纳米生物传感器的研究进展及其在生物医学领域的应用 王丽江 |
浙江大学生物传感器国家专业实验室，生物医学工程教育部重点实验室，生物医学工程与仪器科学学院在读博士研究生。 关键词: 纳米生物传感器
一 前言
在21世纪这个生命科学的时代，生物传感器(Biosensor)已经横跨了生物、化学、物理、信息等领域，综合了生物、材料、纳米、微电子等技术，因此成为当今交叉学科发展的前沿，被广泛应用于医学诊断、生物检测、食品安全、环境监测等领域，引起了世界各国科研工作者的广泛关注。纳米技术(Nanometer Technology)是在1~100nm之间的分子世界中研究物质的结构和性质的科学技术，该尺寸处在以原子、分子为代表的微观世界和宏观物体交界的过渡区域，基于此尺寸的系统既非典型的微观系统亦非典型的宏观系统，因此有着独特的化学性质和物理性质，如表面效应、微尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应等。将纳米技术引入生物传感器领域后，不仅提高了生物传感器的检测性能，并促发了一种新型生物传感器的诞生，即纳米生物传感器(Nanobio-sensor)。纳米生物传感器作为生物传感技术领域中迅速发展的新星，其敏感部位尺寸控制在1~100nm之内，能很好地改善原来传感器的化学和物理性质，大大提高其对生物分子或细胞的检测灵敏度，同时检测时间得以缩短，并可以实现高通量、实时分析监测。纳米材料是纳米技术发展的重要基础，它从根本上改变了材料的结构，出现许多不同于传统材料的独特性能，进一步优化了材料的电学、热学及光学性能，为克服材料科学领域中长期未能解决的问题开辟了新途径，是现代材料科学的重要组成部分。纳米材料的结构可以分为颗粒、纤维、管道、光纤以及薄膜和多孔体等多种类型，本文就是以纳米材料结构为基础，介绍了纳米生物传感器近年来国内外研究的最新进展及其在生物医学领域的应用。 二 基于纳米结构的纳米生物传感器
1. 纳米颗粒
纳米颗粒是生物医学领域应用最广的纳米材料，也是目前研究最多的纳米材料之一。实现对纳米颗粒的尺寸大小、粒度分布、形状、表面修饰的控制，是它们在生物传感器上应用的关键。例如将功能性纳米颗粒固定在生物大分子(如多肽、蛋白、核酸)上，可制成用于信号检测、转换或放大的纳米生物传感器，可分为声波、光学、磁性和电化学等种类。
a. 声波纳米生物传感器
声波传感器是基于声波在传感器基底材料内部或其表面传播的原理设计而成，通过声波频率改变来反映待测物质的一类共振式传感器。其中，在生物医学检测中应用最多的是石英晶体微天平(Quartz Crystal Microbalance，QCM)，其电极的表面固定识别分子，能特异地结合待测分子，引起电极表面的质量变化，从而改变石英晶体的振荡频率。如果在待测分子上修饰纳米颗粒，则会显著提高待测分子的质量，从而检测信号也会随之增强。结合DNA连接酶反应和纳米金放大技术，Pang等用QCM传感器来检测DNA点突变。捕获探针的5’端被固定在QCM的金电极表面，其3’端带有潜在的突变位点；与目标DNA杂交后加入金修饰DNA探针，则会形成双链的DNA。通过DNA连接酶反应和高温变性处理，如果目标DNA和捕获探针之间存在着错配，则QCM的频率将会回到捕获探针固定后的初始水平；反之如果完全匹配，由于纳米金的质量放大效应，根据Sauerbrey方程，频率则会降低(见图1)。应用该方法，可以检测到2.6×10－9mol/L浓度的寡核苷酸，由于其兼备简便和灵敏性，因此有望成为基因检测的一种新方法。近年来，有研究者将QCM和纳米金技术结合用于食品卫生监督和环境监测，我们试验室也做了相关工作，致力于开发用于检测大肠杆菌O157∶H7的纳米生物传感器。其中，我们将小粒径的纳米金固定在电极表面来增大原有的电极面积，以便固定更多的特异性的DNA探针，然后加入从细菌基因组中提出，并经不对称PCR(Asymmetry PCR)扩增的目标单链DNA进行杂交，在PCR的过程中该目标DNA的5’端被修饰上了生物素，由于由目标DNA引起质量变化太轻，需要加入亲和素包被的大粒径的纳米金来信号放大，通过频率的改变来反映细菌的浓度，我们可以检测到的最低细菌浓度是2.0×103CFU/L(见图2)。
b. 光学纳米生物传感器
表面等离子谐振(Surface Plas-mon Resonance，SPR)是表面定位生物传感技术的一种，当生物分子结合到敏感膜上时，谐振角度的变化可以反映检测物的浓度。Yuan等发现纳米金能够极大地提高mSAM/P4-OEG-OVA(混合自组装膜/孕酮—炔乙烯甘醇—卵白蛋白)修饰的SPR对孕酮的检测限，可以从原来的372.7ng/L降低到4.9ng/L；并且信号增强的效应受到纳米金粒径和距离电极表面距离的影响，其中10nm左右的颗粒放大效应最大。在Teramura的工作中，他们设计了用于检测脑钠肽(Brain Natriuretic Pep-tide，BNP)的SPR纳米生物传感器，能够检测到pg级水平的BNP。脑钠肽是一种主要由心室肌合成和分泌的心脏激素，具有利钠利尿和舒张血管作用，和心力衰竭密切相关。通过“三明治模型”，BNP被固定在电极表面；经链霉亲和素—生物素结合，50nm纳米颗粒结合到BNP二抗上，这样一种可以检测极低浓度脑钠肽的纳米生物传感器就构建成功，并可能用于检测人体其它低浓度的激素和肿瘤标志物(见图3)。
c. 磁性纳米生物传感器
磁性纳米颗粒在生物分离和检测有着重要的应用价值，通过磁性材料标记生物分子，结合分子识别技术，可以实现样品的混合、分离、检测等复杂操作。相比物理吸附，表面氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒可以极大地增加共轭结合的葡萄糖氧化酶的数目，并能提高和保持酶的活性，因此这种磁性纳米颗粒—酶共轭复合体可以作为一种葡萄糖纳米传感器来检测葡萄糖浓度。
d. 电化学纳米生物传感器
纳米技术和电化学技术的结合给电化学生物传感器领域的研究带来巨大的进步，近几年的发展表明，在蛋白质和核苷酸等生物分子的电化学分析中，应用具有电活性的纳米颗粒将会显著地提高灵敏度，并简化步骤和降低成本。Mirkin带领他的研究小组开发了一种基于银增强技术的DNA电化学检测阵列，如图4所示，在两个微电极之间20μm的间隙中固定了DNA捕获链，和目标DNA单链杂交后，加入修饰上DNA探针链的纳米金，这样三者之间形成典型的“三明治”杂交结构。在银增强溶液中，纳米金逐渐增大，继而形成回路，此时会出现电阻的急剧下降。利用这种方法，他们可以非常灵敏地筛选点突变，检测目标DNA的浓度可以低至500fmol/L。
2. 纳米导线
硅纳米线是一种一维纳米半导体光电材料，其线体直径一般在10nm左右，内晶核是单晶硅外层有一SiO2包覆层，由于其量子限制效应，表现出与体材料不同的物理性质，能够量子发光，且表面分布着高密度的悬挂键，能吸附大量的气体分子和生物分子。掺杂是硅纳米线实现应用的一个很有效的方法，通过掺杂一定的元素可以改善硅纳米线的性能，制造出实用的硅纳米线器件。Cui等对一种采用水溶液，具有直接、高灵敏及实时检测特点的B掺杂硅纳米线传感器的应用进行了研究，表明向真空室注入NH3等不同气体时，硅纳米线的电阻会发生不同的变化；在排出所充入的气体后，硅纳米线的电阻值可以恢复到以前的数值，证明所制备的硅纳米线化学传感器对NH3气、空气中的水蒸汽具有很好的检测能力。纳米线表面所吸附的生物大分子电荷将会影响纳米线电荷载流子的消耗与聚积，因此用纳米线制备的DNA传感器的灵敏度极高。Hahm等报道了可用于DNA检测，具有超灵敏、可选择性能的硅纳米线传感器的研究情况。此种硅纳米线DNA传感器可以进行无标记、实时、有效及选择性的检测浓度低于1×10－11mol/L的DNA。因此，这种类型的硅纳米线传感器为制备高集成、高通量的传感器阵列和进行DNA筛查检测提供了一条可行的方法。
3. 纳米微管和多孔纳米结构
微管和多孔结构可以保持生物分子的活性和提高分子的固定效率，而采用尺寸更小、比表面积更大的纳米微结构，可以进一步改善生物传感器的性能。
a.纳米微管
纳米微管的研究报道很多，其中，以碳纳米管的研究最热。碳纳米管有着优异的表面化学性能和良好的电学性能，是制作纳米生物传感器的理想材料。无论是单层碳纳米管(Single-Wall Nano Tubes，SWNT)还是多层碳纳米管(Multi-Wall Nano Tubes，MWNT)在生物传感器中都有应用。与常规的固态碳传感器相比，碳纳米管制作的生物传感器的灵敏度高、反应速度快，检测温度范围广。由于碳纳米管会强烈地吸附气体分子，同时宏观电阻发生较大的改变，因此将碳纳米管作为气体传感器的敏感元件测量其表观电阻的变化可检测气体成分。Kong等发现，用SWNT制成的微小化学探针，在室温下对低浓度的NO2和NH3分子能产生快速的吸附，灵敏度很高。可以预见，利用碳纳米管与气体分子间的相互作用可以制造出具有高敏感度和选择反应性的气体探针。以碳纳米管作为电导元件的新型生物传感器体积微小，反应迅速，有效检测面积被缩小到适应检测单个生物分子的水平，因为几乎所有的电流都通过检测部位，所以该种传感器具有高度的敏感性；更加重要的是，可以通过对碳纳米管的功能化修饰达到对生物分子进行特异性检测的目的。例如，人们利用SWNT独特的电学性质制成了纳米级的具有半导体性质的碳纳米管场效应晶体管(NTFET)。Star等发现，在加以电压时，NTFET表面的生物素与其配体链霉亲和素结合前后，FET中电流发生特征性的变化，其原理可能是蛋白分子与碳纳米管之间发生了电荷的转移。由于NTFET具有超微尺寸和对蛋白分子的高度敏感性，探测的数量级达到了10个蛋白分子左右，使原有的检测量进一步微量化了。
b. 多孔纳米膜
对单晶硅进行电化学腐蚀可以得到具有纳米孔径的多孔硅，这种材料在室温下可发射可见光，具有高比表面积以及与现有硅加工技术相容等优点，是近年来发展起来的一种新型光电子材料。前一优点增加了可固定敏感分子的数量，从而提高了灵敏度，后一优点则便于各种形式的微加工和大规模生产。很多工作者在气敏多孔硅传感器研制上开展了工作，其原理是利用了气体对多孔硅的电压—电流特性的影响。如Baratto等人利用多孔硅技术制备的传感器对NO及NO2的检测下限已达到ppm(10－6)级的水平，同时数千ppm级的CO、CH4及甲醇对测试的干扰可以忽略。他们还研究了多孔硅在NO2测试中的稳定性问题，发现通过氧化使多孔硅表面失活，传感器的可逆性提高，并且对水分敏感性降低。Massera等采用预先用NO2预处理PS膜的方法，缩短了器件对气体的响应时间及恢复时间。我们实验室结合光寻址电位传感器(Light Addressable Potential Sensor，LAPS)及纳米多孔硅技术研制了一种新型的气体传感器，该传感器综合了光寻址电位传感器的微机电系统工艺和平面器件特点以及纳米多孔硅的高灵敏度特性，为实现进一步细胞代谢气体的检测提供了一种可能的手段。初步实验结果表明，在室温条件下，该气体传感器对于乙醇气体具有较明显的响应，并具有一定的浓度梯度特性，证明该传感器的设计是可行的。
4. 纳米光纤
在生物医学检测中，传统的生物传感器体积较大，仅能用于组织、细胞悬液等的测量，当检测样品的尺寸缩小到微米级时，如检测活细胞或其它亚细胞组分时，实时、准确、无干扰地测量样品内化学和自然成分变得极为困难。随着纳米光纤探针和纳米敏感材料的技术逐步成熟，运用纳米光纤探针和纳米级的识别元件检测微环境中的生物、化学物质成为可能。运用这种高度局部化的分析方法，能够监测微环境(如：细胞、亚细胞结构)中各成分浓度的渐变以及其在空间的不均一性。目前研究较多的纳米光纤生物传感器有光纤纳米荧光生物传感器和光纤纳米免疫传感器两种，前者具有荧光分析特异性强，敏感度高等优点，而且无需用参比电极，使用简便、体积微小等诸多优点，具有广泛的应用前景。而后者更是将光学、免疫学和纳米技术有机结合，既弥补了目前常规免疫检测方法不能进行定量检测的缺点，同时还能实时监测抗原抗体反应，无需进行分离步骤，便于抗原抗体反应的动力学分析。另外，由于抗原抗体反应是高度特异性的，从而减少了环境中的非特异性干扰，所以相对其它传感器，它具有更高的特异性，且其敏感部尺寸仅为纳米级，故能用于检测传统光学免疫传感器无法检测的细胞内物质。
5. 纳米微加工
纳机电系统(Nano Electro Mech-anical System，NEMS)是基于微机电系统(Micro Electro Mechanical System，MEMS)技术而提出的一个新概念，是指在特征尺寸和效应上具有纳米技术特点的一类超小型机电一体的系统。甚至可以理解为纳米尺度上的机械设备、电子器件、计算机和传感器，是MEMS在纳米尺度上的再现。但是，微观世界的一些特性使NEMS和MEMS区别很大，首先，NEMS器件可以提供很多MEMS器件不能提供的特性和功能，比如超高频率、低能耗、高灵敏度、对表面质量和吸附性的前所未有的控制能力，以及在纳米尺度上有效的驱动方式。但是在小尺度下产生的一些新的物理特性将影响器件的操作方式和制造手段。与MEMS相比，NEMS对微加工技术提出了更高的要求，具体说就是研究的材料范围更宽，加工过程的空间分辨率更高。NEMS技术与生物领域的结合是伴随着一个被称为BioNEMS新概念的出现而产生的，加州理工大学和麻省理工学院的科学家团队正致力研究BioNEMS领域的纳米尺度悬臂梁，以鉴别生物体独一无二的动态标识。IBM公司和瑞典Basel大学的研究人员正在开发一种新型的纳米微悬梁生物传感器，利用DNA分子的双螺旋机构作为分子特异性识别能力的模型。器件的核心是硅悬梁天平阵列，长500μm，宽100μm，厚度为1μm。当生物分子结合时，悬梁臂开始弯曲，通过激光反射技术，10~20nm的弯曲都能被检测到。在悬梁天平阵列表面固定具有不同识别性的分子，构成阵列式生物传感器，可以同时检测多项指标(见图5)。
三 结束语
纳米技术和生命科学是21世纪最前沿的两大学科，纳米技术的介入为生物传感器的发展提供了无穷的想象。纳米技术在生物传感器的发展趋势是集成多功能、便携式、一次性的快速检测分析机器，可广泛用于食品、环境、战场、人体疾病等领域的快速检测，如食品和饮料中病原体或者农药残留成分的快速灵敏检测，环境中污染气体或者污染金属离子等远程检测和控制，人体血液成分和病原体的快速实时检测，人体健康的长期监测(如糖尿病患者血液中糖成分的长期监测等)，以及战场生化武器的快速检测(如对炭疽病毒的检测等)。多种生物传感器的集成或者生物传感器阵列是生物传感器发展的另一个趋势，例如微电极阵列对二维微环境的检测等。分子自组装聚合物加工的研究呈上升趋势，其加工工艺简单可控，可以实现快速复制，而且成本较低，对生物传感器的发展有很重要的促进作用，有利于高灵敏度、低成本、一次性的纳米生物传感器的发展。但是纳米生物传感器的研究中面临着一些核心问题，如传感器的性能严重依赖于纳米材料，而且使用重复性有待提高；在NMES的研发中，微观效应对NMES器件的影响究竟有多大，微小尺寸系统中操作力和控制力最终能达到什么样的水平等问题也需要进一步解决。总之，纳米生物传感器在生物医学领域，将为正在兴起的纳米医学和纳米生物技术，提供不可替代的实验手段，有理由相信随着纳米技术、生物技术的不断发展，纳米生物传感器将成为生物传感器发展的方向，引起更多科研工作者的热心关注。 （全文完） 来源：《世界医疗器械》 出版日期：2007年8月 | 
