临床生化自动化分析-生化自动化分析方法概要

 

第二节  　生化自动化分析方法概要

 

一、分析方法分类

（一）终点法

被测物质在反应过程中完全被转变为产物，即达到反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法（end essay）。实际上被测物并没有完全被转变，而只是与产物达到一个动态的化学平衡，因此该法称为平衡法更为恰当。从时间-吸光度曲线来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。分析仪通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值，求出其平均值计算结果，并可根据两点的吸光度差来判断反应是否到达反应终点。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。

终点时间的确定：①根据时间-吸光度曲线来确定，如Trinder反应测定尿酸，反应曲线上3～5min时其吸光度已趋向稳定，因而可将5min作为反应终点。②根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定，如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中，白蛋白与溴甲酚绿在10s内很快完成反应，之后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿发生 “慢反应”，使反应曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升，持续约达10min，因此终点时间应采用10～30s，而不应选择10min。

1．一点终点法  在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，这种方法称为一点终点法（one point end essay），其反应曲线见图7-3。其检测结果的计算公式是：待测物浓度C_U=（待测吸光度A_U－试剂空白吸光度A_B）×K。 K为校准系数，详见第五节二操作方法。

 

                             

A单试剂一点终点法　　　　B双试剂一点终点法 图7-3　一点终点法反应曲线

 

 

2．两点终点法  在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果，称为两点终点法（two point end essay），其反应曲线见图7-4。计算公式为C_U=（待测吸光度A₂－待测吸光度A₁）×K。该法能有效地消除溶血（hemolysis）、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品本身光吸收（见图7-5）造成的干扰。在单试剂分析加入试剂的初期、或双试剂分析中第二试剂加入之初，若指示反应吸光度尚未明显变化，则可在此时选择第一个吸光度，在指示反应终点时选择第二个吸光度，从而设置成两点终点法。但指示反应初期吸光度无明显变化的化学反应较少，如单试剂方式测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的终点法分析项目，及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项目，因反应初期吸光度已有明显变化，因而均难以用上述方式设置两点终点法。但在双试剂分析中，如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前，此时指示反应一般尚未开始，则能容易设置两点终点法。在此要注意必须将两次读吸光度时不同比色液体积进行校正。目前全自动分析仪均具有此自动校正功能，不必手工进行校正。

 

A单试剂两点终点法　　　　       　B双试剂两点终点法 图7-4　两点终点法反应曲线

 

 

                                              

图7-5　血红蛋白、胆红素和脂浊的光吸收曲线

 

（二）固定时间法

指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算，称为固定时间法（fixed-time essay），反应曲线见图7-6。其计算公式与两点终点法相同，为C_U=(A₂-A₁)×K。有时也称此法为两点法。

                                   

A单试剂固定时间法　　　　　　B双试剂固定时间法 图7-6　固定时间法反应曲线

 

 

该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。例如：苦味酸法测定肌酐，反应的最初30s内，血清中快反应干扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反应；在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反应，且此段时间－吸光度曲线的线性较好（故也可用连续监测法测定肌酐）；在80～120s及其以后，碱性苦味可与蛋白质以及其它慢反应干扰物反应。这样选用反应的第二个30s为测定时间，既避免了快反应物质的干扰，也避免了慢反应物质的影响，使肌酐浓度与吸光度变化呈良好的线性关系，有利于提高分析的特异性和准确度。

（三）连续监测法

连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（ΔA/min）计算结果，见图7-7A和B。所谓线性期就是各点吸光度差值相等，如图7-7C所示，图中δ₁及δ₅值偏小，而δ₂＝δ₃＝δ₄，故A₁点至A₄点属线性段。此线性期对底物来说属零级反应，期间的ΔA/min即为酶促反应的初速度，其大小与被测酶活性成正比。连续监测法的优点即是可以确定线性期并计算ΔA/min，根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值，代谢物浓度C_U=ΔA/min×校准K值。关于理论K值和校准K值叙述如下：

 

A单试剂连续监测法　　　　B双试剂连续监测法　　　　　　　　　　C酶促反应的线性段     图7-7　连续监测法反应曲线

 

　　

　　1．理论K值　多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用，因而根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：酶活性 (U/L)=ΔA/min× ，将此式中 以K来表示，此K值可通过对已知值即指示物质的毫摩尔消光系数（ε）、反应液总容量（TV）、样品容量（SV）和比色杯光径（d）计算后得出，即为理论K值，可作为分析参数输入到分析仪中。

采用理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差。温度的影响有时也非常大，由于反应盘是半暴露的，因此随着较冷试剂的加入，反应盘中的温度会逐渐降低，尽管开始测定时反应盘温度已升到37°C，但在某一项目测定过程的开始阶段，温度可能达不到37°C ，甚至仅35°C左右，且反应过程中仍有可能上下波动，这对于酶学反应来说影响是很大的。如采用37°C时的理论K值，将会使测定结果降低，温度的波动还会使得结果的重复性降低。当然，若试剂在加入反应杯前经试剂臂内加热装置预温，则基本不影响反应盘温度。

由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的准确性等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后用来计算的K值称为实测K值。

（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定：NADH（NADPH）没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用NADH 或NADPH标准液来校正仪器，须通过有NAD⁺(NADP⁺)参与的反应途径。用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品，又有国家批准文号的葡葡糖标准液。因此，根据公式A=εbC，已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度A后便可计算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数ε为 A/bC。假设，葡萄糖标准液浓度为1Ommo1/L(0.01mol/L)，标准液加入量为3.5μL，酶试剂加入量为335μL，比色杯光径为0.7cm，在340nm测得吸光度为0.465，则

实测NADH摩尔吸光系数= ＝6424　，即在此台分析仪上340nm波长处测得NADH（NADPH）的摩尔吸光系数为6424，而理论上NADH（NADPH）的ε为6220。

（2）“色素原”酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有许多酶底物为人工合成的“色素原”底物，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物，在405nm波长具有吸收峰。最常用色素原底物及其产物为: ALP测定以磷酸对硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate，4-NPP)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)，GGT测定以γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或γ-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid， ANBA)。对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700(405nm)，对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870(405nm)，对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490(405nm)。下面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定方法。

试剂：① 4-NP标准储存液(1Ommo1/L)。② 4-NP标准应用液(2.5mmo1/L，以0.84mol/L AMP缓冲液稀释而成)。③ 底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中，37℃,pH l0.09土0.02)。

测定方法：4-NP标准液加入量为5μL，底物缓冲液加入量为350μL，波长405nm，光径0.7cm，温度37℃，测定得吸光度为A₁；另用蒸馏水代替4-NP标准液，按上述方法测定其吸光度为A₂，4-NP标准液吸光度ΔA= A₁- A₂，若测得ΔA为0.460，则

实测4-NP摩尔吸光系数＝ ＝18662　　

2．校准K值　酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使用校准品能进行补偿。一般来说以使用校准K值为好，但必须有两个先决条件：①必须使用配套的试剂；②必须使用配套的高质量的校准品，该校准品应具有溯源性。使用与该分析仪配套的酶活性校准品也可得到较好的酶活性测定结果。关于酶活性标准品，欧洲标准局（BCR）和美国国家标准技术研究院（NIST）均发表了人血清基质的酶活性标准物，但目前尚无公认的标准（校准）品问世。

（四）透射比浊法

抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物，在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行透射比浊（transmission turbidimetry）测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做多点校准，再经非线性回归，求出抗原或抗体的含量。使用散射比浊法（scatter turbidimetry）能更加准确快速地检测抗原抗体形成浊度的大小或其速度，目前专用的特定蛋白分析仪可做此法检测。有关免疫比浊法原理详见第二章。

 

二、常用生化检测项目分析方法举例

　　1．终点法检测　常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。

　　2．固定时间法　苦味酸法测定肌酐采用此法。

　　3．连续监测法　对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。

4．透射比浊法　透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗“O”、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。

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