[转帖] PCR技术概论

PCR技术简史 PCR技术的基本原理 PCR反应体系与反应条件 PCR反应特点 PCR扩增产物的分析

　　聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

PCR技术简史

　　PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

　　PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

　　PCR的改进与完善　Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

　　1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。

　　1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

PCR技术的基本原理

　　PCR技术的基本原理　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

　　(Plateau)。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝

　　PCR的反应动力学　 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)ⁿ计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

　　PCR扩增产物 　可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸， 其5'端是固定的，3' 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时， 由于新链模板的5'端序列是固定的， 这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加， 而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系：

　　　10×扩增缓冲液 　 10ul 　　　4种dNTP混合物 　 各200umol/L 　　　引物 　　　　 　 各10～100pmol　 　　　模板DNA 　　　 　0.1～2ug　 　 　　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　 　　　Mg²⁺　　　　 1.5mmol/L 　　　加双或三蒸水至 　100ul 　　PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg²⁺

　　引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

　　①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 　　②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 　　③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 　　④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 　　⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 　　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 　　⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

　　引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

　　酶及其浓度　目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

　　dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg²⁺结合，使游离的Mg²⁺浓度降低。

　　模板(靶基因)核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

　　Mg²⁺浓度　Mg²⁺对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg²⁺浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

PCR反应条件的选择

　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

　　温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： 　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃) 　　在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

　　③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性： 　　　　　　　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 　　　　　　　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子 　　　　　　　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子 　　　　　　　　　　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。

　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

　　循环次数　　循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

PCR反应特点

特异性强：

　　　PCR反应的特异性决定因素为： 　　　①引物与模板DNA特异正确的结合； 　　　②碱基配对原则； 　　　③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 　　　④靶基因的特异性与保守性。

　　其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 灵敏度高：

　　PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

简便、快速：

　　PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

对标本的纯度要求低：

　　不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。

PCR扩增产物的分析

　　PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。

　　凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。

　　琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂糖凝胶， 供检测用。

　　聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。

　　酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。

　　分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。

　　Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。

　　斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。

　　核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。

PCR 简介

一、PCR技术于1985年由美国分子生物学家Kary Mullis及其同事发明。1988年该项技术正式商品化。发明人于1993年荣获诺贝尔化学奖。

二、PCR全称为Polymerase chain reaction(聚合酶链反应)，即快速体外基因扩增技术。被列为九十年代“十大生物学热点之冠”。

基本原理及步骤：

1. 高温裂解标本，经处理游离出DNA或RNA。

2. 在DNA聚合酶作用下，引物与特定DNA片段结合，并利用单核苷酸继续合成DNA链。（RNA则还需经过反转录过程）

3. 经过几十次裂解、退火、延伸的循环，复制出原有基因段10¹⁰倍量以上的相同基因。

4. 将扩增出的产物在上电泳，由此可检测出原标本中是否含有待检的特定基因（遗传病基因、病毒、病原体、肿瘤基因等）

特点：灵敏度高，特异性强，操作简便快速。

　

三、PCR技术应用十分广泛，可用于分子生物学、遗传工程、肿瘤学、法医学、预防医学及病毒和病原体的诊断等各个领域。

临床应用举例：

1. 遗传病诊断：α型、β型地中海贫血症，血友病以及苯丙酮尿症的产前胎儿诊断等。

2. 病毒感染疾病诊断：肝炎病毒系列(HAV、HBV、HCV、HDV、HEV等)，艾滋病毒(HIV-I)、人乳头瘤病毒(HPV)、人巨细胞病毒(HCMV)、风疹病毒(RV)、单纯疱疹病毒(HSV)、EB病毒(EBV)等。

3. 传染性病原体检测：沙眼衣原体、肺炎支原体、立克次氏体、真菌、梅毒螺旋体、疟原虫、弓形体、结核杆菌、分枝杆菌等。

4. 肿瘤基因检测：癌基因、抑癌基因、肿瘤药敏基因等。

四、PCR技术于1988年前后在中国已有少数分子生物学实验室开始应用，在医院单位作为一项检测新技术则是1992年开始出现。其发展迅速，现在在沿海地区相当多数医院及内地大城市大医院都有开展，而且有向中小型医院迅速普及的趋势。事实上，从1996年起已开始出现全国“PCR热”。

五、PCR检测项目收费标准：依各地情况不同而从60元/项到120元/项不等。不同项目亦有不同，如丙肝检查可收费高至250元。试剂、消耗品成本：DNA项目平均不超过20元/项；RNA项目平均不超过50元/项。

六、建PCR实验室所需条件：

⑴ 实验仪器：

a. PCR扩增仪

b. 台式高速离心机

c. 紫外透射反射分析仪

d. 稳压稳流电泳仪

e. 水平电泳槽

f. 无菌操作台

g. 水浴锅

h. 漩涡振荡器

i. 高精度微量移液器

j. 0.2ml或0.5ml PCR反应管、加样器吸头等

⑵ 试剂：

应用于不同项目的PCR试剂盒。

⑶ 实验室环境要求：

1－2间专用实验室，空调、冰箱等。

七、PCR技术的关键：PCR扩增仪

用户在挑选PCR仪时应注意的几个关键问题：

⑴ 控温装置先进、技术稳定可靠，

⑵ 升降温速率不能太慢(影响扩增结果、反应效率等)，也不能太快(影响酶活力等)，以0.5℃～2.0℃/秒为好。

⑶ 控温精度范围应小于±1.0℃。

⑷ 孔间温差均匀度范围应小于±1.0℃。

⑸ 电脑系统应便于操作，有记忆功能。

⑹ 使用寿命长。

⑺ 价格合理，高性能/价格比。

⑻ 生产厂家和经销公司能提供完善的质量保障及售后服务。

　

八、常见PCR仪所采用的控温装置：

⑴ 固定温度式

a. 水浴槽分别控温(机械臂移动、三水箱式)

b. 金属槽块分别控温(机械臂移动、三或四金属槽块式)

⑵ 热空气加热和风扇制冷

⑶ a. 电热丝加热和水循环制冷

b. 电热丝加热和压缩机制冷

c. 电热丝加热和风扇制冷

d. 电热丝加热和Peltier元件制冷

⑷ Peltier元件加热和制冷

PCR产物克隆方法

平端连接

　　通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高，。在采用大量T4DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物，用PUS19的HincⅡ位点进行克隆，以X－gal和IPTG筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法克隆PCR产物。

粘端连接

　　引物中设计入限制酶位点：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互补碱基，因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计不同酶切位点时，可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长PCR引物，除限制酶识别序列外，还需要在其5'端多合成3-4个碱基以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合。即使如此，其酶切效率也不够高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等较为难切。采用突变PCR方法可克服上述缺点。该方法是通过在两PCR引物序列中改变1至数个核苷酸创造出一个限制性内切酶位点。鉴于PCR引物的3'末端序列的互补性是PCR成功的关键，在PCR引物的中部或近5'端改变1个或几个碱基对PCR扩增效果影响不大。这种方法不需要增加PCR引物的长度，而且酶切效果优于5'加端法。对于特定DNA片段的克隆，此方法较为经济、实用。但对于基因诊断PCR产物的克隆，似乎5'加端法更为适宜。

　　T4DNA聚合回切产生粘端：如PCR两引物的5'末端是A或T，则可在其5'端分别加上CG和CCGG。用此二引物扩增的PCR产物在dATP和dTTP存在的情况下，用T4DNA聚合酶进行处理，则T4DNA聚合酶因具有3'→5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，产生AccI和XmaI粘性末端（图1）。此DNA片段直接与用AccI和XmaI切开的载体进行连接。这种方法只需在PCR引物的5'端加2-4个碱基，但其可选择的限制酶类有限。

T－vector法

　　TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3'末端加一个碱基，所加碱基几乎全是腺苷。据此，Marchuk等人采用3'端突出一个胸苷的质粒DNA来克隆PCR产物，其克隆效率比平端的连接至少高出100倍。他们用EcoRV将pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的两个3'末端各加一处胸苷。因

　　为在4种dNTP都存在时，Taq聚合酶选择性参入dATP，而当仅一种dNTP存在时，它只能参入该种碱基。因此，在只加入ddTTP时，用TaqDNA聚合酶可使平端载体DNA转变成3'末端突出一个胸苷的T尾载体，称为T－vector。用这种T－vectorsk可以较有效地直接克隆PCR产物。Hotton等人也报道了另一种制备T－vector的方法。他们使用脱氧核苷酸末端转移酶在切成平端的载体DNA的3'末端加上一个胸苷。由于末端转移酶可以催化多个碱基（ddTTP）作为底物，使平端载体DNA分子的两个3'末端各加上一个T。用这种方法制备的T－vector的不同之处在于前者3'末端不能与待克隆PCR产物的5'末端连接，仅5'末端可与PCR产物的3'末端形成磷酸二脂键。

共环消解法

　　最近，Jung等人报道了一种有效的PCR产物克隆方法。用磷酸化的PCR引物扩增得到的PCR产物，先用T4DNA连接酶催化连接反应，使5'端带有限制酶切位点的扩增DNA片段连接成共环结构。然后再用相应的限制酶进行消化，产生粘端DNA片段。对于对称性限制酶位点，只需在引蛾的5'末端加上一关识别序列，因为在串接成共环后能恢复限制酶切位点难于切开的缺点，且可用于双限制酶切位点的设计，只不过有PCR产物共环化后，仅约1/4的限制酶切点得以恢复。故此法较适用于单限制酶位点的克隆。

　　无连接酶亚克隆法(A)无连接酶克隆法（ligase-free subcloning，LFS）是利用引物5'末端附加碱基修饰法，修饰碱基不是酶切位点，而是与某一质粒两端分别互补的碱基。两引物的3'端约20-25个核苷酸分别与待扩增DNA两翼互补，5'端各有约24个核苷酸分别与线性化质粒的3'端相同的附加序列。由于线性化质粒的3'端序列各不相同，PCR片段可以通过选择各引物的合适5'附加序列与引物3'端定向杂交。

　　由此物a和b产生的两端有附加序列的PCR产物与未反应引物分离后，分别加入两只含有线性化质粒的反应管中进行第二次PCR。第1管中用引物a和c，引物a即为第一PCR扩增的上游引物a，引物c为下游引物，与紧邻5'端附加序列内测的质粒（+）链互补。同样，第2管的引物为b和d，引物b与第一次PCR扩增的下游引物b相同，引物d为上游引物，与紧邻5'附加序列内侧的质粒（-）链互补。

　　第二次PCR的第一循环中，PCR产物与质粒均变性与复性。除自身复性产物（这种复性产物不被扩增）外，PCR产物与质粒可通过各自3'端互补序列杂交成部分异源双链，延伸时，重叠的3'端互为此物沿各自互补链延伸，结果可产生PCR片段与线性质粒的"连接"。然后两管中PCR扩增各进行15-20个循环。这便可产生大量一端管1）或另一端连接有PCR插入片段的质粒。 第二次PCR后将第1管与第2管反应液混合，用碱变性双链，中和后稀释变性的DNA。反应管中的单链DNA可以复性或几种不同的产物，除各自本身复性产物外，管1产物ssDNA与管2中ssDNA可形成部分异源双链DNA，并各自有一较长的5'或3'悬端，这种长的5'或3'悬端相互互补，在低DNA浓度时可复性产生环化DNA。

　　尽管这种环化的DNA有两个缺口，但它们可以直接用来转化受体大肠直杆菌。一旦进入体内，两个缺口便共价连接，修复的质粒即可复制，下面以从λ噬菌体DNA中扩增-500bp片段，并克隆入pGem4Z载体中为例说明LFS法。

　　这种方法同样适于复杂基因组中基因片段的克隆。需注意的是第一次PCR时两引物的5'附加序列不应太短以免影响第二次PCR时异源双链的形成，以24个核苷酸较为合适。扩增时若形成，引物二聚体，一定要去除，否则会严重影响转化率。用LFS法已成功地克隆了长达1.7kb的基因片段。这种方法的优点是：①可用于常规方法无法进行亚克隆的片段；②适于任何PCR产物和任何质粒；③可亚克隆特殊目的（如含点突变、缺失或插入等）片段；④在某些情况下，对已构建了启动子或增强子等序列的载体，可使待表达片段插入定向合适位置；⑤较快，可在1d内完成，较常规方法可靠，不需DNA连接酶。

　　DNA克隆是分子生物学的重要内容。特定基因的克隆常因两端缺乏合适限制酶切点而受因，cDNA的克隆通常也效率不高、筛选因难。采用PCR技术行DNA和cDNA的克隆，则可大大缩短克隆时间，比之全基因合成更为经济和方便，因而愈来愈受重视。用PCR方法进行传染性疾病和遗传性疾病的诊断常遇到产物的异性问题和分型问题，采用产物克隆和测序方法，比之寡核苷酸探针杂交方法更为准确。随着PCR技术的不断发展和推广，新的PCR产物的克隆方法也将不断出现。

PCR反应特点

　

　　特异性强：PCR反应的特异性决定因素为： 　　　　　　　①引物与模板DNA特异正确的结合； 　　　　　　　②碱基配对原则； 　　　　　　　③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 　　　　　　　④靶基因的特异性与保守性。 　　其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 　　灵敏度高： PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

　　简便、快速： PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

　　对标本的纯度要求低： 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。

PCR反应体系与反应条件

　

标准的PCR反应体系：

　　　　　　 10×扩增缓冲液 　 10ul 　　　　　　 4种dNTP混合物 　 各200umol/L 　　　　　　 引物 　　　　 　 各10～100pmol　 　　　　　　 模板DNA 　　　 　0.1～2ug　 　 　　　　　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　 　　　　　　 Mg²⁺　　　　 1.5mmol/L 　　　　　　 加双或三蒸水至 　100ul 　　PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg²⁺

　　引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

　　酶及其浓度　目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

　　dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg²⁺结合，使游离的Mg²⁺浓度降低。

　　模板(靶基因)核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

　　Mg²⁺浓度　Mg²⁺对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg²⁺浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

　　PCR反应条件的选择 　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

　　温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： 　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃) 　　在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 　　③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性： 　　　　　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 　　　　　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子 　　　　　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子 　　　　　　　　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。 　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

　　循环次数　　循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

PCR基础的检测工具的优缺点

　　首先，PCR反应是快速的。整个DNA提取，扩增和检测的过程通常少于6小时，如果反应利用嵌套的引物，过程可能长些。对于一些样本来说，比如来自粪便和表皮，就需要在DNA提取中增加步骤。这样就延长了整个检测的时间到14小时。

　　用购买的核苷酸提取工具就能缩短检测时间，机械进行提取，使PCR方案最优化或使用加快热循环技术。有了优化的样本，快速提取和光循环热循环，整个检测时间能缩短到2小时。但通常是6-8小时。

　　于培养基基础的方法2-5天的时间相比较，这是巨大的进展了。这也比一些需要有精确计算结果的培养基浓缩的抗体检测实验要快。当购买的实用抗体基础的检测工具比PCR基础的方法快时，大部分这样的化验只能用于非常有限的生物体上。

　　第二，PCR不需要培养。这是与PCR基础的检测的速度密切相关的。既然PCR是十分灵敏的（少到10 cfus的样本就能被检测），培养通常是没必要的。大多数最新的实用PCR检测工具需要有选择性的浓缩，特别是当样本包括大量的PCR抑制剂时。用核苷酸提取方法能够避免培养，核苷酸提取方法产生了PCR质量的DNA并且优化了PCR反应。如果在大量样本中检测少量的病原体或者病源有机体在PCR灵敏度的极限以下的情况下，将需要使用培养。在一般情况下，使用培养的情况是很少的，去除了培养的步骤，时间将被节省下来。

　　比节省时间更重要的是，去除了培养，那些难以或不能培养的生物体就可以进行检测。这些生物体包括某种病毒、真菌、厌氧性生物和支原体。

　　第三，PCR的花费合理。与培养或抗体基础的化验相比，PCR基础的诊断是十分经济的。

　　考虑到细菌的培养，有较昂贵的花费。大多数样本为了正确的鉴定需要培养和重复培养。这需要大量的手工时间（加上化验的花费），也增加了污染的危险。

　　作为比较，大多数抗体化验所需的手工时间很少但化验本身很昂贵。

　　PCR反应的成分（引物，酶，dNTPs和缓冲液）的花费比每次化验的花费少40%，而反应的时间包括核苷酸分离，通常在一小时以内。当然这依赖于样本、技术员和用于分离核苷酸的技术。既然PCR所用的时间少，它的花费也少。

　　但是，PCR需要热循环，UV来源和一些类型的图象捕获装置，因此PCR实验室的最初花费是很高的。

　　这里讨论了另外一些在临床领域的PCR使用的基本原理

　　第一， PCR不是抗原基础的。

　　抗体基础的检测工具（ELISA和其他）不仅检测1）直接抗病原体的人类抗体，而且能检测2）病原体上的表面抗原。人类抗体检测工具因此需要免疫反应的存在，以及在正确检测抗原存在之前抗体浓度的测定。在新近感染的情况下，这种测试不能检测针对病原体的人类抗体，可能不能正确反映是否有感染。事实上，被感染的病人，没有充足的时间来提高用于检测的浓度。这是HIV抗体基础检测的通常的问题。由于相同的原因，这种类型的测试对检测无免疫应答患者的病原体存在困难。反过来讲，抗体基础的测试也会给出错误相反的结果。

　　然而抗体基础的检测最大的问题是它不能检测新的病原体亚型，由于表面抗原发生改变，而导致了错误的阴性结果。（PCR基础的检验也可能由于DNA的变化、突变而遇到相似的问题。但PCR基础的检验能够进行设计，使这些错误的阴性结果最小化。）

　　尽管有这些缺点，抗原基础的检测工具是十分重要的检测方法，在大多数情况下比PCR检测要迅速。

　　第二， 检验易按客户的要求设置，以适合特殊的需要

　　通过简单使用不同的特殊目标引物，工具能迅速设计，用于许多检测。

　　第三， PCR容易使用，是由时间证实的技术

　　通过使用有商业价值的核苷酸提取产物，用于病原体检测的样本能在少于十分钟的时间内被例行操作。一旦进行操作，样本被加入反应体系中，进入热循环。反应完成后，样本能被自动系统或凝胶电泳所分析。

　　少数的PCR检测将能完全自动化。仪器将进行所有操作，从样品的准备到分析结果。这样的系统将十分昂贵，可能只能适应制造商的平台。这对大多数临床实验室无吸引力，但当价格下降后，将最终使PCR诊断自动化。

PCR技术应用进展

PCR技术自1985年建立以来，发展之迅速、应用之广泛，表明其具有强大的生命力.近些年来，基于PCR的基本原理，许多学者充分发挥创造性思维，对PCR技术进行研究和改进，使PCR技术得到了进上步地完善，并在此基础上派生出了许多新的用途.

原位PCR技术

原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术.

原位PCR是Hasse等于1990年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等.其基本方法为： ①固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶. ②蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55℃消化处理2h后，96℃ 2min以灭活蛋白酶K. ③PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置. ④杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交. ⑤显微镜观察结果.

原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值.其特异性和敏感性高于一般的PCR.

连接酶链反应

连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)，是一种新的DNA体外扩增和检测技术，主要用于点突变的研究及靶基因的扩增.

连接酶链反应是Backman1997年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明，并申报了专利.1988年Landegren也进行了该项研究.1988年Backman等又因分离热稳定的连接酶，而申报专利，1991年Backman和Barany分别用耐热DNA连接酶进行了LCR试验.耐热DNA连接酶可以在热循环中保持活性，提高连接反应的特异性，排除了背景扩增和免除了不断补充酶的繁琐程序.

LCR的基本原理为利用DNA连接酶.特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增.其程序为:在模DNA、DNA连接酶、寡核苷酸引物以及相应的反应条件下，首先加热至一定温度下(94～95℃)使DNA变性，双链打开，然后降温退火(65℃)，引物与之互补的模板DNA结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，DNA连接酶即可连接封闭这一缺口，则LCR反应的三步骤(变性-退火-连接)就能反复进行，每次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模板，使更多的寡核苷酸被连接与扩增.若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物.

LCR的引物是两对分别互补的引物，引物长度为20～26个，以保证引物与靶序列的特异性结合，LCR识别点突变的特异性高于PCR，其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性.LCR连接反应温度接近寡苷酸的解链温度(Tm)，因而识别单核苷酸错配的特异性极高.

LCR的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环，94℃min变性和65℃复性并连接，循环30次左右.其产物的检测也较方便灵敏.目前该方法主要用点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等.

依赖核酸序列的扩增

依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，又称自主序列复制系统(self-sustained sequence replication，3SR)或再生长序列复制技术.1990年Guatelli等首先报道了这一技术.NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序.该反应有赖于AMV逆转录酶，T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNaseH)共同协作而完成.

NASBA反应体系中除含有上述三种酶外，还含有dNTP，NTP(核糖核苷)，两种特殊的引物和缓冲液.引物I3'末端与靶序列互补，5'端含T7RNA多聚酶的启动子，这一引物是用于合成cDNA的.引物Ⅱ的碱基序列与cDNA的5'未端互补.

在NASBA反应时，首先引物Ⅰ与RNA模板复性(结合)，AMV逆转录酶催化合成cDNA，RNaseH水解cDNA上的RNA，形成一条单链的DNA;引物Ⅱ随即与此cDNA的5'未端结合，逆转录酶在此DNA模板的指导下合成第二条DNA链.这样形成的DNA双链含有T7RNA多聚酶的启动子.该酶即以此DNA为模板，转录出与样品RNA序列相同的RNA链，而且每条DNA模板在该酶的作用下可合成约100个拷贝的RNA.每条新的RNA又可作为逆录酶的模板合成cDNA.如此反复进行，将获得更多的RNA和cDNA.

其基本方法为:将引物，标本加入扩增反应液，65℃1min使RNA分子二级结构打开，降温至37℃加入逆转录酶，T7RNA聚合酶和RNaseH，并在37℃反应1～1.5小时，其产物经琼脂糖电泳，溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带.NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环.整个反应过程由三种酶控制，循环次数少，忠实性高，其扩增效率高于PCR，特异性好.

转录依赖的扩增系统

转录依赖的扩增系统(Transcript-based amplification system，TAS)，是Kwen等人于1989年研究报道的，主要用于扩增RNA.

合成A、B引物，引物A的3'末端与待扩增RNA互补，其5'端有T7RNA多聚酶的启动子信息.逆转录酶以A引物为起点合成cDNA;引物B与此cDNA3'端互补合成cDNA第二链.逆转录酶除具有逆转录活性外，还有DNA多聚酶的活性及RNaseH的活性.T7RNA多聚酶又以此双链DNA为模板.转录出与待扩增RNA一样的RNA，这些RNA又可作为下轮反应的模板.T7RNA多聚酶的催化效率很高，一个模板可转录10～10³个RNA拷贝，因而反应液中待检RNA的数量以10的指数方式扩增.

TAS的主要特点是扩增效率高，因为其RNA拷贝数呈10的指数方式增加，只需6个循环靶序列的拷贝数就能达到2×10⁶.它的另一个特点是特异性高，由于TAS只能进行6次温度循环，错掺率低，加之用葡聚糖珠夹心杂交，因而特异性也高.虽然本法有较高的特异性和敏感性，但其循环过程复杂，需重复加入逆转录酶和T7RNA多聚酶，有待进一步研究.

Qβ复制酶反应

Kacian等于1972年首次报报Qβ复制酶(Q-beta replicase)催化RNA模板的自我复制功能，它能在常温30min，将其天然模模MDV-1RNA扩增至109.1986年Chu等报道用生物标记的靶序列特异性探针，可与亲和素联接的MDV-1RNA杂交，经洗脱未被结合的MDV-1后，再加入Qβ复制酶，扩增复制MDV-1拷贝，然后用溴乙锭染色检测或用同源性的第二探针杂交.

Qβ复制酶是一种RNA指导的RNA聚合酶，它有3个特点: ①不需寡核苷酸引物的引导就可启动RNA的合成. ②能特异地识别RNA基因中由于分子内碱基配对而形成的特有的RNA折叠结构. ③在Qβ复制酶的天然模板MDV-1RNA的非折叠结构区插入一短的核酸序列不影响该酶的复制. 因而，如在此区插入核酸探针，则其序列照样可能被Qβ复制酶扩增.

1988年Lizardi等，将靶基因序列插进MDV-1质粒里，用T7RNA聚合酶催化转录出MDV-1RNA探针，这种RNA探针可与靶序列杂交，然后洗去非杂交的探针，加入Qβ复制酶来扩增探针，被扩增的探针又可作为模板进行扩增，并呈指数递增.其产物按上述两种方法进行检测.现在该技术又发展了夹心杂交法，分子开关和靶依赖的复制等技术.

标记PCR和彩色PCR

标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利同位素或荧光素对PCR引物的5'端进行标记，用来检测靶基因是否存在.彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种.它用不同颜色的荧光染料;标记引物的5'端，因而扩增后的靶基因序列分别带有引物5'的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的型别鉴定等.

反向PCR

反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究.

不对称PCR

不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA).这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1.在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA.不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例.还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双键DNA，(dsDNA)，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备ssDNA.不对称PCR制备的ssDNA，主要用于核酸序列测定.

重组PCR

使两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR(recombinant PCR).Mullis等于1986年报道了由PCR扩增的两个DNA片段通过重组合后再经延伸而制备出新的DNA分子.其基本原理为将突变碱基，插入或缺失片段，或一种物质的几个基因片段均设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增.其产物将是一重组合的DNA.重组PCR主要用于位点专一碱基置换，DNA片段的插入或缺失DNA片段的连接(如基因工程抗体).

多重PCR

一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定.多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同.

多重PCR的用途主要有两方面:

1.多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增.可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染，，可系统组合的有:①肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠;有时可能是甲乙型肝炎病毒重叠;有时是乙丙型肝炎病毒重叠.②肠道致病性细菌的检测，如伤寒，痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾霍乱同存一病人并同时发病.③性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断.④战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等侦检.⑤需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等.

2，病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定:某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等可系统应用的有:乙型肝炎病毒的分型;乳头瘤病毒的分型;单纯疱疹病毒的分型;杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等.

多重PCR的特点有:①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体.②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检.③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息.

免疫-PCR

免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一种灵敏、特异的抗原检测系统.它利用抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适用于极微量抗原的检测.

免疫-PCR试验的主要步骤有三个:①抗原-抗体反应，②与嵌合连接分子结合，③PCR扩增嵌合连接分子中的DNA(一般为质粒DNA).该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备.在免疫-PCR中，嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒DNA结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在操作反应中形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物，通过PCR扩增DNA来判断是否存在特异性抗原.

免疫PCR优点为: ①特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上. ②敏感度高，PCR具有惊人的扩增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高10⁵倍以上，可用于单个抗原的检测. ③操作简便，PCR扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行.

PCR扩增产物的分析

　　PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。

　　凝胶电泳分析

　　PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。 　　　　琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂糖凝胶， 供检测用。 　　　　聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。

　　酶切分析： 根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。

　　分子杂交： 分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。 　　 　　Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。 　　 　　斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。

　　核酸序列分析： 是检测PCR产物特异性的最可靠方法。

PCR污染与对策

　　PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污 染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生. 一、污染原因 　　(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于 密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染. 　　(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染. 　　(三)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物 污染，就可造成假阳就可形成假阳性. 　　还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样 枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题. 　　(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的 检验室，这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化 过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简 便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大. 二、污染的监测 　　一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施，防止和消除污染. 对照试验 　　1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性 对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳 性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳 性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳 定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照. 　　2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂 对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染. 　　3.重复性试验 　　4.选择不同区域的引物进行PCR扩增 三、防止污染的方法 　　(一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定 等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开. 最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区. 其实验用品及吸样枪应专用.实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA. 　　(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题.由于操作时不慎将样品或模板核酸吸 入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸 样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染. 　　(三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先 配制好，然后小量分装，-20℃保存.以减少重复加样次数，避免污染机会.另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一 冰箱. 　　(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用. 　　(五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病 原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照 及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照. 　　(六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止. 　　(七)选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前 应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要轻，以防管内液体溅出.

PCR芯片检测系统 　

一、研究背景

　　随着人类基因组计划的实施和相关知识的宣传普及，人们已日益了解到不仅是遗传性疾病，而且人类许多常见疾病如：肿瘤、心血管病、神经系统退化性疾病及自体免疫性疾病都与“基因”有关，这促使医生及患者从“系统、血管、组织和细胞层次（通常称之为‘第二阶段医学’）”转变到“DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次（第三阶段医学）”上了解疾病的发生、发展过程，以便采取预防及治疗措施。

　　由于传统方法一次只能分析3～5个基因，且操作复杂，难以满足对人类约10万条基因进行高通量、高信息量分析的需要，故发展了基因芯片技术，它由芯片操作系统和芯片两部分组成，工作原理是将靶基因有序的密集排列在硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜等固相支持物上，制成芯片；待测样品与芯片杂交，杂交信号用扫描仪检测，经计算机分析、显示，以达到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。

二、产品定义

　　芯片操作系统是芯片运行的工作平台，它通过特定程序控制样品与芯片的相互作用，并获取、分析及显示信息。如果说芯片是常用的OFFICE软件，那芯片操作系统就是支持该软件运行的PC机及WINDOWS操作系统。根据芯片的类型不同，同样的芯片操作系统可在医疗、制药、环保等不同行业发挥作用。

三、功能、适用对象及用途

　　为芯片运行提供工作平台 　　医生及医学研究人员　——　疾病诊断及分子机理的研究 　　分子生物学研究人员　——　基因表达图谱、多态性分析及新基因的鉴定 　　法　　　　医　　　　——　身份鉴定及亲子鉴定 　　新药的研究和开发　　——　高通量药物分子的筛选、药效的个体评价 　　环境监测和农业　　　——　监测流行病和传染病扩散 　　　　　　　　　　　　　　　监测有害微生物的发生和扩散 　　　　　　　　　　　　　　　农、林、牧、渔等产业的品种改良和病虫防治

四、技术原理与技术优势

　　采用气浴控温器进行PCR反应，并与固相微阵列探针进行杂交，通过对杂交信号的分析得到检测结果。

　　1．PCR扩增——探针杂交检测过程芯片一体化，反应体系与外界进行了严密有效的隔离，避免样品污染。 　　2．杂交探针具有序列特异性，可以排除电泳法无法排除的假阳性缺陷，并可进行多基因的检测。 　　3．每一组芯片单元的体积小，可将几十组或上百组芯片单元集成在一个芯片板上，可同时进行多个生物样品的检测。 　　4．操作步骤简单，PCR反应时间短，可在十几分钟内得到检测结果。

五、PCR芯片检测区别于传统的检测方法的特点在于

　　1．能一次同时检测一人多种疾病或多人同一疾病，提高了检测效率； 　　2．因无需机体免疫应答反应，能及早诊断，且待测样品用量少； 　　3．采用PCR扩增技术与DNA杂交技术相结合的分子诊断方法，有极高的灵敏度、特异性和可靠性； 　　4．检测成本较低，自动化程度高，操作简便，需时少，利于大规模推广应用。

各种检测方法的比较

	传统ELISA	传统PCR	PCR芯片
检测对象	蛋　白	基　因	基　因
检测原理	抗原——抗体反应	基因扩增	基因扩增及确定序列
检测品种	单一检测	单一检测	同时多项检测
结果分析	显色反应 操作复杂	电泳分析不能确定 其特定序列	由光纤光谱仪和微机分析 能确定其特定序列
检测效果	有一定的 漏检率	有一定假阳性和漏检率	准确、灵敏、可靠
所需时间	约18小时	约3-4小时	约十几分钟
成　本	高	高	低
说　明		电泳分析中使用致癌物质 （溴化乙锭），对操作者 及环境有危害

六、PCR芯片操作系统的竞争优势

　　1．整体性　PCR芯片操作系统采用基因扩增、杂交、结果分析一体化，操作简便；传统的PCR仪的基因扩增及结果分析分离，操作繁琐；

　　2．时间　PCR芯片系统只需十几分钟，而传统的PCR仪需3～4小时；

　　3．价格　常用的PCR仪价格为40～200万元(如PE9600型PCR仪需￥200万)而PCR芯片操作系统为￥10万；

　　4．试剂　传统PCR用电泳检测实验结果，基因需扩增至50-100ng数量级；而PCR芯片操作系统通过杂交分析实验结果，只需扩增至pg数量级；这相应减少了试剂如Taq酶的用量，也就节省了宝贵的实验经费；并且由于采用X-Y二维扫描方式，基因杂交时可不标记，未增加格外的费用；

　　5．结果获得方式　传统PCR仪需用电泳分析结果，电泳中需用到强致癌物溴化乙锭，易损害操作者的健康并污染环境；PCR芯片操作系统用光纤光谱仪扫描，电脑分析获得结果，无污染；

　　6．结果的可靠性　传统PCR仪最大的缺陷在于易产生假阳性结果而限制其使用、推广；PCR芯片操作系统通过杂交确定基因序列，因基因的序列具有特异性，故避免了假阳性，结果更加可靠。

　　由上可知，PCR芯片操作系统与传统PCR仪相比，具有操作简便、价格低、无污染、节省试验经费、结果可靠的优点。

PCR技术技术概况

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

PCR技术的基本原理　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

(Plateau)。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝

PCR的反应动力学　 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)ⁿ计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

PCR扩增产物 　可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸， 其5'端是固定的，3' 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的， 这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

PCR技术的基本原理 　　PCR技术的基本原理　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 　　①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 　　③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

　　PCR的反应动力学　 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)ⁿ计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

　　PCR扩增产物 　可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3' 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结时，由于新链模板的5'端序列是固定的， 这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

什么是“PCR”技术

　　聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

PCR 技术 (polymerase chain reaction)

定 义

全称“聚合酶链反应技术”，又称“基因扩增技术”，是一种在体外由引物介导的DNA序列酶促合成反应。

原 理

利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，模仿体内复制过程，在附加的一对引物之间诱发聚合酶反应。全过程分DNA模板变性、模板与引物结合及引物延伸三个步骤。

应 用

该技术可以把核酸靶序列增加10⁶倍，极大提高了检测灵敏度，广泛应用于分子生物学的各个领域，包括基因诊断、分离、克隆、核酸序列分析、突变体和重组体的构件和基因表达调控研究等。

〖新语丝百科工程〗

聚合酶链反应（ＰＣＲ）

·方舟子·

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。

【开发史】

这项技术的发明人是Kary Mullis。１９８３年，在一家生物高技术公司（Ｃｅｔｕｓ）工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段ＤＮＡ的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州１０１号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段ＤＮＡ的简单方法，即ＰＣＲ。在１９８５年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了链反应。大家很快地纷纷采用这个方法，很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。Ｃｅｔｕｓ给了Mullis一万美元的奖金，随后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。在短

短的几年内，ＰＣＲ迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛的实际应用，被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。１９９３年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。

【原理和方法】

众所周知，ＤＮＡ是由四种碱基按互补配对原则（即腺嘌呤Ａ对胸腺嘧啶Ｔ，鸟嘌呤Ｇ对胞嘧啶Ｃ）组成的螺旋双链。在细胞内，ＤＮＡ复制时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，另一种酶－－ＲＮＡ聚合酶合成一小段引物（ｐｒｉｍｅｒ）结合到ＤＮＡ模板上，最

后，ＤＮＡ合成酶以这段引物为起点，合成与ＤＮＡ模板配对的新链。ＰＣＲ即是在体外模拟ＤＮＡ复制的过程，它用加热的办法让所研究的ＤＮＡ片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结合到ＤＮＡ模板的两端，ＤＮＡ聚合酶即可以大量复制该模板。

假定我们要研究的ＤＮＡ双链两端的序列是：

TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT

ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA

在ＰＣＲ之前，我们首先人工合成两段有２０－３０碱基的引物，能够分别与上下两条链的一端配对，比如一条是（为与模板能够区别，以小写表示）:ataagcccgaaaggttcgtt，另一条就是tttacggatcggcaacctat。把这两段引物和ＤＮＡ模板、ＤＮＡ聚合酶、底物（四种脱氧核苷）混合

在一起，我们就可以开始做ＰＣＲ了。

第一步叫“变性”，把样品加热到９４－９６摄氏度一到数分钟，让

ＤＮＡ模板变性变成单链。

第二步叫“退火”，让样品的温度下降到５０－６５摄氏度一到数分

钟，引物就可以结合到模板上去。

TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT

ataagcccgaaaggttcgtt

tatccaacggctaggcattt

ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA

第三步叫“延伸”，让样品的温度上升到７２摄氏度一到数分钟，ＤＮＡ聚合酶就可以从引物开始用底物复制出新链。

TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT

ataagcccgaaaggttcgttGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA

TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCtatccaacggctaggcattt

ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA

这样经过三步一个循环，一条双链就变成了两条，再来一个循环，就变成了四条……在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就可以把原来的样品精确地扩增了２的３０次方倍，而这只需要两三个小时。

ＰＣＲ要成功，必须要有能够忍耐高温、在高温下仍然能有活性的ＤＮＡ聚合酶。这种酶可从生活在温泉中的细菌中提取，其中最常用的一种叫Ｔａｑ聚合酶。野生型的Ｔａｑ聚合酶保真度较差，在复制比较长的模板时容易发生点突变。通过遗传工程，我们已获得了高保真度的Ｔａｑ聚

合酶，大大提高了ＰＣＲ复制的精确程度。

【应用】

在分子生物学基础研究上，ＰＣＲ被广泛地用于基因克隆和制造突变。

在临床医学上，ＰＣＲ被用于鉴别遗传疾病和快速检测病毒、病菌感染。用传统的方法，要检测病毒、病菌的感染需要把病原体培养数周才能鉴定，而现在用ＰＣＲ，即可以迅速判断人体细胞（比如血液细胞）中是否存在病毒、病菌的ＤＮＡ（比如ＨＩＶ的ＤＮＡ）而确诊。

在法医上，ＰＣＲ目前已成为发现罪证的重要方法。比如，０·１微升的唾液痕迹所含的ＤＮＡ就可以通过ＰＣＲ扩增而获得足够量的ＤＮＡ进行测序鉴定罪犯。毛发、血迹、唾沫、精液因此都可以成为重要的罪证。

利用ＰＣＲ技术，科学家们已从林肯的头发和血液、埃及的木乃伊、琥珀中八千万年前的昆虫、恐龙的骨头等不寻常的样品中提取了足够的ＤＮＡ进行研究。博物馆中的化石标本都有可能成为遗传学的研究对象，一门分子古生物学因此诞生。