[转发]免疫细胞化学常用试剂介绍

一、固定剂
　　大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。
　　目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
　　1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）
　　试剂：多聚甲醛　　　　　　　　　　40g
　　0.1mol/L磷酸缓冲液　　　　　　　　至1000ml
　　配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
　　该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
　　2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠
　　试剂：A液：多聚甲醛　　　　40g
　　蒸馏水　　　　　　　　　　400ml
　　B液：Na2HPO4·2H2O　　　　16.88g
　　蒸馏水　　　　　　　　　　300ml
　　C液：NaOH　　　　　　　　　3.86g
　　蒸馏水　　　　　　　　　　200m
　　配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
　　该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。
　　3．Bouin’s液及改良Bouin’s液
　　试剂：饱和苦味酸
　　40%甲醛　　　　　250ml
　　冰醋酸　　　　　　50ml
　　配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。
　　该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。
　　4．Zamboni’s(Stefanini’s)液
　　试剂：多聚甲醛　　　　　　　　　20g
　　饱和苦味酸　　　　　　　　　　 150ml
　　Karasson-Schwlt’s PB　　　　　至1000ml
　　配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。
　　该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为6～18h。
　　5．PLP液　　PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）
　　试剂：过碘酸钠
　　赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸）：
　　多聚甲醛
　　蒸馏水

　　配制方法：
　　（1）贮存液A（0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，将pH调至7.4，补足0.1mol/L的PB至100ml，使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4℃冰箱保存，最好两周内使用。此溶液的渗透浓度为300mOs mmol/L/kg。
　　（2）贮存液B（8%多聚甲醛溶液）：称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多聚甲醛液（方法见前）。过滤后4℃冰箱保存。
　　（3）临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠（NaIO4），使NaIO4终浓度为2%。由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2，故固定时不需再调pH值。固定时间为6～18h。
　　该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定剂有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。Mclean和Nakane等认为，最佳的混合是：含0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L的赖氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。
　　6．Karnovsky’s液（pH7.3）
　　试剂：多聚甲醛　　　30g
　　25%戊二醛　　　　　80ml
　　0.1mol/L PB　　　　至1000ml
　　配制方法：先将多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/L的PB至1000ml，混匀。
　　该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在4℃短时固定，比在较低浓度的戊二醛中长时间固定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。固定时最好先灌注固定，接着浸泡固定10～30min，用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。
　　7．0.4% 对苯醌 （Parabenzoquinone）
　　试剂：对苯醌　　　　　　　4.0g
　　0．01mol/L PBS　　　　　　1　000ml
　　配制方法：称取4.0g对苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。
　　对苯醌对抗原具有较好的保护作用，但对超微结构的保存有一定影响，故常与醛类固定剂混合使用。一般要求临用前配制，且避免加热助溶，因加热或放置时间过长，固定液变为棕色至褐色，会使组织标本背景增加，影响观察。此外，对苯醌有剧毒，使用时避免吸入或与皮肤接触。
　　8．PFG液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG）
　　试剂：对苯醌　　　　　　　　　　　　20g
　　多聚甲醛　　　　　　　　　　　　　　15g
　　25%戊二醛　　　　　　　　　　　　　40ml
　　0.1mol/L二甲酸钠缓冲液　　　　　　至1000ml
　　配制方法：先以500ml左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸钠缓冲液至1000ml充分混合。
　　对苯醌与戊二醛及甲醛联合应用，即可阻止醛基对抗原的损害，又不影响超微结构的保存，故适于多种类抗原的免疫细胞化学，尤其是免疫电镜的研究。
　　9．碳二亚酰胺-戊二醛（ECD-G）液
　　试剂：0.05mol/L PB　　500ml
　　0.01mol/L PBS　　　　 500ml
　　Tris　　　　　　　　　约14g
　　浓HCl　　　　　　　　 少许
　　ECD　　　　　　　　　 10g
　　25%戊二醛　　　　　　3.5ml
　　配制方法：先以约500ml的PB与相同体积的PBS混合，加入Tris（使其终浓度为1.4%）溶解，以浓HCl调pH至7.0，再将事先称取好的ECD和戊二醛加入混合液，振摇后计时，用pH计检测，约2～3min时，pH降至6.6，再以1N的NaOH在4min内调pH至7.0，此时，将该混合固定液加入盛有细胞（经PBS漂洗过）的器皿中，在23℃固定7min后，以PBS洗去固定液，即可进一步处理。
　　ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboi－imide hydrochloride]，简称乙基-CDI，常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质的固定也有良好效果。ECD单独应用时，边缘固定效应重，但与戊二醛、Tris及PB联合应用，效果明显改善，细胞质仍可渗透，利用细胞中抗原的定位，超微结构保存较好。目前认为是一种用于培养细胞电镜水平免疫细胞化学研究的很好的固定剂。
　　10．四氧化锇（锇酸Osmic Acid, OsO4）
　　配制：将洗净装有OsO4的安瓿中加热后，迅速投入装有溶剂的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。也可用钻石刀在安瓿上划痕，洗净后再放入瓶中，盖好瓶塞，用力撞击安瓿，待其破后加溶剂稀释。为保证充分溶解，应在用前几天配制。
　　（1）2% OsO4水溶解：取OsO41g溶于重蒸水中。此液常作为储备液，于冰箱中密封保存。
　　（2）1% OsO4-PB：
　　试剂：A、2.26%　　　　NaH2PO4·2H2O　　　　4.15ml
　　　B2.52%　　　　　　　　　　　　　　　　8.5ml
　　C、5.4%　　　　　葡萄糖　　　　　　　　　　　5ml
　　D、OsO4　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.5g
　　配制方法：先分别配好A、B、C三种液体，取A液41.5ml与B液8.5ml混合，将pH调至7.3～7.4，取A－B混合液45ml再与5ml C液混合即为0.12mol/L PBG。
　　（3）1% OsO4/0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）：
　　试剂：2% OsO4水溶液　　　　　　　　　　　　　10ml
　　0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）　　　　10ml
　　配制方法：取2%OsO4储备液10ml与等量0.2mol/L、pH7.2～7.4的二甲胂酸钠缓冲液充分混合即可。
　　OsO4是电镜研究所必需的试剂，常用于后固定。尽管OsO4主要为脂类固定剂，但也可与肽类及蛋白质起作用，形成肽-蛋白质或肽-脂交联。过氧化物酶的反应产物经OsO4处理后，电子密度增高，适于电镜研究。但由于OsO4的反应产物对光及电子有较明显的吸收能力，因此在免疫细胞化学染色前常需去除，去锇在光镜水平常用1%的高锰酸钾，在电镜水平则常用H2O2来处理。
　　以上介绍了目前免疫细胞化学中常用的一些固定液。关于固定液种类还很多，如70%～90%的酒精、丙酮、醋酸酒精（含0.1%～1%醋酸的70%～90%的酒精等），这些溶液都能促使蛋白质凝固。它们最初只是光学显微镜通用的固定液，但在免疫细胞化学上用其它方法不成功时，也可试用。总之，掌握一个原则，免疫细胞化学中，含重金属的固定液禁用（但Zenker-Formalin可进行短时的固定）。目前多数认为，对生物标本较好的固定措施是：用4℃的Karnovsky’s液灌注固定10～30min后，接着在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液中漂洗过液，这种短时冷固定处理，有助于超微结构和许多肽类抗原的保存。对其它较难保存的抗原可尝试PFG、PLP及Zamboni’s液等混合固定液。
　　二、缓冲液
　　免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即使是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度等也常常不同。在此介绍几种最常用的缓冲液的配制。
　　1．0.2mol/L(pH7.4)磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer, PB）
　　试剂： NaH2PO4·2H2O
　　Na2HPO4·12H2O
　　配制方法：配制时，常先配制0.2mol/L的 NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PB），根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。
　　（1）0.2mol/L的 Na2HPO4；称取Na2HPO4.12H2o 31.2g(或 NaH2PO4·H2O 27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。
　　（2）0.2mol/L的 Na2HPO4：称取NaHPO4.·12H2o 71.632g（或 Na2HPO4·7H2O 53.6g或 Na2HPO4·2H2o 35.6g）加重蒸水至1000ml溶解。
　　 （3）0.2mol/L pH7.4的PB的配制：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4和81ml 0.2mol/L的 Na2HPO4·12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PB（pH约为7.4～7.5）。若pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可。
　2．0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphate Buffered Saline, PBS）
　　试剂：0.2mol/L PB　　　50ml
　　NaCl 　　　　　　　　　8.5～9g(约0.15mol/L)
　　重蒸水 　　　　　　　　至1000ml
　　配制方法：称取NaCl 8.5～9g及0.2mol/L的PB 50ml，加入1000ml的容量瓶中，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀即可。若拟配制0.02mol/L的PBS，则PB量加倍即可，依此类推。
　　PB和PBS是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液，0.01mol/L的PBS主要用于漂洗组织标本、稀释血清等，其pH应在7.25～7.35之间，否则需要调整。0.1mol/L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。一般情况下，0.2mol/l PB的pH值稍高些，稀释成0.01mol/L的PBS时，常可达到要求的pH值，若需调整pH，通常也是调PB的pH。
　　3．Karasson –Schwlt’s磷酸盐缓冲液
　　试剂： NaH2PO4·H2O　　3.31g
　　Na2HPO4·7H2O　　　　　33.77g
　　重蒸水 　　　　　　　　至1000ml
　　配制方法：同前
　　该缓冲液主要用于配制Zamboni’s固定液。
　　4．0.5mol/L pH7.6的Tris- HCl缓冲液。
　　试剂：Tris(三羟甲基氨基甲烷)　　60.57g
　　1N HCl　　　　　　　　　　　　　约420ml
　　重蒸水 　　　　　　　　　　　　至1000ml
　　配制方法：先以少量重蒸水（300～500ml）溶解Tris,加入HCl后，用1N的HCl或1N的NaOH将pH调至7.6，最后加重蒸水至1000ml。此液为储备液，于4℃冰箱中保存。免疫细胞化学中常用的Tris-HCl缓冲液浓度为0.05mol/L，用时取储备液稀释10倍即可。
　　该液主要用于配制Tris缓冲生理盐水（TBS）、DAB显色液。
　　5．Tris缓冲生理盐水（Tris Buffered,Saline,TBS）
　　试剂：0.5mol/L Tris-HCl缓冲液　　　100ml
　　NaCl　　　　　　　　　　　　　　　3.5～9g(0.15mol/L)
　　重蒸水　　　　　　　　　　　　　　至1000ml
　　配制：先以重蒸水少许溶解NaCl,再加Tris-HCl缓冲液，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀使Tris终浓度为0.05mol/L。
　　TBS主要用于漂洗标本，常用于免疫酶技术中。
　　6．Tris-TBS(PBS)
　　试剂：Triton X-100　　　　　　　10ml(1%)或3ml(0.3%)
　　0.5mol/L Tris缓冲液（pH7.6）　　1000ml(50ml)或(0.2mol/L的PB)
　　NaCl　　　　　　　　　　　　　　8.5～9g
　　重蒸水　　　　　　　　　　　　　至1000ml
　　配制方法：先以重蒸水少许溶解NaCl后，加入Triton X-100及Tris缓冲液或（PB），最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀。
　　该液常用浓度为1%及0.3%，前者主要用于漂洗标本，后者主要用于稀释血清。
　　7．0.1mol/L（pH7.4）二甲胂酸缓冲液
　　试剂：0.2mol/L二甲胂酸钠　　　　　　500ml
　　0.1N HCl　　　　　　　　　　　　　　28ml
　　蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　至1000ml
　　配制方法：先称取二甲胂酸钠（MW：214）42.8g,加蒸馏水至1000ml，使0.2mol/L的二甲胂酸钠溶液；再取HCl 1.7ml加蒸馏水至1000ml ,配成0.1N，最后 取0.2mol/L二甲胂酸钠溶液500ml及0.1n HCl 28ml混合，加蒸馏水至1000ml，即为0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液。
　　8．几种常用的不同pH值缓冲液的配制表
　　（1）0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.7～8.0）
pH0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2HPO4(ml)
5.793.56.5
5.892.08.0
5.990.010.0
6.087.712.3
6.185.015.0
6.281.518.5
6.377.522.5
6.473.526.5
6.568.531.5
6.662.537.5
6.756.543.5
6.851.049.0
6.945.055.0
7.039.061.0
7.133.067.0
7.228.072.0
7.323.067.0
7.419.081.0
7.516.084.0
7.613.087.0
7.710.589.5
7.88.591.5
7.97.093.0
8.05.394.7

　　

(2)0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.19～9.10）
pH0.2mol/L Tris(ml)0.2mol/L HCl(ml)H2O
7.1910.018.012.0
7.3610.017.013.0
7.5410.016.014.0
7.6610.014.015.0
7.7710.014.016.0
7.8710.013.017.0
7.9610.012.018.0
8.0510.011.019.0
8.1410.010.020.0
8.2310.09.021.0
8.3210.08.022.0
8.4110.07.023.0
8.5110.06.024.0
8.6210.05.025.0
8.7410.04.026.0
8.9210.03.027.0
9.1010.02.028.0

　　(3)0.2mol/L醋酸盐缓冲液（pH3.6～5.6）
pH0.2mol/L醋酸（ml）0.2mol/L醋酸钠（ml）
3.646.33.7
3.844.06.0
4.041.09.0
4.236.813.2
4.430.519.5
4.625.524.5
4.820.030.0
5.014.835.2
5.210.539.5
5.48.841.2
5.64.845.2

　　(4)0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH5.0～7.4）
pH0.2mol/L二甲胂酸钠（ml）0.2N HCl(ml)蒸馏水
5.02523.551.5
5.22522.552.5
5.42521.553.5
5.62519.655.5
5.82517.457.5
6.02514.860.3
6.22511.963.1
6.4259.265.8
6.6256.768.3
6.8254.770.3
7.0253.271.8
7.2252.172.9
7.4251.473.6

　　注：HCI可由NCO3代替，配制成二甲胂酸钠-HNO3缓冲液。
　　（5）0.2mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.2～10.7）
pH0.2mol/L Na2CO3(ml)0.2mol/L NaHCO3(ml)
9.24.046.0
9.37.542.5
9.49.540.5
9.513.037.0
9.616.034.0
9.719.530.5
9.822.028.0
9.925.025.0
10.027.522.5
10.130.020.0
10.233.017.0
10.335.514.5
10.438.511.5
10.540.59.5
10.642.57.5
10.745.05.0

　　三、显色液
　　免疫细胞化学中，由于抗原-抗体反应所形成的复合物本身无色，无法直接观察，因而需借助于某些化学基团的呈色作用，使其得以显示，以利于在显微镜下观察。常用的显色液有：
　　1．DAB（Diaminobenzidine）显色液
　　DAB即3，3-二氨基苯联胺
　　试剂：DAB（常用四盐酸盐）　50mg
　　0.05mol/L TB 　　　　　　　100ml
　　30% H2O2　　　　　　　　　30～40μl
　　配制方法：先以少量0.05mol/L(pH7.6)的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分摇匀，使DAB终浓度为0.05%,过滤后显色前加入30%的H2O230～40μl，使其终浓度为0.01%。
　　DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法（如酶标法、PAP法等），其终产物可直接在光镜下观察，也可经OsO4处理后，增加反应产物的电子密度，用于电镜观察。但有几点需注意：DAB溶解要完全，否则未溶解的颗粒沉积于标本上影响观察；DAB浓度不易过高，否则显色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，故操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。
　　2．4-氯-1-萘酚（4-Cl-1-Naphthol）显色液
　　配方1：4-Cl-1-萘酚 　　　　　　　　100mg
　　纯乙醇　　　　　　　　　　　　　　 10ml
　　0.05mol/L TB(pH7.6)　　　　　　　　190ml
　　30% H2O2　　　　　　　　　　　　 10μl(0.003%)
　　配制方法：先将4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后加入Tb 19ml，用前加入30% H2O2使其终浓度为0.005%，切片显色时间通常为5～20min。
　　配方2：4-Cl-1-萘酚
　　N-二甲基甲酰胺（DMF）
　　0.05mol/L TB(pH7.6)
　　30% H2O2
　　配制方法：先将4-Cl-1-萘酚加入DMF中，加热溶解使呈乳白色，再加入TB，乳白色变为絮状，在7.5℃加热5min后加入H2O2，搅动使絮状消失，趁热过滤，当降至略低于50℃时才放入组织标本（注意：温度过高易损伤标本，过低则易重新出现沉淀）。显色时间通常为5min左右。
　　4-Cl-1-萘酚的终产物显示蓝色。
　　多数认为最好去除白色沉淀（如上述），但Larsson等认为，白色沉淀可作为背景，使阳性部位更易观察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的组织标本，勿用酒精脱水。
　　3．3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole,AEC）显色液
　　试剂：AEC　　　　　　　　　　　20mg
　　二甲基甲酰胺（DMF）　　　　　　2.5ml
　　0.05mol/L醋酸缓冲液（pH5.5）　　50ml
　　30%H2O2　　　　　　　　　　　　25ml
　　配制方法：先将AEC溶于DMF中，再加入醋酸缓冲液充分混匀。临显色前，加入30%H2O2。切片显色时间为5～20min。
　　该显色液作用后，阳性部分呈深红色，加以苏木精或亮绿等作为背景染色，则效果更佳。由于终产物溶于酒精和水，故需用甘油封固。
　　4．TMB显色液
　　试剂：TMB
　　HCl
　　亚硝基铁氰化钾
　　无水酒精
　　配制方法：
　　（1）醋酸盐缓冲液：取1.0mol/L的HCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸钠400ml中混合，再加蒸馏水稀释至1000ml，用醋酸或NaOH将pH调至3.3。
　　（2）A液：取上述缓冲液5ml，溶解100mg亚硝基铁氰化钾，加蒸馏水92.5ml混合。
　　（3）B液：称取5mg TMB加入2.5ml无水酒精中，可加热至37℃～40℃直到TMB完全溶解。
　　（4）孵育液：放入标本前数秒，取2.5ml B液及97.5ml A溶于试管中充分混合。（液体在20min内应保持清亮的黄绿色，否则可能已有污染）。酶反应时，加入终浓度为0.005%的H2O2。
　　（5）主要显色步骤：组织标本在蒸馏水（或PBS）中漂洗数次（每次约10～15min）后放入未加H2O2的孵育液中作用20min（19℃～30℃），然后向孵育液中放入H2O2（每100ml孵育液中加0.3%的H2O2 1.0～5.0ml）继续孵育液20min左右（19℃～23℃），捞出标本漂洗数次（共30min左右）。在0～4℃条件下可在漂洗液放置4h直至贴片、脱水，封片。也可在贴片前在1%的中性红中负染2～3min，也可在1%派诺宁（pH3.3～3.5）中负染5min后贴片、脱水、封片。
　　TMB即四甲基联苯胺（Tetrabenzidine）是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应，且由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深兰色沉淀物，这使得TMB成为组化实验中的一种很好的发色团。同时反应产物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反应进行。TMB的反应产物为深蓝色，利于光镜观察，且反应产物越聚越大，常超出单个细胞器的范围（而DAB则被限制在其内），故TMB反应的检测阈较低。由于上述优点，目前TMB常用于光镜及超微结构水平的HRP及HRP-WGA神经投射的研究。需要注意的是：TMB显色液中的A液和B液应在2h内新鲜配制。另外，TMB是一种较强的皮肤刺激剂，并有致癌的潜在可能，故使用时应带手套及在通风条件下操作。

　　5．NBT显色液
　　试剂A液：5%NBT：称 取0.5gNBT溶于10ml 70%的DMF（二甲基甲胺）内，充分混合，常存于4℃，也可装成小份，-20℃保存，用前复温。
　　B液：5% BCIP：称取BCIp 0.5g溶于10ml 100%的DMF内，混匀。4℃或分装存于-20℃，用前恢复至室温。
　　C．显色液：取A液40μl，加入到盛有10ml的0.1mol/l Tris-HCl(pH9.5,钤0.1mol/L NaCl、5mmol/L MgCl2)管内，充分混匀；再加入B液40μl，轻轻混合即可。最好用前新鲜配制。
　　NBT即四唑氮蓝（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818,为深蓝色无定形微溶物质。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）。当二者存在时，在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）作用下，NBT被还原形成显微镜下可见的蓝色或紫色沉淀。
　　四、粘附剂
　　在免疫细胞化学工作中，由于标本（如切片）的脱落常影响工作的质量的速度，故粘附剂的选择和使用就显得较为重要。

　　1．铬矾明胶液
　　试剂：铬矾　　　　　　　　0.5g
　　明胶（Gelatine）　　　　　5g
　　H2O　　　　　　　　　　 ~1000ml
　　方法：在1000ml的烧杯或烧瓶中，以500～800ml H2O加温溶解明胶，待其完全溶解后，再加入铬矾。注意温度过高易使明胶烧糊，包被玻片时最好控制水温在70℃。如有明显残渣，过滤后使用。
　　2．甲醛-明胶液
　　试剂：40%甲醛　　　　　　2.5ml
　　明胶　　　　　　　　　　0.5g
　　蒸馏水　　　　　　　　　至100ml
　　配制方法：用少许蒸馏水（约80ml）加热溶解明胶，待完全溶化后，加入甲醛，最后补充蒸馏水至100ml混匀即可。
　　3．多聚赖氨酸（Poly-L-Lycine,PLL）
　　试剂：多聚赖氧酸　　　　　 5g
　　蒸馏水　　　　　　　　　　 ~1000ml
　　配制方法：称取PLL，溶于H2O，充分混合即可，此液浓度为0.5%，可适当稀释配成0.01～0.5%浓度。4℃保存，也可-20℃备用。PLL可反复冰冻，效果无明显影响，工作液常再稀释10～50倍。
　　4．Vectabond试剂　　该试剂是Vector公司新进推出的一种新型玻片粘附剂。该试剂与一般的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地贴于玻璃片上，贴上后不易脱落，保留时间较久。一个试剂盒（7ml）可配成350ml工作液（用丙酮配）。处理载玻片前（事先酸处理），用染色缸装好各种液体，按下列程序进行：
　　干净载玻片→丙酮5min→Vectabond试剂工作液（7ml Vectabond+ 350ml丙酮）：将载玻片用镊子夹住浸入Vectabond试剂1～2次→dH2O，2×5min→干燥（37℃过夜）→用铝箔包好，室温存放备用。
　　注意：避免污染（尘埃等）。
　　综上述方法处理的载片一般可存放半年以上。
　　五、封固剂
　　1．甘油-TBS及甘油-PBS
　　
　　配制方法：按比例将甘油和TBS（或PBS）充分混合后，置4℃，冰箱静止；待气泡排除后方可使用。
　　2．甘油-明胶（冻）
　　试剂：明胶　　　　 10g
　　甘油 　　　　　　　12ml
　　蒸馏水　　　　　　 100ml
　　香草酚　　　　　　 少许
　　配制方法：称取1g明胶于温热（约40℃）的蒸馏水中，充分溶解后过滤，再加入12ml甘油混合均匀。少许香草酚是为了防腐。
　　3．液体石蜡　　液体石蜡因含杂质少，很少引起非特异性荧光，故常用于荧光组化及免疫荧光法时标本的封固。
　　4．DPX
　　试剂：Distrene 　　　10g
　　酸二丁　　　　　　　 5ml
　　二甲苯　　　　　　　35ml
　　DPX为中性封固剂，用于多种染色方法匀不易褪色，但组织收缩较明显，故应尽量使其为均匀的一薄层。DPX现有商品出售，可直接应用。若感过于粘稠，也可加少量二甲苯稀释后应用。注意：二甲苯不可加得太多，二甲苯挥发后，片子上出现许多干燥的空泡，影响观察，遇有这种情况，可用二甲苯浸泡掉盖玻后重新封固。
　　六、酶消化液
　　1．0.1%胰蛋白酶
　　试剂：胰蛋白酶 　　　　　0.1gm
　　0.1%氯化钙（pH7.8）　　　100ml
　　配制方法：先配制0.1%的CaCl2,用0.1mol/L的NaOH将其pH调至7.8，然后加入蛋白酶溶解之。用前将胰蛋白酶消化液在水浴中予热至37℃（载有标本的玻片也在TBS中予热至同样样温度）。该消化液时间约为5～30min。
　　2．0.4%胃蛋白酶
　　试剂：胃蛋白酶 　　　　　400mg
　　0.1N HCl　　　　　　　　 100ml
　　配制方法：同胰蛋白酶。消化时间在37℃约为30min。
　　3．0.06% Pronase
　　试剂：Pronase　　　　　　　0.06g
　　0.05mol/L TB(pH7.5)　　 　100ml
　　配制方法：同前。
　　在免疫细胞化学染色中，有时经Formalin过度固定的标本，常会产生过量的醛基，遮盖抗原，影响一抗与抗原的结合。用蛋白酶溶液消化，可起到暴露抗原部分的作用。消化时间应根据不同组织而异，总之，在保持组织形态不被破坏的前提下，宜尽量延长消化时间。以上三种酶消化液中，以第一种最为常用。
　　七、其它
　　1．蔗糖溶液　　免疫细胞化学中应用的蔗精，常用浓度为5%～30%。一般光镜研究，仅用20%蔗糖处理已足矣，若制备电镜标本，在冰冻前最好经上行蔗糖（5%、10%、15%、20%及20%蔗糖-5%甘油等）处理，以确保其良好的细微结构。
　　（1）20%蔗糖液：
　　试剂：蔗糖 　　　　　　　　　　20g
　　0.1mol/L PB(pH7.5)　　　　 　　至100ml
　　配制方法：先以少许0.1mol/L的PB溶解蔗糖，再加0.1mol/l PB至100ml充分混合，置4℃冰箱保存。
　　该液多用于纯光镜研究。标本在刚放入浓度如此高的蔗糖液，常浮在上面，当标本沉到底部时即可。通常光镜标本浸泡在20%蔗糖液中过夜。都能达到要求。
　　（2）20%蔗糖-5%甘油：
　　试剂：蔗糖　　　　　　 20g
　　甘油 　　　　　　　　　5ml
　　0.1mol/L PB　　　　　　至100ml(约95ml)
　　配制方法：先用少许PB溶解蔗糖后，再加入甘油，充分混匀，最后补足PB至100ml，于4℃保存备用。
　　该液主要用于电镜标本的处理，常浸泡过夜（其它浓度的蔗糖中常分别为2h左右）。
　　蔗糖是一种廉价的防冻剂，兼有脱水的作用，它可减小标本在冰冻切片时冰晶形成的数量和大小，应用较多。

老大，你太厉害了……谢谢你了！！