜台的制片标本，寻找拍摄的图象；上下转动调焦螺旋，辩清标本的细微结构。取景聚焦，需几经反复。底片影象的清晰度决定于拍摄前的最终一次准焦。
Ø取景聚焦完毕，立即揿下快门按钮，任何有关操作，都要在聚焦前完成。准焦后的微小颤动，也会引起焦点的改变，致使拍出的底片影象模糊不清。

6.记录
•由于显微摄影是记录科学研究结果的一种方法，因此在显微摄影中，每拍一张或每拍一批都要详细记录已拍底片的拍摄条件和情况，如被摄标本特点、仪器组合、照片条件、曝光时间、底片型号等，以作往后工作参考。

徕卡DMLB型显微镜带MPS 30/60 型显微镜摄影控制器操作程序
•(1)清洁 对显微镜机械、电路、光学元件、相机以及自动曝光控制装置清诘。不仅要严格要求仪器的洁净，而且对桌、椅、地板也保持干净，室内尽量少灰尘。
•(2)接电源 将LEICA DMLB型显微镜和LEICA MPS 30/60型自动曝光控制器接上稳压器的输出电源接线板插座210V～215V上。
•(3)打开开关 显微镜底座左边露出半圆黑色转板，将其向外转到1～2V的点上，再打开镜座左边前沿的红色开关，镜座上透射出的微弱的光亮，待灯丝预热1～2分钟后再调用。
•(4)调双目镜同焦 先对左边目镜，旋动粗调焦螺旋，使载物台的载玻片靠近10×物镜，再用左眼看左边目镜，边看边下调载物台，当看到标本组织的清晰像后，再微调到最清晰为止。然后调右边目镜，这时就不去调粗，细调焦螺旋，仅调右目镜上的上下移动螺纹，使右目镜焦距调到视野中标本组织像最清晰为止。这时，左、右两目镜即能适应您的双眼的同焦。
•(5)调瞳距 将双目镜筒用双手拿住，边往里外伸缩，边用双眼观察视野标本，使两个视野合并到一个圆视野为止。
(6)调视场光阑 收缩视场光阑，将聚光镜向上升到顶后，接近载物台往下降，直至看到多边形的视场光阑像为止，转动调中螺丝将视场光阑调正中，然后将视场光阑像多边形边缘放大到视野圆的外切。
•(7)调孔径光阑 取下目镜，放入辅助望远镜，旋动辅助望远镜，以看清孔径光阑像为止。调节对中螺丝，使孔径光阑处在正中。再开大孔径光阑到60%～80%。也可按刻度标记计算，如利用物镜10×，其数值孔径(NA)为0.25，即0.25×80％＝0.2，即将孔径光阑调在刻度的0.2上。如是物镜40×，NA为0.65，即0.65×80％＝0.52，即调在刻度0.52上。
•(8)放入照相目镜 选用配置好的照相目镜（目镜上有“PHOTO”）倍数为10×。
•(9)选用物镜 可选用平消色差物镜（N PLAN，PLAN）、荧石物镜（半平扬复消色差PL FLUOTAR）物镜或平场复消色差物镜（PLAPO），但以后者为最好
•(10)调双直线 用调标本焦点照相的那只眼睛，边观察取景筒，边调节取景筒上螺旋，直至“+”字双线的双线间分开得非常清晰为止。
•(11)取景 以“24×36”的方框内选取组织部位作为拍摄范围。
•(12)装入底片 打开摄影装置上相机后背，按顺序插入胶卷，左手按着片头送入收片轴，使胶片卷入收片轴，稳妥后，关上后盖，等待2～3秒种后，即听到马达转动齿轮声，它将胶卷片头送入收片轴绕转住，约拉过胶卷上24个齿孔（三张画面长度），相机正面上的画幅记数窗口即呈现出“01”数字。
•(13)放滤光镜 用黑白全色片拍一般H. E染色组织片用绿色滤光镜（灯泡电压一般用6～9V）；日光型彩色片用DLF 滤光镜（灯泡电压要调在10.5V以上）；灯光型彩色片不用滤光片，而只将灯泡电压调在10.5V以上。
•(14)核对 在曝光前要核对“＋”字双直线，取景范围，对标本焦点，电压数，ASA(胶卷感光度)， CAL(曝光指数)， AUTO(自动曝光模式)，FIX(手控曝光模式)，检查无误后再拍摄。LEICA MPS 30/60型自动曝光控制器开机后的默认方式是自身识别胶卷的感光度，CAL为1.00，曝光模式为AUTO。
•(15)曝光 按LEICA MPS 30/60型自动曝光控制器的“EXPO”键，边按键，边观察相机的供片轴是否响动，画幅数字窗口是否显示出递增数字，如有响动和显示递增数字则表示自动曝光控制器运转正常，以后，继续拍摄2～36张，即按第12步～16步常规进行。如没有响动或不递增数字，即出故障。每拍摄一张应记录好标本名称、拍摄内容和放大倍数等。
• (16)倒片 胶卷拍完后，相机会自动倒片，直至全卷倒完。（如一卷只拍了十几张不拍，需要将拍过胶卷部分取出来，这时要按相机正面上的倒片黑按钮进行倒片，记录当时拍的张数，以供下次接着拍剩余胶卷），当转到有片头响声后，才能打开相机后盖，取出胶卷。摄完的胶卷要用黑纸或底片盒装好，待冲洗。底片盒上要注明拍摄内容、拍完日期

二、洗印和放大


(一)底片冲洗
1.显影罐法

2.盆中显影法
Ø取三只搪瓷盘或塑料盘，排成一排，依次加入20℃显影液、停影液和定影液。要注意设法使温度保持20℃左右，如有空调设备最理想。
Ø要求暗室内全暗，除彩色片外，也可在暗红或深暗绿色的安全灯下操作。
Ø取出底片使药膜面向上，迅速而均匀地浸入显影液中，然后不断使盆中药液移动，显影时间根据底片情况而定。显影结束后，洗相夹住底片边缘，投入停显液中约半min，再取出放入定影液中约15～20min后，这时可开灯，检查底片上乳白色是否完全消除，再放15min，就可取出在流水中冲洗半小时以上。最后用夹子夹住底片凉干。
(二)放大技术
•照片放大是利用透过底片的光线，通过放大镜头的集光作用，把底片的影象放射到放大机外面。这时放大机中心垂直的某一平面上，即形成与底片相同且倍数较大影象。若这个平面是放大纸，由于的感光作用，就能将这个影象记录下来。放大机结构见右图。
•一般大光圈对焦。小光圈曝光。

1.放大纸的选择
Ø(1)放大操作首先要准确鉴别底片的密度的反差能选配适当的放大纸和印相纸。然后根据需要放大尺寸调整机身的位置。
Ø(2)放大时纸的选配也相当重要。目前国产放大纸分为4号：1号(性能软)；2号(较软或中性)；3号(较硬)；4号(硬)。一般是底片反差偏小时，选用偏硬的放大纸，就可得到适中的照片，如底片反差偏大时，则选用偏软的放大纸，也可得到反差适中的照片。常用3号放大纸。
Ø(3)选好放大纸后剪小块纸作几次不同曝光时间和纸型的试放，从而确定正式的放大纸型和曝光时间。放大时，纸要稍大于放大尺寸。曝光计时最好用定时器。
2.使用放大机的注意事项
Ø(1)底片和感光纸的平面必须同镜头相平行，底片的中心必须对着镜头的光轴。
Ø(2)底片要摆在放大机中央部位，并用黑纸将底片四周透光部位遮挡起来。
Ø(3)调焦时要开大镜头光圈，所用的成像白纸厚度应与所用的放大纸厚度相等。对清楚焦点后将光圈收缩，使画面中央和四周都能达到一定清晰度。
Ø(4)在放大曝光的过程中不得使放大机受震动。
Ø(5)大批量放大照片，电源上要装有稳压器，并使用电子自动曝光器曝光。
Ø(6)放大机内部，镜头与聚光镜必须保持清洁，不得有灰尘。
3.放大照片的显影
•冲洗用搪瓷盆或塑料盆进行，并列放好三只盆，依次倒入20℃左右的显、停、定影液。
1)显影 取曝光后的放大纸，将药膜面向下，浸入显影液中，用夹子按动照片背面，使乳剂膜完全浸入显影液中，并不断拖动放大纸。
2)停显 待所有细微部分都均匀地显现出来后用洗相夹取出放大纸，移入停显液中，漂洗10～20s钟。
3)定影 再移入定影液中约15min。
4)漂洗 然后放在水中充分漂洗，约1小时左右。
5)上光 最后从水中取出放大纸，平放在上光板上，影象面朝上光板，放在上光机电热器上烘干，照片自动胶落。
6)存放 再用切刀把照片边缘裁齐，登记编号，装袋或装册保存备用。
4.照片放大倍数的确定
•照片上物象的放大倍数可用二种方法确定：
v(1)照片上物象的放大倍数＝显微摄影放大倍数×放大机的放大倍数。
v(2)在显微摄影时，把测微尺放在载物台上，用拍摄样品同样的倍数拍摄标尺，然后象样品底片那样在放大机上同样放大，洗出照片，用照片的标尺可直接量值所摄样品的大小。