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MR分子影像学应用现状
申宝忠
申宝忠先生，教授，博士生导师，哈尔滨医科大学附属第四医院院长兼影像中心主任，全国高等医学影像教育研究会副理事长，中华医学会放射学会委员、磁共振学组副组长，美国分子影像学会会员，黑龙江省放射学会主任委员。
关键词：磁共振 分子影像学 肿瘤
分子影像学(Molecular Imaging)是借助现代影像学技术，以分子生物学为基础，从分子水平研究和观察疾病发生、发展中病理生理变化和代谢功能改变，涉及物理、化学、核医学、影像学、计算机学等多门学科。分子影像开拓者美国麻省总医院的Weissleder R认为分子影像学是在活体状态下，应用影像学对细胞和分子水平生物过程进行定性和定量研究的一门新兴学科。目前分子影像技术主要有：PET显像技术、磁共振(MRI)、光学成像(Optical Imaging)，本文主要探讨MR在分子影像学方面的最新进展。MR分子影像是利用磁共振成像的方法来无创伤地研究生物细胞内的分子过程的技术。
MR分子影像与传统MR成像技术的重要区别在于将传统的非特异性物理成像转变为特异分子成像，其突出优点在于它的高分辨率(已达到μm级)，同时可获得解剖及生理信息，这些正是核医学、光分子成像的弱点。但是MR成像敏感性较低，目前只能达到微克分子水平，与核医学成像技术的纳克分子水平相比，低几个数量级。因此，MR分子成像在基因表达成像、肿瘤血管生成，以及细胞分子水平成像方面的研究尚处于基础阶段，但随着MR工程技术的发展，相信不久的将来，MR分子影像将成为研究疾病的病理机制、基因治疗、评价治疗效果等方面的一种重要手段。
目前，在中国利用大型跨国公司的资源整合优势，结合硬件开发，是开展分子影像研究千载难逢的机遇。比如GE公司最新开发的HDx 3.0T磁共振就是融合4.7T动物MR的设计理念，采用独有的4.7T动物MR成像系统，因而使得临床医院可以利用3.0T磁共振这个平台开展分子影像研究。
一 MR特异分子探针的研究进展
1. MR分子影像学基础
Weissleder等指出分子影像学研究的3个关键问题：高度特异性的分子显像探针、合适的扩增方法以及高分辨率的成像系统。高特异分子探针的研究是进行分子影像学研究的先决条件。在分子影像学中，要求探针的分子量要小；与靶目标有高度的亲和力，而与非靶目标的亲和力低；靶的背景率要大于1，能迅速穿过细胞膜，半衰期长，不能被机体迅速代谢。
MR分子显像特异性分子探针通常包括转运体与其携带的对比剂，转运体如纳米微粒(脂质体和乳剂)、den-drimer、病毒构建体、各种多聚体等。转运体可携带成像物质，如顺磁性或超顺磁性金属，还可携带治疗用的药物或基因。靶向性配体可直接耦连在转运体上，这些配体包括抗体或者抗体片断，多肽、小分子多肽类似物、aptamers等。由于单克隆技术的发展，可以提供更多的针对宿主分子抗原决定簇的特异性较高的配体。
传统MRI对比剂主要有两类：一类是超顺磁性氧化铁(SuperParamatic Iron Oxide，SPIO)微粒，另一类是顺磁性复合物。
第一类主要特点是它们在血液中的半衰期不同和分布于不同脏器的网状内皮组织系统(RES)，通常较大的微粒很快被肝、脾的RES吸收，较小的颗粒停留在血中的时间较长，最后主要聚集在淋巴结组织中。
第二类主要有Mn(Ⅱ)，Mn(Ⅲ)，与Gd(Ⅲ)离子的大分子的螯合剂，其中Gd(Ⅲ)离子应用最广泛，这是因为其具有以下几个特点：(1)它有很高的顺磁性(7个未配对电子)；(2)它有相对较长的电子弛豫时间；(3)它可以形成很稳定的螯合剂，且内部仍可含有一到两个水分子；(4)Gd(Ⅲ)离子螯合剂具有很高的热动力学稳定性，可以避免释出游离的Gd(Ⅲ)离子，因为游离Gd(Ⅲ)离子即使在很低浓度也具有很强的毒性。
2. Gd(Ⅲ)类特异性分子探针
由于Gd(Ⅲ)离子具有以上的优点，现代MR分子影像研究很多集中在寻找以Gd(Ⅲ)离子为基础的特异性分子探针的开发与研制上，其中比较直接的方法是采用大分子物质耦联顺磁性复合物，如多赖氨酸(poly-lysine)[Gd(DTPA)]n、右旋糖酐(dextran)[Gd(DTPA)]n、dendrimer[Gd(DTPA)]n，然后联接一个靶向性的合成物，例如用叶酸连接的dendrimer[Gd(DTPA)]n的特异性对比剂，在叶酸受体高表达的肿瘤细胞中得以明显摄取。另一个有用的体系是采用脂质体，这些脂质体可携带对比剂，Sipkinst等成功制备了脂质体耦联抗内皮细胞整合素α(V)β(3)抗体复合物，α(V)β(3)整合素是肿瘤新生血管的特征性标记物，和肿瘤的恶性有相关性，他们从对免肿瘤模型的研究，得到了肿瘤部位血管形成的增强MR信号。
目前已经报道了很多体内细胞内MR特异性分子对比剂的研究，最直接的方法是依据核素标记法将单克隆抗体标记到Gd(DTPA)上，其中比较早的使用单克隆抗体进行研究的是Matsumura等，他们应用抗9L胶质瘤细胞单克隆抗体，肿瘤部位的MRI信号得到了增强。
为了评价MRI是否能检测到胆囊收缩素CCK8过表达的肿瘤细胞，Silvio Aime等合成了CCK特异性对比剂：Gd-DTPTGlu-CCK8，经过3T3体外细胞实验，他们发现CCK受体过表达的细胞能有效地摄取Gd-DTPTGlu-CCK8并内化，与对照相比，实验组细胞能提供足够的MRI信号。Bhorade等的研究工作也得到了类似结果，虽然具体机制仍然不是很清楚，他们发现细胞能捕获带有特异性跨膜肽类的Gd(Ⅲ)类复合物，具有内化性质的底物可以是蛋白质、寡核苷酸、质粒DNA等。
Prantner等合成了能穿透胞浆膜的细胞内MR对比剂：Gd-DOTA-D-Tat肽，这种多肽与血清蛋白没有明显的结合作用，能有效地被人Jurkat白细胞内化，增强T1的弛豫时间，在T1加权图像上明显增强肝、肾、肠系膜的信号。
3. SPIO类特异分子探针
将单克隆抗体或单克隆抗体片断与超顺磁性氧化铁微粒(SPIO)联接来显像细胞表面表达的特异性分子是另一种方法。早在1992年有学者就用抗白细胞共同抗原的单克隆体联接SPIO微粒进行白细胞的MRI显像。人内皮细胞表达E-连接素，因此用抗E-连接素的单克隆抗体的F(ab)2片断联接CLIO进行MR显像。以上一些研究都是在细胞培养基中进行。以下是两个体内显像的研究。Weissleder等将人克隆IgG蛋白与超顺磁性单晶氧化铁(Mono Crystalline Iron Oxide，MION)微粒联接进行体内炎症部位的MR显像。Zhao等进行了EL4实体肿瘤模型在化疗后的凋亡MR显像。
附加素V(Annexin V)可以识别凋亡细胞的磷脂酰丝氨酸(Phosphatid ylserine)，因此，Schellenberger等将Annexin V与交联氧化铁(CrossLinked Iron Oxide，CLIO)钠米微粒通过二硫键联接，用MR显像来探测细胞凋亡。
以Gd或SPIO为基础的特异性对比剂是一类大分子物质，如果分子量过大，则妨碍其渗透过血管进行肿瘤细胞成像的能力，经过对albumin-GdDTPA(分子量约为80 kDa)的大量研究，发现他们可以穿过血管进入肿瘤细胞间隙。因此，一般认为，特异性MRI对比剂的最佳分子量应在50~100 kDa之间。
二 MR分子影像信号扩增系统的研究
由于MR成像的敏感性较低，因此在MR分子影像中一个重要问题是标记分子的MR信号能够被扩增系统适当地放大，从而得到清晰的MR分子影像。目前研究比较多的是亲和素/抗生蛋白链菌素—生物素系统(Avidin/Streptavidin-Biotin)，通过采用多步骤标记法或预定位标记法，这个系统一般由3部分组成：生物素联接的抗体、亲和素联结子、生物素联接的探针，这个系统可以提高亲和性及MR信号扩增作用，另外，预标记技术可以将比较大的MR对比剂分子分割成较小成分，从而提高运输效能。这种方法被应用在体内HER2/neu受体MR显像，Artemov等应用两步骤来进行乳腺癌HER2/neu受体MR显像研究，先用生物素与Herciptin Mab联接，然后与avidin-GdDTPA联接制备成共轭分子，在表达HER2/neu受体的乳腺癌移植瘤中得到了明显的对比信号。
Bogdanov等研究了一种酶感应MR信号扩增系统，这种策略是基于酶介导的顺磁性底物的聚合化，从而得到具有更高弛豫性的寡聚物，底物包括螯合化的与苯酚相连的钆离子，作为电子供给体，在过氧化物酶作用下，底物转化为单体，并迅速浓聚为顺磁性的寡聚物，原子的弛豫性提高3倍。他们认为这种酶感应探针系统可以应用在体内特异性分子的探测上，而且可以将酶附着于不同的抗体上或其它靶分子上。
再以转铁蛋白受体(TfR)为例，由于MION不能和TfR结合，故不能直接作为探测TfR的探针，而必须借助于某种中间结构的连接和TfR结合形成MR探针。目前应用最多的是转铁蛋白—单晶氧化铁超微粒(Tf-MION)。实际上，与MR信号强度直接相关的是细胞内MION的总量，TfR的MR成像是通过细胞内蓄积MION间接对TfR信息的几何级数的放大。已知1个Tf分子只能携带2个Fe原子，1个TfR分子在一次循环中只能结合2个Tf分子，即可以转运4个Fe原子；而一个MION超微粒含有大约2064个Fe原子。若按Tf-MION内Tf和MION含量为1∶1估算，1个TfR分子1次循环携带Tf-MION的Fe原子数量约比Tf高3个数量级。另外，MION的超顺磁性特性决定其弛豫率又是Tf的10倍左右，因此，理论上以Tf-MION为探针的MR信号的放大率约是Tf的10000倍，对如此大的放大效应利用传统的MR成像设备和技术完全可以探及。
三 MR分子影像血管形成的研究进展
由于肿瘤血管生成过程中新生血管上某些特征性标记物水平上调，将对比剂与一些配体连接后，可与这些标记物特异性结合，这种利用免疫组化原理成像是MRI在活体评估血管生成方面一种新的研究方法。这种成像技术的优点是可将新生血管与原有宿主血管分开，定量分析新生血管的结构和功能情况，还可以确定血管生成抑制因子及刺激因子在时间及空间上的分布，并对其进行长期、无创的监测。而且，这种特异性对比剂经过修饰后可转变成具有治疗性的物质，这样就使治疗和诊断合二为一。
多聚体小囊泡(Polyumerized Vesicles，PVs)是一种多聚脂质体(Polymerized Liposomes)，PVS上携带的金属可以连接靶向性单克隆抗体(AbpVs)，如α(V)β(3)整合素的抗体LM609，目前通过生物素、亲和素作为桥梁，将LM609作为配体，合成抗体耦联的顺磁性多聚脂质体(Antibody Conju-gated Parmagnetic Polymerized Liposmes，ACPLs)，经过兔V2腺癌模型活体成像的研究显示，肿瘤血管生成区的增强效果明显高于对照组。
α(V)β(3)是整合素家族中的一种，在动脉粥样硬化、肿瘤血管形成等的过程中起生要的作用。Winter PM等用外面包裹一层脂质表面活性剂的氟碳乳剂，然后将顺磁性钠米微粒Gd-DTPA-BOA置于乳剂表面，最后连接α(V)β(3)特异性拮抗剂Vitronectin制成特异性对比剂，微粒直径约为273 nm，每个微粒约有94~200个Gd3+离子。用1.5T MRI对胆固醇饮食诱导动脉粥样硬化的白兔进行检查，他们发现在表达α(V)β(3)整合素的动脉粥样硬化的主动壁出现了明显增强的MRI信号，提出特异性对比剂与α(V)β(3)抗原决定簇相结合，他们认为，MRI分子影像有可能作为一个无创的方法来研究动脉粥样硬化的形成过程及病人对治疗的反应的监测。
四 MR基因显像研究进展
MR基因显像技术中，第1类标记基因编码产特包括有：酪氨酸酶、β半乳糖苷酶、胞嘧啶脱氨酶、精氨酸激酶、肌酸酐激酶。第2类标记基因编码产物主要为转铁蛋白受体。国内学者采用含酪氨酸酶基因的质粒pcDNA3tyr体外转染人胚胎肾细胞293，使之产生黑色素，用1.5TMRI进行成像，发现转染细胞的T1WI信号明显提高，这是因为黑色素对铁离子有高亲和力，可以显著提高缩短T1弛豫时间，与大多人体组织不同，在MR上呈特征性高信号，因此，MR信号的改变可反映酪氨酸基因的转染与表达情况，成为一种MRI的特异性分子探针。
用超氧化物微粒子作为对比剂的MR基因显像是利用转铁蛋白作为标记基因的，Wessleder等利用胶质肉瘤细胞被表达质粒中含有工程化转铁蛋白受体(Engineered human Transferring Receptor，ETR)的cDNA转染后过度表达，转铁蛋白受体水平增加，导致细胞对MION与转铁蛋白的结合物(Tf-MION)的结合与摄取明显增加，之后在裸鼠腹部两侧分别植入转染的ETR阳性细胞和对照转染的ETR阴性细胞，植入后第10~14天将对比剂注入裸鼠体内，MR显示ETR阳性肿瘤处Tf-MION的摄取明显增加，提示有ETR基因的表达。这一研究为MRI受体基因表达成像的可行性提供了证据。
Ichikawa T等通过对超顺磁性交联氧化铁Tf-CLIO探针的研究也认为：ETR是一个敏感的MR标记基因，如果ETR同时携带有治疗性基因，则其表达水平同治疗基因表达水平具有相关性。
Heckl等研究了一个新的细胞内MRI对比剂，它包括钆复合物、一个寡核苷酸序列核酸肽(Peptide Nucleic Acid，PNA)和一个跨膜转运肽，他们用Hela肿瘤细胞和DunningR3327AT1鼠前列腺癌模型进行实验，观察细胞浆c-myc mRNA表达水平上调与否是否能特异性浓集这种MRI对比剂，结果发现，c-myc mRNA特异性表达组体及体内均观察到MRI信号增高，证明这种对比剂可以用来特异性诊断c-myc mRNA升高的前列腺癌。
五 MR受体成像研究进展
位于细胞膜上的TfR作为运载工具可以用于许多大分子药物的细胞内转运，同时大部分肿瘤细胞的TfR表达水平也明显升高，因此，在活体进行TfR成像对疾病分子(基因)水平的诊断和治疗效果的评价具有重大意义。目前应用的TfR探针主要有Tf-MION和抗TfR抗体(anti-TfR，Ab-MION)两种。前者连接的方法已很成熟，在实验室即可完成。而后者由于抗体制备过程相对复杂，应用较少。TfR的MR成像是通过细胞内蓄积MION间接对TfR信息的几何级数的放大。
Moore等在体外对转TfR基因小鼠细胞TfR表达的差异性成功的进行了MR成像。所用设备是GE公司Signa 1.5T超导MR扫描仪，采用5英寸表面线圈，T1WI，T2WI常规扫描。分析TfR成像的MR信号强度与MION数量之间的关系，以及MR信号的分布与MION分布的关系。实验中125I标记的细胞内Tf-MION核素成像与MRI对比显示，MION引起的MR信号强度的改变与MION的数量呈正比；转人TfR基因的胶质肉瘤9L细胞的小鼠肿瘤模型，经静脉注射111In标记的Tf-MION后相继行核素成像和MRI，对比显示两种系列图像的信号分布完全一致。以上结果充分说明TfR的MR图像信号真实反映了细胞TfR的表达水平，是完全可以信赖的。
Bulte等应用3T的高分辨率微型MR成像系统，以TfR为报告基因对少突胶质神经细胞前体在脊髓中的迁移和髓化作用进行成像，成功的显示了少突胶质神经细胞的迁移。存在的主要问题是这两种探针经静脉注射后能否通过血脑屏障而进入脑组织内，这直接决定着能否应用该探针对脑组织内TfR进行MR成像。另外，MION在细胞内的过度蓄积以及代谢产物对细胞内环境的影响是否引起细胞自身异常等也是值得关注的问题。
再以HER2受体成像为例来说明。HER2/neu是表皮生长因子受体家族的第二位成员，在细胞信号转导中发挥重要作用，是细胞生长、分化及存活的重要调节者。
HER2/neu在某些人类肿瘤过度表达。其在细胞的恶性转化中发挥重要作用，并能促进恶性肿瘤转移，HER2/neu过度表达癌细胞对激素、化疗药物抵抗，影响肿瘤的发生、发展。某些肿瘤存在HER2/neu过度表达，并定位于细胞表面，使其成为抗肿瘤治疗的理想靶位。
Dmitri Artemov等在乳腺癌细胞HER2/neu受体的研究中，利用细胞膜表面表达不同数量受体的乳腺癌细胞，对HER2/neu受体进行了成像。商业上应用的亲和素/抗生蛋白链菌素共轭的超顺磁性纳米粒子可作为靶向性的MR对比剂。这种纳米粒子可直接与预先利用生物素化的单克隆抗体标记的受体相结合，并可在HER2/neu表达的细胞的MR图像上产生较强的T2对比信号。在MR图像上所观察到的对比信号强度与利用荧光活性细胞分选机(Fluorescence-Activated Cell Sorter，FACS)分析单独决定的HER2/neu受体的表达水平成正比。在Dmitri Artemov等所进行的试验中，氧化铁纳米粒子可吸附在细胞表面，并且不会被细胞所内化，而这正是HER2/neu受体可在活体应用的主要优势之一。
六 MR显微成像
MRI虽然具有很高的空间分辨率，但其临床分辨率只是1 mm级别，这促使MR显微镜的发展，其原理同MRI一致，但其空间分辨率可达10~100μm，其样本大小从小于1 mm到几厘米，也是利用磁共振现象以产生显微镜水平的MR信号图像的一种专门技术。显微MR成像(Magnetic Resonance Micros-copy，MRM)分3个层次：(1)实验小动物活体器官结构成水平成像；(2)组织学水平成像；(3)细胞水平成像。
为了提高MR显微成像的敏感性，可以提高外部磁场的强度，现在一些超高场强被用来研究细胞内低水平的蛋白质，但却受到超导金属磁场饱和的限制；可以提高信号的接收能力，目前已研制出微型线圈，用来研究单个细胞或细胞内蛋白质。
Jacobs RE等用蛙胚胎细胞进行研究，当胚胎分裂到16个细胞时，他们在其中一个细胞内注射钆螯合剂(Gadolinium-Diethylenetriamine Pentaacetic Acid-Dextran)，再应用显微MR进行观察，注射对比剂后的细胞后代可以清楚地得到单个细胞的三维MR图像。
七 展望
自从1895年发现X射线，影像学在医学中一直有着举足轻重的作用，传统X射线、CT等无创方法显示疾病组织与正常组织的密度差异从而诊断疾病，极大地促进了医学的发展。然而，很多疾病脏器组织在出现病理改变之前其功能或分子发生了明显的改变，因此，早期探测脏器组织功能或异常分子改变则能早期进行治疗，从而大大提高治疗效果。PET的出现使影像学进入了分子水平，因此，21世纪被喻为分子影像世纪。MR可同时进行脏器功能显像与精确的空间定位，随着MR技术的飞速发展，MR分子影像已经很多领域有了明显的进展，将从传统的非特异性物理、生理成像向特异性个性化细胞分子水平、基因水平成像发展，疾病的评价指标也从形态的改变、解剖定位等深入到酶功能、受体水平、基因表达的改变的探测，从而使疾病的诊断更早期，更准确、更具特异性，从而早期治疗。相信随着分子生物学的发展、MR技术的进步，MR在疾病的诊断与治疗方面将具有越来越重要的地位。让我们拭目以待吧！
（全文完）
来源：《世界医疗器械》
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