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作者简介：李莉，女，1984年毕业于南京医学院医疗专业，1984年至1988年在江苏省徐州市第五人民医院普外科任住院医师，1991年于第二军医大学获医学硕士学位,1991年师从孔宪涛教授，1994年获博士学位。1994至2005年在上海长征医院实验诊断科工作。2005年调至上海市交通大学附属第一人民医院检验科。2001年-2003
年在美国匹兹堡大学医学院Hillman癌症研究所从事博士后研究。
目前是中华医学会检验学分会第八届委员会委员，中华微生物和免疫学会第七届委员会委员、肿瘤标志物学组组长，中国免疫学会临床免疫分会第五届委员会委员，上海市医学会检验医学分会第七届委员会委员、临检学组组长，上海市免疫学会免疫技术分会副主任委员，中国医师协会委员。检验医学杂志第五届编委会编委，国际检验医学杂志第三届编委会常务编委，中华全科医师杂志第三届编委会编委，检验医师杂志第一届编委会编委，检验医师杂志编委，临床检验杂志（电子
版）编委和教育部留学基金评审专家。
主要从事临床实验室管理和临检专业的技术与质量管理工作，在流式细胞技术研究和应用领域工作18年。科研工作则致力于抗FcεRIα抗体抑制肥大细胞活化和过敏性疾病遗传易感基因筛查。获得了抗大鼠和抗人FcεRIα单克隆抗体、纳米颗粒包载肥大细胞凋亡诱导剂偶联抗体抗人FcεRIα单克隆抗体，筛查并获得与过敏性哮喘、慢性荨麻疹、湿疹等相关的基因及其位点。主持15项科研课题资助，其中国家自然科学基金7项。在国内外学术期刊发表研究论著90余篇，参编专著8部，获国家发明专利1项。
上世纪60年代末开始发展起来的流式细胞术（flow cytometry）如今已广泛应用于生命科学研究和医学临床的各个方面，如用于农业、海洋生物、动物、昆虫等领域的蛋白质表达、功能和细胞生物的研究以及医学细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学、生物化学和临床诊断中，是生命科学研究不可或缺的工具。
由于流式细胞仪技术发展的速度之快、功能拓展之宽，准确定义流式细胞术则是困难的。概括地讲，流式细胞技术是利用流式细胞仪对处于快速直线流动中的单细胞的特性及其成分或其他各种微小颗粒及其负载物进行多参数分析和分选的技术；能够分析包括动、植物细胞，微生物（细菌、病毒、真菌、海藻）以及其中的核酸，各种蛋白质、离子、pH值、膜的流动性、代谢产物、裂解产物以及其他分子，还可以研究人工微球或其他悬浮于液体中的微粒。而流式细胞仪(Flow Cytometer，FCM)是流式细胞术的基础，流式细胞仪是集流体力学、光学和激光技术、电子工程学、生物信息学、生物物理学、荧光化学、标记技术、计算机等学科为一体的新型高科技仪器；用于对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定、分析和分选。其特点是检测速度快、测量参数多、采集信息量大、分析全面、方法灵活，还能分选出特定细胞群进行深入研究，这一功能是目前检测分析仪中绝无仅有的。自诞生以来的半个多世纪，流式细胞仪为生命科学领域的发展做出了巨大贡献。仪器的功能日益强大、类型也更“个性化”，不仅能满足高通量、多参数、快速分析和分选的需求；更有小型便捷、操作简单的专用型号，如分别适用于临床和科研的分析型和分析分选型。流式细胞术的发展史是人类辛勤劳动、高度智慧和科技进步的结晶。
1. 流式细胞仪发展史
1.1流式细胞仪的诞生
1930年Casperrsson 和Thorell开创性地借助显微镜研究染色细胞的结构，1 9 34年Andrew Moldaran开始设计利用液悬单个红细胞流过玻璃毛细管，通过与显微镜相连的光电检测器计数并记录通过的每一个细胞，从此，迈出了从显微镜观察静止细胞向流式细胞术发展的第一步。1936 年Caspersson等引入显微光度术Mierophotometry)又称显微分光光度术(Microspectrophotometry)或细胞光度术(Cytophotometry)。在普通显微镜上加上机械的、光学的和电学的组件以达到对透射光、反射光等干涉技术中的光程差和荧光等，进而实现了对显微镜分辨范围之内的微小物体(如细胞等)定量测量。1940年Albert Coons发明了抗体标记荧光技术和用结合了荧光素的抗体标记细胞内的特定蛋白，开创了荧光标记抗体技术。1947年Guclcer运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器。同年Wallace Coulter发明了库尔特原理，即悬浮在电解液中的颗粒随电解液通过小孔管时，取代相同体积的电解液，在恒电流设计的电路中导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化产生电位脉冲，脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小和数目成正比。基于此原理设计的血液细胞分析仪迄今未变，该原理于1949年获得发明专利。1950年Caspersson发明了用显微分光光度计在紫外光(UV) 和可见光光谱区检测细胞的技术。1953年Crosland–Taylor研究了牛顿流体在圆形管中流动的规律，发现管中轴线流过的鞘液流速越快，其中的载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室：使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过而其外层则包裹着鞘液，细胞悬液和鞘液都以保持着高速层流运动状态。并依此原理设计出了红细胞光学自动计数器，因此，奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。同年，Parker和Hutcheon研制出了一种全血细胞计数装置，成为流式细胞仪的雏形。经过以上理论、技术和经验的积累，1953年Coulter公司推出了世界上第一台流式细胞分析仪—Coulter Counter Model A。
1.2流式细胞仪的成长
1954年Beirne和Hutchcon 发明了光电粒子计数器：从光源发出的一束平行光照射在光电元件(如光电管、光敏电阻等)上，这束光每被遮挡一次光电元件的工作状态就改变一次，被粒子遮挡的次数通过放大器准确记录在计数器中，从而奠定了光电计数细胞技术的基础。现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者Louis Kamentsky于1965年在组织化学的基础上提出了用分光光度计定量细胞成分和结合测量值对细胞分类的设想。
Kamentsky和Melamed及其同事在显微镜的基础上发展了分光光度计，当细胞以500个/s的速度通过显微镜物镜时，分光光度计能测量和记录细胞的紫外吸收和蓝光散射。
他们把计算机连接到仪器上，首次实现了对细胞的多参数数据记录和分析以及二维直方图显示和分析多参数，开创了细胞分类的先河。1967年德国学者Holm,O.等设计
了通过汞弧光灯激发细胞内标记的荧光，再由光电检测设备检测计数的装置。皮肤学家和细胞病理学家Kamemtsky和Melamed从1960’s起就致力于细胞分析的研究，继分光光度计之后很快又设计了细胞分选的方法，通过注射器提供电刺激，从液流中拉出目标细胞，再收集这些特殊的细胞群以便后续研究分析。1967年流式细胞分选技术问世。稍后，Dittrich和Gohde利用脉冲细胞仪对溴化乙锭标记的、固定后的细胞内DNA链进行分析。1969年Van Dilla和Fulwyler 及其同事们在LosALmos ,NM(即
现在的National Flow Cytometry Resource Labs.) 发明了第一台荧光检测流式细胞仪；它利用了Kamentsky设计的照射系统和电子检测系统以及Fulwyler分选仪的快速流动和振动的液流系统以及动力学聚焦的原理，形成了轴流、照射系统和直角形光学检测系统。Lou Herzenberg利用Kamentsky的荧光激活细胞分选器RCS系统建立了基于荧光（弧光灯）的细胞分选仪。此时，白光的激发和发射限制了流式检测的能力，经过探索氩离子激光光源将流式细胞仪推向了应用领域，1972年世界上第一台激光式流式细胞仪EPICS II诞生。接下来的几年，流式细胞仪在荧光信号检测能力、染色细胞分类等技术上有不同程度的提高和改进。如1974年Technicon-Hemalog D研制的血细胞分类流式细胞仪。该仪器利用钨-卤素灯作为激发光源，通过不同波段光的散射和吸收来识别过氧化物酶-底物显色的嗜中性和嗜酸性粒细胞，酯酶-底物显色的单核细胞，葡糖胺多糖-爱茜蓝显色的嗜碱性粒细胞。1975年Kochler和Milstein建立的划时代的单克隆抗体技术为蛋白和细胞的特性与功能的特异性研究提供了可能，流式细胞仪也在此基础之上得到迅速发展。随着对计算机、分析软件、荧光染料的不断开发，对细胞的制备方法、标记技术、电子信号处理能力、信息分析和存储能力深入改进和提高，各具特色的新型仪器不断推出。1980年代第一台双激光四色荧光流式细胞仪和第一台商业化分选型流式细胞仪问世。2000年高精度数字化颜色补偿技术ADC(Advanced Digital
Compensation)应用于流式平台，将流式技术带入全矩阵补偿、全自动补偿和脱机补偿时代。单激光五色流式细胞仪FC500/MCL和具有EV参数、同时进行绝对计数和精确测定细胞体积的流式细胞仪Quanta SC于2003年以后相继问世。贝克曼库尔特公司将临床实验室仪器自动化的理念引入流式细胞仪推出了流式细胞仪自动进样（multiple Plate Loading，MPL）系统，实现了24孔、96孔普通和深孔板，24和40支试管自动进样。Dako公司创建的Moflo和Cyan将流式细胞仪分选功能发挥到极致，高速、精确分析和分选的目标蛋白和细胞为生命科学领域的研究做出了巨大贡献。
2009年人类有了第一台三激光十色荧光的分析型流式细胞仪Gallios/Navios，翌年又有了带温控和远程维修系统的Gallios。如今流式细胞术已经日臻完善，随着光电技
术、计算机技术进一步发展，流式细胞仪已开始向模块化发展，即它的光学系统、检测器单元和电子系统都可以按照实验要求进行灵活的调整和更换。
1.3流式细胞仪的最新进展
随着光学技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术的飞速发展，流式细胞仪逐渐以多激光源取代非相干光源，仪器的小型化程度、自动化程度有了很大提高，15色荧光分析的实现，使单次实验就可以同时获得多达17个参数，大大提高了实验速度和实验的灵敏度及准确度。同时，分选速度也大大提高。流式细胞仪取得了长足的进步，主要体现在如下几个方面。
1.3.1光学系统进一步完善
激光光源单色性好、发散角小、光亮度高，因此，激光技术的发明和应用推动了FCM以激光取代弧光灯等非相干光源，为多色荧光检测奠定了基础。如氩离子气体激光管在488nm激发光可以同时激发四到五种不同波长的发射光。目前，除德国的Partec等公司的部分产品仍使用汞灯或氙灯作为光源激发紫外光外，多数的流式细胞仪都配备多个激光器，同时发射不同波长的激发光以激发更多种荧光染料。例如BD公司的FACS Aria 流式细胞仪除配备较为常用的488nm和640nm可见光外，还配备407nm光源，可同时检测13个荧光参数。同时，染料激光器的出现，使得光源发出连续可调的光谱成为可能，极大地扩展波长范围，以解决荧光染料开发的困难。二极管激光器、二
极管连接固态物激光器（DPSS）、氦氖绿色543nm、黄色594nm激光器、紫外二极管激光器、近紫外二极管激光器（NUVLD）的开发在检测能力提高的同时应用的灵活性也在不断改善。
1.3.2仪器功能多样化
1.3.2.1细胞计数从相对到绝对
以往流式细胞仪对混合细胞群体的分析只能用相对百分比表达结果，由于百分比只能代表每种细胞在混合细胞群体中所占的比例，并不能体现在单位体积液体中的绝对数量。而在特殊疾病的诊断和监测中细胞绝对数却十分重要，如艾滋病患者的血液中T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+CD8-）绝对值与病情、疗效直接相关。Partec CyFlow和B-D FACSCount实现了CD4、CD8和CD3绝对计数，是专为AIDS诊断和监测设计的小型流式细胞仪。Bentley Instruments 公司、Delta Instruments公司和FOSS Electric 公司专门设计提供奶牛场使用的专项检测仪，BioDETECT 公司的Yeastcyte 则是专用于酵母计数与活性分析。Union Biometrica 公司的COPAS 能够分选果蝇、蚊子、斑马鱼等的卵和幼虫。
1.3.2.2从相对定量到绝对定量分析 流式细胞分析细胞仪的多种成分如某些抗原或受体表达量以前多以平均荧光强度（MFI）或相对荧光强度（RFI）表示。由于仪器每次使
用时的状况有差异，每个实验室所用仪器的类型也不尽相同，以MFI或RFI表示某些细胞的抗原或受体的表达量缺乏可比性，FCM的荧光灵敏度越高，准确应用这些信息就越困难。近年来，为了通过FCM精确定量分析细胞的某些成分，以定量抗体微球法和定量荧光素分子微球法为基础的定量流式细胞术（Quantitative flow cytometry，QFCM）逐渐得到重视和研究。如微球标记基础上成长起来的CBA（Cytometric Bead Array）技术，能够同时检测10种以上细胞因子，而仅需25μl样本。将可溶性蛋白检测能力发挥到了极高。
1.3.2.3从细胞膜成分到细胞内成分分析
FCM对细胞的分析是从对细胞膜表面成分的分析发展起来的，因此，膜蛋白分析功能强大。然而,仅有膜蛋白的分析远远不能满足科学研究的需求,尤其对细胞的系列鉴定和功能状态分析以及信号传导、核蛋白、核受体、核因子、胞浆蛋白等更能反映细胞的系列特征、发育、成熟、演进和功能变化。标记技术为细胞内成分分析做出了贡献,一系列破膜剂、破膜技术、膜复合技术，不仅能使标记物进入细胞又能将细胞膜恢复如初，一如拉链般。胞浆内CD3、胞浆过氧化物酶(MPO)、TdT、FoxP3、DNA、RNA、NFκB等等的标记已经很成熟。
1.3.3仪器全面自动化
早期水冷气态激光器流式细胞仪体积庞大、色泽灰暗、操作繁琐、使用难度大，如Coulter公司的EPICS-C型。而今的FCM普遍采用空冷气态或固态激光器，水冷气态激光
器只用于高速分选仪器。仪器外形设计更加美观、不再需要手动调焦、多样本自动进样装置、全血样本和DNA样本处理仪及其配套试剂以及不同规格的多孔板或多试管自动进样器不断提高着FCM的自动化程度。如Beckman-Coulter 公司的Q-Prep和DNA-Prep提供了检测前样本处理的自动化。
1.3.4分析功能更加强大
FCM分析时可以同时从单一细胞中获得多种信息，其信息载体为荧光标记的抗体或抗原。然而，荧光受激发后发射的光的波谱比较宽，多荧光染料同时标记同一细胞必然导致发射谱范围内光的重叠，因此，需要进行荧光信号的补偿。新型的分析软件设计了自动补偿、脱机补偿等功能，在简化操作步骤、提高分析速度的同时也为后续的准确分析提供了利器。早期的荧光染料是天然荧光素，经典的如FTIC和PE；天然荧光染料的有限、波长的重叠和颜色补偿技术曾经困扰了FCM的发展。不同波长激发、发射不同波长的荧光染料的不断发现和研制对于FCM的分析能力来讲有如虎添翼之功；如紫外光激发的Pacific Blue、AlexaFluora 405，蓝光激发的Alexa Fluora488，红光激发的Alexa Fluora 647等。仅Alexa染料就有15种之多，其发射波长覆盖了从近紫外到红外422nm-775nm的宽广范围，从而成为最好、最亮的标记染料。新型的荧光物质也不断扩展着荧光染料的波长范围如偶联技术产生的PE-Cy5、PE-Cy5.5、PECy7、APC-Cy5、APC-Cy5.5和APC-Cy7等；同一种光源激发纳米晶体发射多种荧光的荧光素样荧光物质Qdots。单激光激发5色到7色的仪器也应运而生，如BD FACSAria和LSRII, Beckman Coulter FC500 和CyAn ADP等。多激光激发多种荧光染料，如PartecCyFlow ML 采用5种激光激发13色荧光实现16个参数的分析，提高了仪器的灵敏度和分辨率，为临床和科研提供更丰富的实验数据。同时进行前向、侧向散射光和15色荧光检测、单次分析同时获得17个参数也已经实现。
1.3.5 分析、分类、分选速度更快
如今的FCM分析和分选速度获得了质的提高。如BD FACSAria采样速度达70000个细胞/s，分选速度50000个细胞/s。更有甚者Beckman Coulter MoFlo XDP 分析速度高100000个细胞/s，满足了临床及科研中快速、大样本检测的需要。
1.3.6 仪器小型化
随着激光光源、光电检测器件、光纤通讯、电子计算机等相关领域的发展，器件的性能更加优越，体积也更小，这使得FCM成为临床一线无论发达地区或贫困地区，无论大中城市还是在AIDS高发区均可获得高端分析仪器。Shao Guocheng等研发的具有非共面显微透镜和3-D流体聚焦单元的微流控芯片，实现了三维流体聚焦单元，David Barat等以集成光学系统代替传统的自由空间光学系统，以微机电系统（MEMS）技术为基础的微流控芯片（microfluidic chip）技术等都在体积、效率、集成度和速度等
方面为FCM的小型化作出了贡献。SegyeongJoo 等发明了规格15×10×10（cm）、重量仅800g的微流体流式细胞仪，能同时提供荧光信息和电阻抗信息，使血细胞分类
更快、更容易。国内方面也有很多课题组从事这方面研究。如姚波等人采用静电力的方法实现了细胞分选。耿鑫等对微流体数字化喷点技术进行了研究，使之能够用于小型实验室。廖锡昌等研制了荧光微芯片分析检测器，基本实现了微型化。
2.流式细胞仪的结构特点和工作原理
2.1 结构特点
流式细胞仪传统的结构主要由4个部分组成：鞘流系统、光学系统、电子系统和电子计算机系统。随着计算机软件处理系统的日益重要和自动化程度的提高，目前认为完整概念的流式细胞仪结构组成应包括：流式细胞仪主机（Cytometer）、流式细胞仪工作站（Workstation）、电源箱（Power Supply）和自动进样器（MCL）（图1）。流式细胞仪的主机结构可分为流动室（flow cell）、液流驱动系统即鞘流系统、激光光源以及光束成形系统即光学系统、信号检测与存贮、显示、分析系统即电子系统和细胞分选系统等五个部分。
2.2 工作原理
流式细胞仪大致的工作原理是将荧光标记后的单细胞（或颗粒）悬液进入吸样管，进而随鞘液进入流动室。进入流动室之前的管道变细，迫使鞘液从四周、样本在中心进入流动室，在外加压力的作用下由下向上（或由上向下）直线流动。鞘液充满流动室将样品裹挟，当二者通过流动室喷嘴流出时，压力迫使鞘液包裹的液滴包含单一细胞或颗粒垂直通过检测区。在检测区与液滴垂直的位置设置激光，在与激光垂直的位置设置探测器（透镜等），液流、激光、探测器互相垂直并聚焦于一点实现流体动力聚焦。荧光标记的细胞或颗粒在激光激发下发出散射光和荧光的发射波，散射光和发射光被检测器获取，再经一系列滤光片、光栅处理去除干扰并将光信号经光电转换和放大后输入计算机，并由软件分析处理。而细胞分选则是对荧光标记的目的分子分别加载正或负电荷，当其在随液滴滴落的过程中受到外加高压电场的作用发生偏转而落入接收容器，从而获得目的细胞群。
3.常用临床和科研型流式细胞仪的种类及特点
FCM自诞生之日起生产厂家不断涌现，又不断整合或并购。例如：2009年Millipore公司收购Guava Technologies公司的guavaeasyCyte系列产品。2011年3月18日美国
BD公司(Becton, Dickinson and Company) 对外宣布公司已正式完成对美国个人化流式细胞仪制造商Accuri Cytometers公司的收购。这一收购的使命是使BD公司为生命科学家提供更为实用的流式细胞仪，并能够延展至更宽广的科学家和临床医生中，甚至包括环境科学、微生物学和海洋生物学等领域。目前，流式细胞仪生产厂家主要有Beckman-Coulter、BD、Partec、Guava、Union Biometrica、ABI、Amnis 等。一些新的公司Cytometers 和Amnis 开始成立。当然，美国的Beckman-Coulter和BD无疑占领着FCM市场最领先的地位，德国Partec的FCM也有相当多的用户。以下就目前常用临床和科研型流式细胞仪的种类及特点作一介绍。
3.1.1 FACSCount—小型流式细胞仪
FACSCount是BD公司专门为CD4+T辅助细胞监测而设计的经济、普及型仪器（图1）。该仪器具有专业的FACSCount工作站，全血标本处理过程简化、无需裂解和洗涤步骤，保障生物安全。软件功能完备而强大，实现样本采集、结果分析和打印的全程自动化，有严格完整的质控及对照系统,CD4、CD8、CD3绝对值计数快速、准确。
图1. 小型流式细胞仪—FACSCount
3.1.2 BD Accuri? C6流式细胞仪
A c c u r i ? C 6 是美国密歇根州A c c u r i Cytometer公司的旗舰产品，该公司于2011年2月被BD公司收购。Accuri? C6是一款真正意义的个人型FCM，使用方便、日常维护容易，购置成本更低廉，使流式技术不再是少数实验室的高端研究工具（图2）。
BD Accuri? C6流式细胞仪的机身设计超小，外部尺寸27.9x37.5x41.9（cm)，重量仅13.6 kg。BD Accuri? C6体积虽小但功能却很强大，配有蓝激光器(488nm)和红激光器 (640nm)、两个散射光检测器(FSC和SSC)以及加载了预优化光学滤光片的四个荧光探测器，可检测FITC、PE、PerCP和APC等荧光。紧凑的光路布局、稳定免调的光路设计和优化的探测器设置使整套系统更加完美。BD Accuri? C6系统数据数字采集具有跨越7个数量级的动态范围(1600万channel)，保证所有数据总是有效可用的；采用独创的低压泵液流驱动系统，通过鞘液流动力学聚焦的样本流速最高可达10,000vents/s，并且样本浓度超过5x10^6vents/ml。仪器根据样本进样体积系统可进行绝对计数或计算每微升样本的实际浓度；支持48孔和96孔板及深孔板等不同类型的微孔板进样，保证了微量标本或细胞研究的分析；还配有一个可用于标准12x75mm流式管的24孔管架。这些不同的管架和孔板类型都可以通过BD Accuri? C6流式细胞仪智能化获取数据，以简化实验、节省时间。
3.1.3 BD FACSCalibur
BD FACSCalibur是一台全自动台式机（图3）。分析功能强大，配置灵活，极宽的试剂选择范围，便捷的计算机和软件系统，适应了今天高效多能的实验室需要。它配
置氩离子激光（激发波488nm，15mW）和二极管红激光（激发波635nm，5mW），能同时做四色分析；用FACSCompTM 软件分析多荧光时可自动设定补偿，分析速度10000events/s；检测灵敏度100等量可溶性荧光分子 (Molecules of Equivalent SolubleFluorochrome，MESF)，操作方便，既能分析又能分选，分选速度200events/s。主要优点是：1.基于BD专利的立体空间激发系统的双激光实现四色分析；扩展了染料选择范围，拓宽了仪器的应用领域；2.全自动CD4+T细胞百分比和绝对计数,满足HIV筛查和治疗监测的全程需要；3.自动化程度高，从样本处理、上样到按钮式液流控制均实现自动化，软件获取和分析，每个环节操作都简便、快捷,重复性极好；3.分析速度快，荧光探测全部采用大型流式细胞仪国际通用的光电倍增管；4.初步解决了实体组织标本DNA分析中细胞粘连问题，双粘体辨别模式（Doublet Discrimination Module，DDM）专利技术最大程度减少假阳性；5.开机无需等待，预热5min即可上机检测。
图3.BD FACSCalibur 流式细胞仪
3.1.4 BD FACSCantoTM
BD FACSCantoTM是BD公司于2004年推出的第一台6色体外诊断级的FCM（图4）。该仪器配有蓝色激光（488nm，20mw固态激光器）和红色激光（633nm，17mw氦氖激光器），专利设计的光路、四个可调光学滤光片的荧光探测器可检测6色荧光、前散射光和旁散射光2个散色光，光导纤维引导激光束使光路更稳定。整个光激发系统和收集系统自动校准，无需操作者调整。使用Cflow软件的Zoom function模式观察一个特定通道时，其他数据同时被监测并记录到数据文件。仪器可以检测任意参数的脉冲
信号高度、面积和宽度以及比例，灵敏度更高，更适合检测弱表达或含量极低的抗原。主要特点是：1.液流系统采用独立的液流车，提供仪器运行所需的所有液体环境，节省了时间；与软件配合，使得液流的控制高度自动化，易于操作；样本滞留量小于0.1%，更适合检测微量样本；2.数字化电子系统，消除了电子死时间，无需进行时间延迟校准，检测时样本流速（120ul/min)和获取速度可达10000events/s；3.简化了荧光补偿操作，能够自动补偿和采样后补偿；4.BD公司专利设计的蓝色激光八角形信号收集系统和红色激光三角形信号收集系统。
图4.BD FACSCantoTM流式细胞仪
3.1.5 BD FACSAriaTM
BD FACSAriaTM是2007年BD公司推出的全球第一台台式高速细胞分选仪（图5）。仪器的设计采用全新理念，使用石英杯流动检测池固定光路校准技术，荧光检测灵敏
度<125 MESF。仪器内置的BD AccuDrop系统可以快速准确地确定液滴延迟时间。液流监测系统自动监测液流断点、检查堵塞，软件的分选设定和监测功能强大，实现了细胞分选的无人操作。主要特点：1.三激光，激光波长为488nm、633nm和407nm ；2.获取速度达70,000events/s，分析速度50,000events/s；3.分析参数可达15
色之多；4.完全数字化电子处理，分辨率达262,144channel，分选精度达1/32液滴；5.液流系统车装载鞘液、废液和洗液，软件自动控制液流、自动清洗；6.进样仓加压、样本混匀、进样管路冲洗全自动；7.喷嘴选择70mm或100mm，满足绝大多数细胞分选的要求；8. ACDU装置可以在微孔板或载玻片上定量分选细胞，可以使用多种规格的收集管。
图5.BD FACSAriaTM流式细胞仪
3.1.6 BD InfluxTM
2009年BD公司与流式细胞仪大师Ger vanden Engh合作创造（图6）。它的诞生将传统的在空气中检测的液流细胞分选仪带入了一个超高速、模块化和全功能的新纪元。BD Influx不仅能以超高的速度分析和分选，还能够加装小颗粒、偏振光和全光谱检测器，为流式细胞的特殊应用提供模块化选择。独有的位置分选（positional sorting）和按比例分选（proportional sorting）功能，将分选技术带入2D时代。
作为流式而研发的一台仪器，其独特的设计模式为使用提供了可灵活配置的、开放式细胞分选平台，在细胞治疗、移植、干细胞研究、海洋生物学等领域发挥了重要作用。BD Influx的性能特点：1. 所有的激光器和荧光检测系统都采用模块化设计，可灵活配置1-7根激光器，最多可检测16个荧光参数，最大检测速度达200,000events/s；2.可检测散射光或荧光信号的偏振现象，区分特殊生物体；3.配备有小颗粒散射光检测模块，可准确检测小颗粒散射光，灵敏度达200nm；4.全光谱分析功能，记录每个微粒的所有光谱信息，相当于荧光光度计；5.声学耦合的喷嘴设计，保证低压高频的液滴成形模式，维持分选过程的细胞活性；6.2-4路多种分选模式，多孔板分选；7.液路管路更换2min完成，确保分选过程的无菌化；8.高效微粒空气过滤仓、气溶胶控制系统可供选配。
图6.BD Influx流式细胞仪
3.1.7 BD FACSAriaTM III
集FACSAria和Canto的创新优势于一体， BD公司于2010年推出了BD FACSAriaTM III。特点为1.新一代光胶耦合石英杯、反射式收集光路，将检测灵敏度和分辨率推向极致；2.稳定性光路和液流设计，缩短开机时间；3.自动确定液滴延迟，智能断点监控，实现分选过程的高速度、高纯度、高得率的完美平衡；4.配置丰富、升级自由，采用新的可扩展结构，支持多达6种激光波长：633nm、561 nm、488 nm、445 nm、405 nm和375 nm，以及最多20个探测器位置，能同时测定18种颜色，为未来发展提供了广阔空间；5.向后兼容的结构使用户能将现有的仪器升级到最新的BD FACSAria III平台。通过现场升级，拥有BD FACSAria或BD FACSAriaII系统的实验室也能享用BD FACSAria III的最新性能。
3.1.8 BD LSRFortessa TM
以支持现今前沿生物医学研究为目的，2010年BD公司研发了追求极端性能和创新技术的高端BD LSRFortessa TM多维高清FCM（图7）。其标准机型能同时安装和使用
蓝色、红色、紫色和紫外4根不同波长的激光器，同时检测18种不同波长的荧光，最大程度上满足客户现在和未来研究的需求。主要特点是：1.标准型4激光18色，定制型可选11激光器、30个检测器同时加载，以多维数据把握研究高度；2.三角型和八角型全反射信号收集系统，稳定性光路设计结合光胶耦合石英杯保证了高灵敏度和高分辨率，实现知微见著的洞察力；3.Cytometer Setup and Tracking, CS&T仪器设置与追踪软件,优化实验性能，提供全方位质控，确保数据结果高度准确，且一致性好，重复性强。
图7. BD LSRFortessa多维高清流式细胞仪
3.1.9 BD FACSVerse 智能掌控型流式细胞分析仪
2 0 1 1 年8 月 B D隆重发布FACSVerseTM，这款仪器是对流式细胞技术的又一次革新（图8）。最高可分析多达10个参数并支持广泛的研究应用，在硬件方面以及新BD FACSuite TM软件彻底改变了流式细胞分析的补偿过程。主要特点是1.紧凑型设计。光学系统采用了紧凑式空间立体激发激光器，将光强最大程度地集中在流动池，旨在将光传输的损失降到最低并创造最佳分辨率，其光学系统还融入了诸多尖端科技如自动激光校准、加载智能芯片的7角型检测器阵列以及由特殊金属材料制成的流动池；2.真空驱动的流体设备和独特的样品注射管（SIT）除了标准的高、中和低流速模式，还设有超高灵敏度、缓流流体模式，专用于检测弱染色的颗粒；3.样品输入装置从500μl的微量离心管到50 ml的锥形管可自由选择；4.紧凑型、智能7角型检测器阵列，加载了预集成的滤光片/分光镜单元，每一个单元都带有内置的智能芯片，可精确地自动识别滤光片和分光镜的光谱信息，用以提高数据严谨性和可靠性；5.自动激光聚焦和精细校准功能，保证检测性能长期稳定。每个激光器都配置30:1光学步进元件，可独立精细微调校，以获得最佳聚焦效果；6. 热稳定性更好。确保光束聚焦效果高度一致和更加稳定的光学性能；7.特殊金属材质流动池一方面提高亲水性，减少气泡；另一方面，较低的热膨胀系数，降低温度变化对流动池的干扰，使得液流性能更优秀，检测性能更稳定；8.监控仪器性能的智能组件，及时向用户提示，确保仪器运行的最佳状态。
图8.BD FACSVerse? 流式细胞仪
3.2 Beckman-Coulter公司
1997年10月贝克曼通过对库尔特公司的并购，诞生了Beckman-Coulter公司，至此其产品涵盖了从生命科学到临床诊断和细胞分析的各个领域。在临床诊断、生命科学研究、细胞分析领域，美国贝克曼库尔特有限公司提供的用于临床生化检测、血液细胞分析、免疫分析、快速诊断、质量控制、自动化流水线、基因扩增以及离心机等仪器设备和试剂广泛分布于临床实验室、商业实验室、制药厂、科研院所和各大学。生产的流式细胞仪也处于世界领先水平。第一台商业化流式细胞仪诞生于Beckman— Coulter公司，早期产品冠以Profile(现已停产)和EPICS，近年又推出了Cytomics FC500系列。EPICS系列是大型流式细胞仪，目前市场上有XL、XL—MCL和ALTRA三种型号，其中ALTRA具有分选功能，适用于免疫学、细胞生理、分子生物学、遗传学、微生物学、水质分析和植物细胞分析。Cytomics FC500系列流式细胞仪体积小，可检测5种荧光。2007年12月Beckman-Coulter公司收购了丹麦Dako公司的流式细胞仪产品，获得了Dako公司生产的迄今为止最高性能的细胞分选FCMMoFloXDP和高性能的9色CyAn流式细胞仪。其流式细胞仪主要产品如下。
3.2.1 Quanta SC 细胞分析系统
Quanta SC是美国贝克曼库尔特公司集50年的细胞分析经验与美国NASA合作开发的最新细胞定量分析系统(图9)，创造性地利用库尔特原理测定细胞体积和计数，联合新型高效的荧光测定参数，使微小差异的细胞分析和定量变得更加清晰和简单。QUANTA SC配备488、366、405和435波长的激光光源，既方便检测普通荧光素，用于表型分析又能检测DAPI、HOECHST、INDO、LDS等重要荧光素。 QUANTA SC机身紧凑，便于户外检测。其专利的三角形流动池，当液流喷入流动池时，位于三个池角的鞘液因具较高剪切力逼使单细胞液束聚集于池中央，确保了单细胞流束更稳定，使系统能精密探测到每一个细胞（计数）和细胞体积大小引起的溶液电阻的变化（体积）。固定体积上样和样本的回收系统从少量标本中获得大量数据和无成本的细胞绝对计数。QUANTA SC是世界上第一台引入EV（电子体积）参数的FCM，电子体积比前向散射光更能准确和敏感地测量细胞大小，发现细胞的细微变化。运用公司设计的微球为介质的、Microsphere技术原理BBA试剂能够同时检测10种细胞因子，能够测定各种动物、植物细胞或颗粒，分析细菌、酵母和其它微生物。
3.2.2 Coulter? EPICS? XL/MCL
具有单激光、四色分功能（图10）。结合科研型的强大分析功能和坚固耐用的特性专为临床大样本量的诊断而设计的、自动进样、全封闭系统。EPICS XL系统具备最新技术成果（state-of-the-art）的数码信息处理功能，保证可靠的线性和无漂移的信息放大及完整的四路矩阵荧光颜色。EPICS XL-MCL是FCM自动化的先驱，体现于便利的多样品管旋转进样盘（Multi Carousel Loader, MCL），每小时可自动检测100份样品，先进的自动冲洗（AutoPrime）技术不需操作即可自动排除堵塞或气泡的干扰，样品检测前自动混匀、条形码识别三通道阳性样品。仪器主要特点是：1.第一台单激光(488nm) 激发4色（FITC，PE，PE-Texas Red，PE-Cy5）荧光的FCM；2.第一台全数字式FCM，率先实现全矩阵4X4荧光补偿，标准的SystemIITM软件实现了四色荧光标准化检测和补偿全自动；3.第一台基于Windows系统的、临床科研型细胞检测平台；4.可根据使用需求更换滤色片，拓展仪器的应用范围；5.通过单激光设计消除多光束对检测稳定性、信号延迟和光路校准的影响。
图10. Beckman-Coulter? EPICS? XL/MCL流式细胞仪
3.2.3 CytomicsTM FC 500MCL/MPL
该系列装备了目前能获得的最先进技术的尖端产品家族；具有灵活的检测功能，强大的软件和用户友好的操作界面。FC500采用单激光或双激光激发方式，可进行5色分
析；同时配备的共线性（collinear）的第二激光，拓宽了使用的灵活性；专门设计的固定光学系统使双激光光束共线性重叠，解决了传统空间立体光路设计的双激光平
行排列导致的计算延时和伴随的空间-分离光束的干扰。仪器主要特点为：1.专利的超高精度数字信号处理器（DSP），以获得最佳线性效应、无漂移的放大作用和颜色补偿；2.应用数字补偿（Advanced DigitalCompensation, ADC）简化多色分析，具有高效校正光谱重叠功能，保证结果的准确。3.可互换式光学滤片；4.独特的数据简化显示柱形图, 实现五维自动化表型分析，可在单一位点上分析出多达32种不同的表型；5.丰富的自动化上样系统；6.CXP软件可进行自动的数据获取和应用设置。
3.2.4 MoFlo 超速流水细胞分选系统
MoFlo及其升级版MoFlo XDP任何数量荧光和补偿下的分析速度均可超过70,000events/s，采样能力＞100,000events/s，4通路分选，在任何速度下的分选纯度＞99%，可0.2– 50ml离心管和6 – 1538微孔板、玻片或客户任意规格矩阵接收分选样本。其主要特点是：1.MoFlo是世界上首款能做四通道分选的仪器，可以同时分选4种
不同的细胞；2. 模块结构的外形设计（图12）；3.配置有创新型Cytomation设计的专利喷嘴，喷嘴大小从50、70、100μm到200μm；5.激光排列校正。
图12. Beckman-Coulter MoFlo 超速流水细胞分选系统
3.2.5 CyAn及其升级版CyAn ADP 流式细胞仪
仪器使用3激光发射器，可进行9色分析；配合S u m m i t 软件处理速度达1 0 0 0 0 0 万events/s。
3.2.6 Gallios流式细胞仪该款F C M 具有双激光6 色、8 色及三激光（488nm，22mW；638nm，25mW；405nm，40mW）10色等型号（图13）。具有光胶耦合镜片、180反射光收集系统和可更换光学滤片。主要特点拥有多项世界首创，如卡槽式激光光路设计、保证有效激光功率、前向角散射光检测能力和内部温度控制功能等。具有全新一代高速、高分辨率、高精度数字数据处理系统。
图13. Beckman-Coulter Gallios流式细胞仪
3.3 其它公司生产的流式细胞仪
3.3.1 Millipore Guava
2009年密理博收购了Guava Technologies公司旗下的流式细胞仪guava easyCyte系列产品，有EasyCyte 5、6和8三个成员（图14）。该系列机器是全球首个以微毛细管技术为核心的细胞分析平台，摒弃了传统的鞘流方式，采用独有的微毛细管液流上样，缩短了样本处理时间、节省了试剂。不仅如此。easyCyte系列产品独有的上样系统预设了1块96孔板与10个单样品管（1.5ml或0.5ml tube）位置，高通量与中低通量可同时上样，避免了从中低通量到高通量上样时需要手动切换的麻烦。easyCyte操作简便，比如细胞凋亡检测实验，采用类似Annexin V.标准检测试剂盒的标记物，及其自带的分析软件模块，就能分析数据了。
图14.Millipore Guava easyCyte 流式细胞仪
3.4 Partec CyFlow Cube 6
德国Partec公司成立于1967年，是FCM的鼻祖，目前是专业制造流式细胞分析仪器和试剂产品的跨国公司，早在1968年就生产出第一台商用FCM，凭借数十年的经验积累
和众多流式分析的专利技术，Partec公司是世界上流式细胞分析设备领域著名的、仪器型号、种类齐全的制造和供应商。Partec公司在全球流式细胞技术领域取得了数十项关键性专利技术。CyFlow于2004年1月成为世界上首台升上太空，进入太空站进行太空领域研究的FCM。CyFlow Cube 6是超小型流式细胞仪（图15），配有FL1-FL4 4色荧光通道，高性能的UV LED光源为CyFlow Cube 6进行高分辨率DNA分析提供了可能。Cube系列产品价格低廉、可便携、可根据研究需要而扩充应用范围。CyFlow
Cube 6的三项技术优势为：1.高精度石英流动室。积超过40年的流动室设计经验与技术生产的高机械精密度石英流动室可保证所有参数达到最高精确度，变异系数CV＜1％，即使应用绿色激光器其荧光通道精确度也可达到CV＜2％；2.TVAC绝对定量：以颗粒浓度C、在固定体积V内颗粒的数量N（C=N/V）的理论基础，Partec采用真正的
体积测定绝对计数方法分析颗粒的分布浓度，实现绝对定量；3.PPCS分选系统即内置、封闭、压电晶体式颗粒分选系统，保证分选的最高纯度。
图15. Pertec CyFlow Cube 6流式细胞仪
3.5 Attune?
声波聚焦细胞分析仪 （Attune Acoustic Focusing Cytometer） Attune? 声波聚焦细胞分析仪代表着FCM重要创新，是世界第一台通过声波精确控制细胞移动的流
式细胞计数系统（图16）。该仪器由美国能源部国家实验室（洛斯阿拉莫斯国家实验室）研制，2010年春天由ABI（LifeTechnologies）公司投放市场，连续荣获The Scientist杂志2010十大创新技术和经生物通读者投票入选201 0年生物通生命科学十大创新产品两项殊荣。Attune声波聚焦FCM通过一个看似简单的原理—利用超过2 MHz的超声波（类似于医学成像中使用的超声波）将细胞紧密聚集在激光检测点的样品轴流中轴线，避免细胞随轴流加宽而分散，实现了在高进样流速下的高精度检测，能够同时将速度和分辨率最大化，并在检测点开展cell-by-cell的分析，解决了其它FCM在灵敏度和速度之间的折中。Attune每次运行可收集高达2,000万个events，流速高达1000μl/min，是其他型号FCM的10倍以上，且收集速率在25-1,000μl/min之间可调，4min内可分析4ml样品。该仪器光源为405nm紫色和488nm蓝色双激光，新款仪器还增加了红色激光配置，可帮助科学家们实现对细胞群体中大量异质细胞的统计分析。
图16.Attune? 声波聚焦细胞分析仪
3.6 Amnis Imagestream高速成像流式细胞仪
美国Amnis公司（现属于默克公司）是一家专注于科研、生物技术和制药行业分析与研究的流式细胞学应用开发公司，有ImageStream和第二代的ImageStreamX高速
成像FCM（图17）。这个全新的仪器将FCM的速度、灵敏度和分型能力与显微镜的详尽图像及功能观察融为一体。与传统的FCM一样，ImageStreamX能够同时采集6个检测通道中的细胞图像，并且在图像的基础上计算出上千个特征参数，不仅能检测荧光强度，还能分辨荧光信号的强度和亚细胞位置，具有超过50000events/min的成像能
力，能分析稀有的亚群及高度异质的样品，并拥有统计学可靠及客观的结果。相比于显微镜观察分析的方法，ImageStreamX对荧光信号亚细胞定位实行严格的参数化界定，使得所有分析具有客观统一的标准，并且能在短时间内轻松实现上万个细胞的统计学分析。与第一代的相比，ImageStreamX更快速，拥有更多的激发光和检测通道，图像质量更高，生产力更强，大大扩展了平台能力。ImageStreamX直接对悬浮细胞成像，具有60×显微镜的分辨率和最佳流式细胞仪的荧光灵敏度，大大拓展了流式分析的应用领域，如T细胞和APC细胞相互作用及其免疫突触分析、细胞伪足形成分析、红细胞分化（去核化）等研究。悬浮FISHImageStreamX特有的EDF（Extended Depth of Field）模块能大大增大成像景深结合流式标记技术实现对混合细胞中稀有细胞群体进行FISH研究，使得悬浮FISH成为现实。荧光染料γ-H2AX能够识别和修复DNA双链的断裂，利用ImageStreamX收集数据，利用软件的Spot Counting功能对γ-H2AX（FITC）的荧光点计数分析进而检测DNA损伤和修复。
图17.Amnis Imagestream高速成像流式细胞仪
3.7 COPAS?系统流式细胞仪
C O P A S（C o m p l e x O b j e c t P a r a m e t r i c Analyzer & Sorter）仪器是美国Union B i o m e t r i c a 公司生产的唯一能够分选20-1500 μm生物颗粒的FCM。普通流式细胞仪采用电磁场分选，会对生物活体产生致命的影响，与之不同的COPAS的技术核心是专利的气流分选装置。这种分选方式非常温和，可以保证收集到的生物活体的活性和完整性，对于后续的培养和分析不会产生任何负面影响。因此，COPAS?用于分选线虫，果蝇、水螅、蟾蜍、蚊子、斑马鱼的卵和幼虫。
流式细胞技术已经深入到生命科学研究的方方面面，成为科学家不可或缺的工具，为生命科学研究做出了巨大贡献。同时，流式细胞技术的迅速发展是全社会的科学进步和时代发展的迫切需求，也凝集着一大批对流式技术满怀热爱和充满兴趣的科学家的执着追求、刻苦探索和高度智慧。未来的流式细胞仪将是发展最快的科研分析仪，可能会完全不是今日的模样，但不可置疑它将极大程度地满足科学家不同研究和探索的需求。
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