[转帖]基于“实验设计”的临床酶学参考方法测量不确定度评定模型的建立

——陈宝荣，孙慧颖，邵燕，胡滨， 李月玲

摘要 目的 以血清GGT催化活性参考方法测量不确定度评定为例，建立临床酶学催化活性测量参考方法的不确定度评定模型。
方法 依据GGT参考方法测量流程，以GGT催化活性浓度为核心评价指标，确立影响GGT催化活性浓度测量的主要因素。采用实验和理论评估相结合的方法对已确认的各因素对GGT催化活性测量的影响量进行评定。以波长和温度对GGT催化活性参考方法测量影响量的评估为例，介绍基于“实验设计”的各因素对GGT参考方法测量灵敏系数的评定方法。在此基础上按GUM理论评定每一因素的相对标准不确定度并将其作为一个独立的不确定度分量按GUM理论合成到GGT测量的标准不确定度中，以标准不确定度×2得到扩展不确定度，建立GGT参考方法测量不确定度评定模型。
结果 建立的GGT催化活性参考方法测量不确定度评定模型为：

结论 该不确定度评定模型适用于酶催化活性参考方法测量不确定度的评定。

关键词：不确定度 参考方法 测量 酶 GGT

不确定度评定是近年临床酶学参考测量领域的研究热点之一，至今尚无公认的针对临床酶学参考方法测量不确定度评定的导则和方法。笔者在学习了德国Hannover大学实验室的临床酶学参考方法测量不确定度评定方法后，感觉有许多可借鉴之处。现以GGT参考方法测量不确定度评定模型建立为例，分四部分介绍临床酶学参考方法测量不确定度评定模型的建立。

1 建立临床酶学参考方法测量不确定度评定模型的设计思想
1.1 应用GUM评定临床酶学参考方法测量不确定度的困惑
《测量不确定度表达指南》(简称GUM)是通用的描述测量不确定度理论与应用的导则， 1993年制定并颁布。已得到ISO等国际权威组织和计量界的广泛认可。GUM基于可靠的数学理论，利用概率密度函数和不确定度传播定律作为建立模型的基础,比较详细的论述了不确定度的评定方法、程序以及将所有影响因素的不确定度合成到标准不确定度的过程。

但遗憾的是GUM方法主要研究物理测量，如长度、温度等，是基于数学理论和实验观察方法来评估检测程序所有相关组分的标准不确定度。比较而言，GUM研究的是某种状态下对一恒量测量的不确定度的评定，这种测量模式与临床酶学测量有本质的不同。因此在应用GUM方法评价临床酶学测量不确定度时常有无从下手的困惑。

1.2 应用QUAM评定临床酶学参考方法测量不确定度应重点解决的问题
《Quantifying uncertainty in analytical measurement》（简称QUAM）1995年颁布，2000改版，是欧洲一批致力于分析化学测量的学者为将GUM理论更好的用于分析化学定量测量中评定测量不确定度制定。

QUAM提出分析化学定量测量中评定测量不确定度的四个具体步骤，奠定了分析化学定量测量不确定度评定的理论基础。它详细描述了分析化学定量测量中识别不确定度来源的方法、不确定度分量的计算、与测量结果不存在明确数学关系的不确定度来源合成不确定度的方式。还给出了通过将测量过程分解并单独评定每一独立操作的不确定度，然后进行不确定度分量合成的简便方法。提出通过测量模型来表述影响测量结果的所有独立因素对测量的影响。

临床酶学测量属于特定领域的分析化学测量。与GUM比较QUAM的方法更适用于临床酶学测量不确定度评定，更具有可操作性。但应注意临床酶学参考方法测量又不同于一般的分析化学测量，反应具有高度复杂性，影响因素多，因此寻找影响测量结果的主要影响因素，针对每一影响因素建立客观评价其对测量结果的影响量的方法是评定不确定度时应重点解决的问题。

1.3 基于“实验设计”方法建立临床酶学参考方法测量不确定度评定模型的可行性

1.3.1 什么是实验设计？
实验设计就是对实验进行科学合理的安排，以达到最好的实验结果。

一个科学而完善的实验设计，往往能够合理地安排各种实验因素，严格控制实验误差，并能够有效地分析实验数据，从而用较少的人力、物力和时间最大限度的获得丰富而可靠的资料。

1.3.2 基于“实验设计”方法建立临床酶学参考方法测量不确定度评定模型的可行性
GUM和QUAM清晰给出了物理和分析化学测量领域测量不确定度评定的原则与方法，对临床酶学参考测量领域测量不确定度的评定有很好的启示作用。对临床酶学参考方法测量而言，它不同于物理和一般的分析化学测量，反应原理复杂，测量影响因素多是其特点。要正确评定其不确定度，首先应根据测量原理、测量程序、测量结果计算公式综合分析其影响因素；其次制定各影响因素影响量的客观评价方案，再按GUM、QUAM方法进行不确定度评定。随着对临床酶学参考方法研究的深入，对影响其准确测量的主要因素也基本达成共识，形成具有代表性的临床酶学参考方法测量影响因素的鱼骨图（图1） 。

图1 酶催化活性浓度测量参考方法不确定度来源鱼骨图

针对每一影响因素如何客观评定其对临床酶学参考方法测量不确定度的贡献是评价不确定度的关键。实验设计是针对某一实验目的，通过科学合理的安排制定一套能全面客观反应其影响因素和环节，使之能达到预期目的的实验方案。在对各临床酶学参考方法测量不确定度评定中，首先采用实验设计的方法评定每一主要影响因素对测量结果的灵敏系数，再按GUM和QUAM的方法评定每一影响因素产生的不确定度分量、合成标准不确定度和扩展不确定度，形成临床酶学参考方法测量不确定度评定模型。这与丹麦学者Kristiansan曾提出的将测量不确定度评估方法标准化，即建立评定模型，简化评定途径的思路一致。比较而言，此法可能更适用于实验室评定不确定度。

2 临床酶学参考方法测量不确定度评定步骤与方法
QUAM的不确定度评估过程同样适用于临床酶学参考方法测量不确定度评定（图2）。
　

3 示例
3.1 GGT参考方法测量程序

3.2 GGT催化活性参考方法测量主要影响因素
临床酶学参考方法测量影响因素在行业已基本达成共识（见图1）。根据QUAM理论，将这些因素与实验室制定的GGT参考方法测量程序综合分析，认定GGT催化活性参考方法测量的主要不确定度来源为波长、温度、吸光度、pH、反应液浓度、试剂批号、样本体积分数、时间、反应液的挥发、试剂衰变、线性、测量结果变异共12个主要变异因素。

3.3 各因素对临床酶学参考方法测量不确定度影响量的评定

3.3.1 波长对GGT参考方法测量不确定度影响量的评定

3.3.1.1 评定方法
为客观评价波长对GGT参考方法测量不确定度的影响量，设计一组基于GGT参考方法测量的实验。采用能覆盖参考方法测量范围的低、中、高3个浓度水平的血清样本为实验对象，分别观察波长为408.5nm、410nm、411.5nm时3个浓度水平的血清酶活性变化，采用曲线拟合的方法计算波长与GGT催化活性的函数关系，据此计算波长对GGT催化活性参考方法测量影响的灵敏系数。在此基础上，根据GUM原理评定波长引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度。

3.3.1.2 评定实验
A 实验名称：波长对GGT催化活性参考方法测量不确定度的影响。

B 实验目的：评定波长对GGT催化活性参考方法测量不确定度的影响量。

C 实验方法：
a) 制备能覆盖测量范围的低、中和高三个浓度的混合血清。

b) 基于IFCC参考方法进行试验。将测量波长设定为变量，其它参数等同IFCC参考方法。分别在408.5nm、410nm、411.5nm进行三个血清样本GGT催化活性浓度的测量。

c) 将各血清测量结果录入表1，统计结果录入表2。

d) 建立波长与GGT催化活性浓度变化的函数关系，绘制波长与GGT催化活性浓度测量结果相关关系图（图4）。

e) 计算波长变化对GGT测量影响的灵敏系数。

f) 根据GUM原理评定波长引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度。

D 实验结果：
a）各浓度血清测量结果见表1。
　

表1 各浓度血清测量结果表

b）各浓度血清数据处理结果见表2。
　

表2 各浓度血清数据处理结果表

c）GGT催化活性浓度与波长的关系：见图4。

图4 GGT催化活性浓度与波长的关系

d) 波长对GGT测量影响灵敏系数的计算：
根据波长对GGT催化活性浓度影响的函数关系：
Y=-0.02X²+14.92X-2282.56，知波长每变化1nm，相应GGT催化活性浓度变化3.32%（灵敏系数）。

e）波长变化对GGT催化活性浓度测量不确定度影响量的评定
根据IFCC—GGT催化活性测量参考方法文件要求，GGT测量波长变化不能超过1nm,但是由于GGT测量受波长影响明显，因此实验室标准操作规程规定波长漂移不能大于0.2nm。假定波长变化引起的GGT测量结果的变化为矩形分布，该输入量对GGT催化活性浓度测量引入的标准不确定度为 乘以波长变化对GGT测量影响的灵敏系数，即下式：

波长（输入量）引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度=。

E 实验结论
波长变化（输入量）引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度为0.33%。

3.3.1.3 评定结果
波长对GGT催化活性参考测量影响的相对标准不确定度为0.33%。

3.3.2 温度对GGT参考方法测量不确定度影响量的评定

3.3.2.1 评定方法
为客观评价温度对GGT参考方法测量不确定度的影响量，设计一组基于GGT参考方法测量的实验。采用能覆盖参考方法测量范围的低、中、高4个浓度水平的血清样本为实验对象，分别观察比色杯内温度为36℃、37℃、38℃时4个浓度水平的血清酶活性变化，采用曲线拟合的方法计算温度与GGT催化活性的函数关系，据此计算温度对GGT催化活性参考方法测量影响的灵敏系数。在此基础上，根据GUM原理评定温度引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度。

3.3.2.2 评定实验
A 实验名称：温度变化对GGT测量不确定度的影响。

B 实验目的：评定温度变化对GGT催化活性参考方法测量不确定度的影响量。

C 实验方法：
a) 制备能覆盖测量范围的低、中和高四个浓度的混合血清。

b) 基于IFCC参考方法进行试验。将测量温度设定为变量，其它参数等同IFCC参考方法。分别在36℃、37℃、38℃进行四个血清样本GGT催化活性浓度的测量。

c) 将各血清测量结果录入表3，统计结果录入表4。

d) 建立温度与GGT催化活性浓度变化的函数关系，绘制温度与GGT催化活性浓度测量结果相关关系图（图5）。

e) 计算温度变化对GGT测量影响的灵敏系数。

f) 根据GUM原理评定温度引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度。

D 实验结果：
a)各浓度血清测量结果见表3。
　

表3 各浓度血清测量结果表

b) 各浓度血清数据处理结果见表4。

表4 各浓度血清数据处理结果表

c) GGT催化活性浓度与温度的关系见图5。

图5 GGT催化活性浓度与温度的关系
　

d) 温度对GGT测量影响灵敏系数的计算
根据温度变化对GGT催化活性浓度影响的函数关系：Y=3.200X-18.533，知温度每变化1℃，相应GGT催化活性浓度变化3.20%（灵敏系数）。

e）温度变化对GGT测量不确定度影响量的评定
根据IFCC—GGT催化活性测量参考方法文件要求，GGT测量温度变化不超过0.1℃。假定温度变化引起的GGT测量结果的变化为矩形分布，该输入量对GGT催化活性浓度测量引入的标准不确定度为 乘以温度变化对GGT测量影响的灵敏系数，即下式：

温度（输入量）引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度= 。

E 实验结论
温度变化（输入量）引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度为0.18%。

3.3.2.4 评定结果
温度变化（输入量）引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度为0.18%

3.3.3 其它因素对GGT参考方法测量不确定度影响量的评定
pH、吸光度等其它因素对GGT参考方法测量不确定度影响量的评定可参照波长和温度因素对GGT参考方法测量不确定度影响量的评定方法进行。

3.4 主要变异因素对GGT催化活性参考方法测量不确定度影响量
将基于“实验设计”方法获得的各主要变异因素对GGT催化活性参考方法测量的灵敏系数按GUM理论进行不确定度分量的评定，结果列于表5。

表5主要变异因素对GGT催化活性参考方法测量不确定度影响量

注：表中C为correction factor（经灵敏系数纠正后的校正因子）

3.5 标准不确定度的合成

3.5.1 合成与计算方法
合成标准不确定度 是个估计的标准差，是合理赋予被测量Y之值的表征其分散性的参数，根据不确定度传播律（鉴于酶学测量的特殊性，此处不确定度传播律可简化为估计值的合成方差为，指输入量彼此独立或不相关的线性函数，不包括非线性函数的高阶项），将每一影响因素按独立因素进行合成，相对合成标准不确定度计算公式如下：

合成标准不确定度计算公式如下：

3.5.2 合成标准不确定度计算：
以GGT为例，实验室测量GGT催化活性浓度的不确定度来源有12个：波长、吸光度、pH、温度、反应液浓度、试剂批号、样本体积分数、时间、蒸发、试剂衰变、测量线性和实验室测量结果变异，以上12个输入量引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度分别为0.33%、0.17%、0.13%、0.18%、0.31%、0.87%、0.22%、0.02%、0.06%、0.29%、0.10%、0.50%，相对合成标准不确定度计算如下:

GGT的测量均值为124.5U/L，其合成标准不确定度为：

3.6 扩展不确定度计算

3.6.1 计算方法的选择：
扩展不确定度计算方法有二种：，其中 为扩展不确定度，为包含因子，为合成标准不确定度。

假定Y值的分布为正态分布，当(合成标准不确定度的自由度，即有效自由度，公式为时，应使用的计算方法，包含因子K选择2。对U的估计，其置信概率近似为95%，此种计算方法可包含测量结果预估值的大部分。
　

当小于6时，应选择的计算方法，即依据置信概率p（双侧）的t分布临界值和公式，求出相应的包含因子k值，一般采用的p值为99%或95%，多数情况下选择95%。

3.6.2 计算
124.5U/L GGT样本的扩展不确定度：

4 GGT催化活性参考方法测量不确定度评定模型

其中f0为GGT催化活性参考方法测量过程中影响测量结果的恒定分量的影响函数：

5 小结
本文建立的临床酶学参考方法测量不确定度评定模型从理论上与GUM和QUAM评定不确定度的方法一致。本法基于“实验设计”方法评定测量不确定度分量，采用“module”方式评定测量结果的不确定度，可操作性强。