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PCR技术的发明 1983 Kary Mullis 发明 1985 开始有文章发表 1993 获诺贝尔奖 广泛用于分子生物学研究领域
变性--退火--延伸三个步骤
1.模板DNA的变性:93℃-95℃左右, 2.模板DNA与引物的退火(复性):Ta=Tm-3~5 ℃ 3.引物的延伸:Taq DNA聚合酶之5’-3’DNA聚合酶活性
PCR标准反应体系 DNA模板 p引物 p反应缓冲液 pMg 2+ pdNTP p耐热聚合酶 pddH2O 反应体系对PCR扩增的影响 1.DNA模板: 纯度 蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度 浓度适当 2.引物 设计 长度适当、避免二级结构和二聚体 合成质量 浓度 50uL体系引物加量为10-20 pmol 3.反应Buffer pH、盐离子、稳定剂、增强剂 提供缓冲环境 4.Mg 2+浓度 过高非特异性严重 过低无扩增产物 5.dNTP Mixture 浓度适当,避免反复冻融 6.ddH2O pH值适当,避免污染
如何选择最合适的DNA聚合酶
1.Taq酶——扩增效率最高发现 1969年,美国黄石国家公园温泉 活性 5‘-3’ DNA聚合酶活性 强 5‘-3’ DNA外切酶活性 弱 荧光探针(定量PCR方法) 3‘-5’ DNA外切酶活性 无 错配率每个循环约1/6000 3‘末端加“A” 能 产物可直接进行“TA”克隆 生产质检 诱导大肠杆菌表达、三次柱纯化,分离获得94kD重组蛋白。 无核酸酶和 细菌DNA污染 能有效扩增人基因组单拷贝基因 室温放置一周,无明显活性改变。
2.pfu酶——保真度高 原理 具3’-5’核酸外切酶活性,即校正功能。 效率相对较低 3‘末端不加“A”,加A后才可进行TA克隆。 用途 –表达基因的克隆 –基因的定点突变 –细胞内基因点突变分析(SNP)
3.HotStart Taq酶——特异性高 原 理 –蜡封 –抗体抑制 –化学修饰
提高PCR特异性,减少甚至避免非特异性扩增 3‘加“A”,可直接做“TA”克隆 用 途 –混杂模板 –半定量、定量PCR
4.混合酶——高扩增效率+高保真度 Taq plus Taq+pfu 用于复杂模板(GC rich, 二级结构)扩增 大多数情况下可替代Taq, 特别是产物在6Kb以上时,可扩10-20kb。
Long Taq Taq+pfu 超长片断扩增,15-40kb.
Taq platinum HotStart+pfu 高扩增效率+高保真度
根据PCR实验的不同需求 基因组扩增、RT-PCR ——————— 特 异 性
基因突变、测序、 表达克隆————— 保 真 性
构建基因图谱、测序等—— 长片段扩增
复杂模板扩增 (GC含量高、二级结构) —扩增效率
PCR MasterMix
PCR Master Mix 产品特点 特 点 • 快速简便 减少加样误差和污染 • 灵敏度高 可扩增低至2个拷贝的目的模板 • 特异性强 降低PCR反应的要求,增强特异性 • 稳定性好 -20℃一年以上,反复冻融不影响活性。 适用范围 • 大规模基因检测 • 目的基因拷贝数极低的样本 • GC含量高,有二级结构的模板 • 复杂基因组样本
PCR常见问题分析 PCR常见问题 1.无扩增产物 现象:正对照有条带,而样品则无 ①无扩增产物之模板原因 ②无扩增产物之引物原因 ③无扩增产物之PCR条件原因 2.非特异性扩增或拖尾 现象:条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带
3.假阳性 现象:空白对照出现目的扩增产物
提高PCR特异性的策略 四种策略 1.巢式PCR(Nest-PCR) 2.递减PCR(TouchDown PCR) –前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。 –循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始,然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。 –特异性最高的目的模板会被优先扩增,这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。 –递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用,如AFLP、DNA指纹分析等。 3.热启动PCR(HotStart PCR) –热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成,直到PCR 仪达到变性温度 –通常选择热启动Taq酶 –热启动PCR是除了好的引物设计之外,提高PCR特异性最重要的方法之一 4.使用PCR增强剂 –甲酰胺,DMSO,甘油,甜菜碱等 –可能的机理:降低熔解温度,有助于引物退火,辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区 –增强剂浓度要适当
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