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一、分析方法的选择：
常见的分析方法有:一点终点分析法,二点终点分析法,速率法,二点速率法。
1 一点终点分析法： 该法使用校正液,其原理是经过一定反应时间后,反应达到平衡时进行的一点分析。例如:双缩脲法测定总蛋白,溴甲酚绿法测定白蛋白均用该法。对于反应快的物质选用一点终点分析法。
2 二点终点分析法： 该法使用校正液,其原理是用二点的吸光度之差进行计算。多数项目选用该法。应用该法分两种情况。
2 .1 在单试剂分析中,测定波长同常见干扰物质的吸收光谱有重叠时(如脂血、溶血、黄疸样品),通过选用二点终点分析法可消除样品空白引起的干扰。例如:ＧＯＤ-ＰＯＤ法测定血糖,其测定波长为500ｎｍ,溶血样品中的血红蛋白在500ｎｍ有较强吸收,其吸光度大小在整个反应过程中保持不变,用反应完成时测定点的吸光度减去刚开始反应第一点的吸光度,这样就扣除了溶血产生的吸光度,消除了溶血对测定的干扰。
2 .2 在双试剂分析中,选用二点终点分析法可消除内源性物质的干扰。
3 速率法： 用于酶活力的测定。所有酶活力测定均选用速率法。其原理是根据酶所催化反应的速率来测定酶活力的大小。
4 二点速率法： 主要用于碱性苦味酸法测定肌酐。肌酐同苦味酸反应,其速率不成线性,因而不能用速率法。由于血清中的草酰乙酸能很快同苦味酸反应形成红色化合物干扰测定,随着反应时间的延长,血清中的维生素Ｃ、丙酮酸、蛋白质等也能同苦味酸反应形成红色化合物干扰测定。为了消除干扰,碱性苦味酸法测定肌酐要求在30秒和60秒两点测定,因而
选用二点速率法。
二、双波长测定中辅助波长的选择：
双波长的应用是为了消除样品中对测定有干扰的物质的影响,而实际应用中选择辅助波长主要用于消除脂血、溶血、黄疸的干扰。脂血样品中的脂质吸收光谱从300～600ｎｍ均有吸收,呈逐渐下降的趋势;溶血样品中的血红蛋白在350ｎｍ、400ｎｍ、540ｎｍ、580ｎｍ有4个吸收峰;黄疸样品中的胆红素在300～500ｎｍ均有吸收,在400～500ｎｍ之间有强吸收峰。由于脂血、溶血、黄疸样品在较宽的波长范围内有较强的吸收光谱存在,因而常常同测定波长有重叠,此时测得的吸光度包含待测物质的吸光度和干扰物质的吸光度,选用辅助波长可消除干扰物质的吸光度。在辅助波长选择中,根据测定波长选择辅助波长,要求干扰物质在测定波长同辅助波长有相同的吸光度。例如:钼酸铵法测定无机磷,其测定波长为340ｎｍ,对于溶血样品,血红蛋白在340ｎｍ有较强吸收,其吸光度同380ｎｍ处吸光度相同,选用380ｎｍ作辅助波长,用340ｎｍ和380ｎｍ两波长的吸光度之差测定无机磷,可消除溶血对测定的干扰。
三、测定时间的选择：
对于终点分析,测定时间的选择应充分考虑到干扰的问题。例如:溴甲酚绿法测定白蛋白选用一点终点分析法,白蛋白同溴甲酚绿反应快,在一分钟内基本上反应完全,随着反应时间的延长,α 球蛋白同溴甲酚绿反应形成干扰,因而溴甲酚绿法测定白蛋白,其测定时间应定于1分钟。对于速率分析法,一般用于酶活力的测定,而酶活力的大小是用反应速度来表示
,因而要求在零级反应期内测定反应速率,此时的反应速率不受底物浓度的影响,仅同酶活力大小有关。因此,测定时间应选在零级反应期内。对于一种物质的测定,由于选择试剂和分析方法不同,其测定时间也随之变化,因而对于特定的试剂和分析方法,应先做出反应进程曲线,从曲线上选择最佳的测定时间。
四、样品量和试剂量的选择：
对于不同的全自动生化分析仪,其测定所需的反应液总量不同。例如:荷兰ＶＩＴＡＬＡＢＳＥＬＥＣＴＲＡ分析仪要求反应液总量不低于250μｌ;日本7150型分析仪要求在250～400μｌ之间;日本7170Ａ型分析仪要求在180～380μｌ之间。而试剂厂商给出了样品量和试剂量的最佳比例,根据比例同时缩小或增加用量,同时满足最小的反应液总量。
五、校正点的设置：
对于多数项目的测定,其浓度同吸光度变化基本上成线性关系,选择低、中、高三个校正点可获得满意的准确度。如果只设置一个校正点,尽量选择一个中值校正点。对于有些物质,例如比浊法测定免疫球蛋白,其浓度同吸光度不成线性,因而需要尽可能多设置不同浓度的校正点。全自动生化分析仪的应用,提高了检验质量和速度,为临床作出诊断、决定治疗方案、判断疗效和预后提供了可靠依据,为了使用好全自动生化分析仪,最重要是恰当设置各种分析参数。随着分析方法的提高及试剂的更新,分析参数也随之变化。
（113华西医学1998;13(3) 李贵星 李 萍 徐克和） |
