钟蔚女士，硕士，中山大学达安基因股份有限公司战略投资部经理；何蕴韶先生，教授，博士生导师，中山大学达安基因股份有限公司董事长。 关键词: 诊断试剂 生化诊断 免疫诊断 分子诊断
一 诊练断试剂的概念及分类
1. 诊断试剂的概念
诊断试剂(Diagnostic Reagent)也指离体诊断试剂，是指医疗诊断上用来收集、处理、检查及分析检验的在试管内或仪器内发生反应而进行检测的用药。
2. 诊断试剂的分类
根据试剂所采用的技术原理，主要可分为三大类：生化诊断试剂；免疫诊断试剂；分子诊断试剂。
按照诊断试剂功用来分，诊断试剂可以分为心血管类检测试剂盒、性病检测试剂，肝炎系列产品、肿瘤标志物检测试剂、优生优育检测试剂等大类。
二 临床诊断试剂技术进展
临床诊断试剂分为生化诊断试剂、免疫诊断试剂和分子诊断试剂及其它。其中以生化诊断试剂所占份额最大，临床应用接近34%。其次为免疫试剂，占29%。分子诊断试剂的份额较小，不到10%，但近年发展速度最快。
1. 生化诊断试剂
1985年第一批国产酶法诊断试剂问世以来，目前国内生化诊断试剂企业所生产的试剂品种主要集中在临床普遍开展的大约40个生化检验项目上，已步入技术成熟阶段(表1)。
2. 免疫诊断试剂
a. ELISA/EIA试剂
酶联免疫/酶免诊断(ELISA/EIA)试剂是临床检验常规的检测技术。目前，酶免试剂是传染病血清学标志物(如肝炎、艾滋、致畸病原Torch)、肿瘤标志物及内分泌等各种临床免疫指标检测的主导试剂(表2)。
b. 胶体金试剂
胶体金试剂具方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点。胶体金诊断技术发展趋势在于：
(1)提高胶体金质量：改善制胶体工艺，选用适当的试剂进行稳定金标记物，正确地干燥金标以提高检测准确性、减少假阳性(假阴性)。
(2)实现多项联检：现在技术可达到用一膜包被多元抗体带的方法研制出可同时检测7种药物的免疫层析试纸条，能对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、艾滋病病毒抗体和抗原(抗HIV/HIV-1/2P)，及丙型肝炎抗体(抗HCV)等进行同时检测，对筛选献血者提供了很大便利。
(3)提高检测灵敏度，拓宽检测范围：结合电化学设备等手段来拓宽其检测范围。
(4)定量测定：监控临床指标或确定特定分析物的相对或绝对浓度都需要定量检测。
(5)在生物传感器中应用：通过在生物分子上连接的酶，在一定条件下催化某一反应底物，产生一种非导电性物质，沉积于电极表面，使电极表面的阻抗增加，达到放大信号的目的。还可在胶体金标记A蛋白的基础上，制作电化学免疫传感器，检测血清中的森林脑炎病毒抗体及其浓度(表3)。
c. 化学发光试剂
化学发光免疫分析是将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免疫反应结束后，加入氧化剂或酶底物而发光，通过测量发光强度，根据标准曲线测定待测物的浓度。化学发光免疫试剂分为三种类型：
(1)化学发光免疫分析试剂：鲁米诺类和吖啶酯类化学发光试剂是最常用的标记发光试剂，在免疫及分子诊断领域得到广泛的应用。
(2)化学发光酶免疫分析试剂(CLEIA)：CLEIA应属酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂，操作步骤与酶免疫分析完全相同。目前，常用的酶标记物有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)。
(3)电化学发光(ECL)免疫分析试剂：是化学发光和免疫测定的结合，其标记物稳定，灵敏度高，可实现多元检测，可实现均相免疫分析，可实现全自动化。目前已广泛应用于抗原、半抗原及抗体的免疫检测(表4)。
d. 单克隆抗体
作为医学诊断试剂，单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。目前单抗在诊断试剂盒的主要用途如下：
(1)诊断各类病原体：应用最广，如用于诊断乙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物感染的试剂等。尤其是在鉴别菌种亚型、病毒的变异株以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面具有独特优势。
(2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测：用于肿瘤的诊断，分型和定位。肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白和癌胚抗原)的单抗已用于临床诊断。也有人利用单抗进行肿瘤分型，对制定治疗方案和判断预后也有帮助。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗主要用于体内诊断，结合X射线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶做出定位判断。
(3)检测淋巴细胞的表面标志；用于区分细胞亚群和细胞分化阶段。例如检测CD系列标志，有助于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，对多种疾病诊断具有参考意思仪。对细胞表面抗原的检查在白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面也有指导作用。组织相容性抗原是移植免疫学的重要内容，而应用单抗对HLA进行位点检查与配型，可得到更可信的结果。
(4)机体微量成分的测定： 应用单抗和免疫学技术，可对机体的多种微量成分进行测定，如诸多酶类、激素、维生素等，对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和治疗均有实际意义。
3. 分子诊断试剂
分子诊断是采用DNA，RNA或蛋白标记(分析子)来识别疾病，判定其阶段和反应以辅助治疗，或预测个体对某疾病的易感程度。目前国内分子诊断试剂正在迅速崛起。
目前的分子诊断产品主要是由单一疾病的分子标记设计的检测。
分子诊断的主要应用范围为：传染性疾病分子诊断、遗传性疾病分子诊断、肿瘤分子诊断。
分子诊断试剂以其准确，灵敏度高而有着不可替代的优势，但现有分子诊断对操作人员和设备、使用环境要求相对较高。简单、快速便于普及的快速诊断正随着农村合作医疗的深入开展，成为分子诊断试剂的新发展趋势，目前产品种类尚少。
分子诊断试剂的另一个发展趋势是采用多通道平台，如DNA和蛋白微阵列来执行平行标记分析，包括同时测定几类生物标记(如DNA和蛋白质)，并将朝自动化和小型化发展，结合新技术，进行超灵敏的定量检测，在多项诊断应用中增加灵敏度并降低成本，使免疫测定和核酸检测可以在同一台仪器完成。理论上，使用者可以不必知道化验对象需要采用何种诊断方式。
三 临床诊断试剂应用进展
1. 心血管诊断试剂
a. 反映心肌损伤标志物
对于急诊胸部不适疑为心肌梗死的患者，目前临床多根据症状、心电图结合血液心肌损伤标志物如肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)、肌红蛋白(Mb/Myo)及心肌肌钙蛋白(cardiacTrop onin，cTn)I或T等进行诊断与鉴别诊断。这些标志物在正常情况下存在于心肌细胞中，心肌梗死发作后释放入血，若在血中发现这些物质水平升高则表明有心肌损伤存在。
b. 了解心脏功能的标志物
钠尿肽又称脑钠肽(BNP)是调节体液、体内钠平衡、血压的重要激素，当心血容积增加和左室压力超负荷时即可大量分泌，检测BNP或NT-proBNP有助于确立心力衰竭的诊断。
c. 预测心脏危险事件的标志物
临床测定血清总胆固醇(TC)以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C，也称“坏胆固醇”)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C，也称“好胆固醇”)和甘油三酯(TG)，甚至血清载脂蛋白AI、B及脂蛋白(a)等项目水平对心脏事件的危险评估都是非常重要的。
C反应蛋白(CRP)是一种炎性标志物，CRP升高的病人，其心脏病发作、猝死及血管疾病的危险性增加。
此外测定脂蛋白磷脂酶A2(LP-PLA2)水平是否升高，可预示动脉是否有斑块形成和有否破裂危险性。
2. 性病系列诊断试剂
目前，我国企业自主研制且获得生产批准的HIV诊断试剂种类包括：HIV 抗体酶联免疫检测试剂、HIV抗体快速检测试剂、HIVp24抗原检测试剂、HIV病毒载量检测试剂(荧光法)以及HIV抗体确认试剂等，相应产品的研制正在进入第四代。
第一代HIV抗体诊断试剂主要是用天然HIV抗原包被在微孔板或载玻片上，与检测样品中的特异抗体结合，用酶或荧光标记抗人IgG 抗体作为标记的第二抗体，检测HIVIgG抗体。
由于抗原通常会含有宿主细胞的成分，从而造成假阳性。由于杂蛋白的存在会与抗原竞争包被位点，因此，第一代试剂的灵敏度受到了一定的限制。
第二代HIV诊断试剂主要使用基因工程重组和/或人工合成多肽作为包被抗原，基因工程抗原主要是采用大肠杆菌等系统表达的HIV-1型抗原，多肽合成抗原主要包括合成的HIV-1型抗原片段和HIV-2型的gp36多肽。与第一代试剂相比，第二代HIV诊断试剂的灵敏度明显提高，但由于采用间接法，其灵敏度仍存在局限性，也有一定的假阳性。
第三代HIV诊断试剂主要使用基因工程重组抗原并采用双抗原夹心法的原理检测抗HIV 的总抗体。第三代试剂可同时检测抗-HIV 所有类型抗体可以起到缩短窗口期的作用，提高了试剂的敏感性，同时特异性也得到了提高。
第四代HIV诊断试剂是在第三代试剂的基础上，加入HIV-1p24抗原检测系统，可同时检测血清/血浆中HIV抗体和p24抗原，进一步缩短了检测的窗口期。
除HIV诊断试剂外，目前针对梅毒的诊断试剂以TPHA试剂为代表，其原理是针对梅毒螺旋体特异性抗体的血球凝集试验，血球表面包被有梅毒螺旋体天然抗原，直接检测患者血液中特异性抗体。
3. 肝炎系列诊断试剂
a. 乙型肝炎诊断进展
乙型肝炎血清学标志检测是诊断乙型肝炎的主要方法。一般检测血清中乙型肝炎病毒的蛋白质，也就是乙型肝炎病毒的抗原或抗体。
以往检测的方法主要有琼脂免疫扩散，对流免疫电泳、补体结合实验、反向间接血凝、免疫粘附血凝、免疫电镜、放射免疫自显影、免疫酶法，其中免疫酶法敏感性高。以上检测技术现在大多已淘汰。目前应用的主要检测技术是酶联免疫吸附实验，免疫胶体金法等。
近年来发展建立了多种敏感准确地定量检测乙型肝炎病毒脱氧糖核酸(HBV-DNA)的方法，根据其原理主要分为荧光标记PCR技术和酶标记探针定量PCR技术。前者自动化程度高、省时、可免除PCR 的后处理、减少PCR产物的污染，已成为定量检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的主要方法。但目前还不能用HBV-DNA 定量检测完全取代乙型肝炎e 抗原检测系统。
乙型肝炎病毒前S1 抗原(PreS1)是近几年来发现的乙型肝炎病毒早期诊断的标志物。乙型肝炎病毒前S1抗原是HBV-DNA 的S区的前S1基因编码产物，前S1抗原仅存在于具传染性的完整的乙型肝炎病毒颗粒上，由于PreS1只存在于丹氏颗粒，故有很高的特异性。用微粒子酶联免疫分析技术法检测乙肝二对半和用酶联免疫吸附试验法检测乙型肝炎前S1抗原的指标将互为补充。
b. 丙型肝炎国产诊断试剂进展
目前防止丙肝传播的唯一有效手段是利用高质量的丙肝诊断试剂(抗HCV EIA试剂)阻断带毒血液进入人体或被用于生产血液制品。
4. 肿瘤标志物检测试剂
a. 常用肿瘤标志物及进展
近年来，肿瘤标志物〔癌基因、抑癌基因和肿瘤相关基因及其产物，循环核酸(DNA和mRNA)标志物〕检测及应用已进人分子和基因水平阶段。蛋白质组学成为肿瘤标志物研究的热点。血清肿瘤标志物已成为肿瘤患者实验室检查的重要指标(表5)。
b. 肿瘤标志物的联合检查
由于肿瘤标志物缺乏组织特异性，同一肿瘤可出现几种标志物，而不同肿瘤又可出现同一种标志物。为提高肿瘤标志物的临床应用价值，根据不同肿瘤和不同标志物的特性，合理选择多种标志物联合检测非常重要。需注意的是，联合检测提高了敏感性，但特异性有所降低，因此应选择特异性强的标志物进行组合。目前不少肿瘤标志物的临床价值尚不明确，并缺乏标准化的试剂、质控标准和测定方法，不加选择地进行多种标志物联合检查，不仅达不到提高检测效率，还会增加检测成本。应选择常见肿瘤的最佳标志物组合应用于临床诊断(表6)。
c. 恶性肿瘤的循环核酸基因标志物
循环核酸是指存在于外周血循环中的游离DNA和mRNA。近年研究证实，肿瘤患者循环DNA和mRNA具有肿瘤特征，应用PCR或RT-PCR检测肿瘤循环核酸，对肿瘤的早期诊断、微转移监测具有重要价值。与传统的肿瘤相关抗原检测相比，循环核酸检测敏感性高、特异性强。
d. 蛋白质组技术检测分析肿瘤标志物
蛋白质组技术能高通量、自动化地对肿瘤蛋白质表达谱进行全面分析，有助于发现肿瘤早期诊断的特异性分子标志。目前蛋白质组技术主要有双向凝电泳、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱和表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)，能快速、灵敏、高通量、自动化分析血清中蛋白质谱型的变化，已应用于检测前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、直肠癌等。
我国已研制出多肿瘤标志物蛋白芯片，应用微阵列原理，采用化学发光免疫膜技术和计算机图像分析，实现多肿瘤标志物的高通量、并行性联合检测和综合分析，可快速、同时检测多种肿瘤标志物，显著提高了肿瘤诊断的敏感性和特异性。临床应用多肿瘤标志物蛋白芯片检测卵巢癌、大肠癌、肺癌的诊断阳性率分别达90%，85%和80%。对肿瘤患者的疗效观察、转移复发监测也具有很高的应用价值。
5. 优生优育类诊断试剂
a. 在妊娠早期筛查唐氏综合征胎儿的新方法
新方法可以发现胎龄只有3个月的患儿，包括检测母体的妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)、人绒毛膜促性腺素(HCG)水平和用超声的方法测量胎儿颈后皮肤(颈透明带)。美国国立卫生研究院(NIH)评估认为，这种方法在妊娠前3个月的检出率可达85%，而目前常规用于筛查唐氏综合征的方法在妊娠4~6 个月期间的检出率为65%。目前常规筛查方法的假阳性率约为5%，这对那些得到假阳性诊断的妊娠妇女及其家庭无疑是一个打击。
b. 斑点金免疫渗滤法检测血清抗精子抗体
采用经SephadexG-75-抗人全血清柱亲和层析纯化的人精子抗原和胶体金标记的SPA，根据免疫渗滤原理，建立抗精子抗体(ASAb)的斑点金免疫渗滤法检测法。结果证明纯化的人精子抗原具有较好的特异性；斑点金免疫渗滤法与ELISA法比较，符合率为97.7%。特异性为96.2%，敏感性为88.9%，阳性预测值84.2%，阴性预测值97.2%。斑点金免疫渗滤法方法检测血清抗精子抗体有较好的特异性和敏感性，重复性好，试剂稳定，操作简便快速，具有临床应用价值。
6. SARS诊断试剂
a. PCR试剂盒
(1)反转录PCR(RT-PCR)试剂盒：采取患者的鼻咽部洗液，肺泡灌洗液，肺穿刺液，咽部拭子痰、血、尿、便等进行基因扩增。美国大规模启用的非典病毒快速检测试剂也是采用了RT-PCR技术。RT-PCR 可作为早期检测法，特别对于如SARS这样的呼吸道传播的病毒性传染病能作到早诊断、早隔离，控制传染源的目的。但该法存在假阴性、假阳性的问题。
(2)荧光定量PCR试剂盒：其基本原理与普通PCR相同，只是定量体系不同。该技术借用荧光信号来检测PCR产物。一方面提高了灵敏度，另一方面还可做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立扩增曲线，准确确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数。该试剂盒除了用于非典流行病源的筛查，环境污染的检测和临床应用外，还用于海岸检验检疫，如动植物、食品、血液制品的非典病毒的核酸检测。
(3)其它PCR试剂盒：如荧光聚合酶链反应(F-PCR)来检测SARS病毒的方法，该试剂盒可检测出SARS-COV核酸且有较高的灵敏度、重现性、稳定性和特异性。
与免疫学检测相比，PCR试剂盒检测可不受病人体内有无抗体，抗体多少的限制。只要病人被感染，其血液、唾液等标本中就含有病毒，即使还在潜伏期也可通过PCR检测出来。但是定量PCR价格高，不利于大面积早期筛查，检测、诊断。
b. 抗体试剂盒
(1)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒：检测SARS病人血清中IgM、IgG。在感染早期检测不到抗体，最早IgM检测要在7 d左右，IgG要在10 d后。发病后21 d后可获得阳性结果。
(2)免疫荧光检测(IFA)试剂盒：以生长在细胞内已灭活的病毒为抗原，将SARS感染细胞固定体患者抗体与抗原结合后用免疫荧光标记的二抗来检测。用免疫荧光显微镜观察。发病10 d后，就能进行检测，主要适用于冠状病毒感染的辅助诊断。
(3)其它抗体检测试剂盒：抗体金诊断试剂盒、基于单克隆抗体试剂盒——“人T淋巴细胞亚群双色荧光标记单抗分型试剂盒”可在1 h内检测出非典病人血液中CD4降低和CD4/CD8比值。不仅为确诊提供临床依据，且对后续抢救、治疗、检测治疗效果和病程有指导意义。
7. HTLV诊断试剂
人类T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV)已被证实与成人T淋巴细胞白血病和多种神经系统疾病密切相关。试剂盒对现有能获得的全部HTLV血清的灵敏度达100%，其特异度达 99.94%。
四 中国诊断试剂的产业发展
全球体外诊断试剂2005年的市场达到73亿美元，且仍在以并以16.6%的速度增长，而我国临床诊断市场的年增长率高达15%~20%。
中国的医用诊断试剂市场上，据不完全统计，至2005年5月，中国批准上市的(包括国产和进口)主要医用诊断试剂产品共有490种，其中，医用酶免试剂产品213种、快速诊断及PCR试剂品种95种、常用化学发光试剂64种、放免试剂品种118种。
我国诊断试剂产业的发展近期目标，最重要的就是要建立诊断领域一系列高水平科技平台，包括：诊断用基础材料，如工具酶、抗原、抗体和高分子材料等；诊断用基础材料与其它材料或技术相结合所建立的诊断用方法(如临床生化、免疫化学等)；诊断用全自动或者半自动的仪器及配套试剂；评价、验证或监督临床检验医学诊断试剂、仪器等的实验室网络或参考体系等。而诊断试剂产业发展的远期目标，则是在高水平的诊断技术平台基础上，研制开发更多具有我国自主知识产权的高水平诊断试剂。 （全文完） 来源；《世界医疗器械》 | 
