注册登录才能更好的浏览或提问。
您需要 登录 才可以下载或查看，没有账号？立即注册
×
分子检测标本相关问题的探讨
北京协和医学院研究生院 —— 康凤凤
卫生部临床检验中心 —— 王治国
随着分子生物学检测技术的飞速发展，其在诊断领域中的应用越来越广。最早的分子检测主要用于标本中细菌或病毒的定性或定量检测，而目前已应用于检测肿瘤细胞的分子损伤、疾病状态相关的基因型变异、疾病或治疗响应相应的基因转录等。从临床标本分离得到的核酸的数量或质量很大程度上受标本采集、处理和提取方法的影响，因此对分子检测的标本采集、运输、处理和存储的标准化是非常关键的。本文将参考美国临床与实验室标准化研究院（CLSI）MM13-A文件：分子检测方法的标本采集、运输、处理和储存；批准指南，对分子检测的标本问题进行讨论，旨在提高标本处理因素将影响分子检测结果的意识，促进分子检测方法的分析前阶段的标准化。
1 标本采集
合理的标本采集对保证标本的完整性和核酸的定性/定量检测的准确性是至关重要的。标本应严格按照适当的生物安全指南进行采集，不合适的标本处理会导致核酸降解，产生错误的患者检测结果。
1.1 标本识别 标本采集时应明确患者身份及其标本，充分尊重患者隐私。同时应为医疗人员提供合理而充足的检测和治疗相关的信息。标本应牢固地贴上标签，内容至少包括：识别号、采集日期和时间、标本采集者姓名、标本来源等。
1.2 申请单信息 申请单至少包括以下几点信息：唯一标识号、入院登记号、患者姓名、出生日期、性别、种族、采集日期、标本类型、相关的临床和实验室信息、医生姓名、标本采集的部门、检测申请原因等。
1.3 标本采集 采集人体组织或体液标本时应遵守相关的安全防范措施，佩戴手套，预防标本中血源性病原体的传播，同时阻止标本被处理人员的脱落细胞污染。特定的检测方法可能需要额外的预防措施和采集说明，如HPV检测采集宫颈标本应在醋酸试验之前。
实验室采用不同的检测方法时应考虑潜在的干扰和污染来源，正确指导和培训临床医生按照特定方法或检测体系的标本采集要求进行采集。临床实验室收到标本后应尽快将标本信息输入至实验室信息系统（LIS），同时应尽快处理接收的标本。如果标本存在如溶血、冰冻血液或标记不当等情况应考虑拒收。
1.4 抗凝剂 血液和骨髓穿刺（BMA）标本采集应使用合适的抗凝管或含其他添加剂的试管。试管添加剂的选择应根据分析物类型、试验、标本量而定，有研究表明肝素和亚铁血红素可能会抑制PCR反应。因此，推荐使用EDTA和ACD抗凝剂检测血浆或骨髓穿刺标本。如果被测量为细胞内RNA，采集血液或骨髓的设备应包含RNA稳定剂，或者在采集后立即加入RNA稳定溶液。
1.5 组织标本 如果无法获得血液或口腔黏膜细胞（如患者死亡），或者组织标本的基因型同血液或口腔黏膜细胞不同，或者组织为某些潜在感染物质核酸的唯一来源时，可采用组织标本。通常最佳的组织量为1-2g，但由于各种组织所含的DNA和RNA的量不同，采集组织的量也因组织而异。多细胞组织如骨髓、淋巴结、脾适用于基因组DNA检测，需要的组织量较少。少细胞标本如肌肉、纤维、脂肪组织不是基因组DNA的最佳来源，采集量最好大于1-2g。通常，如果没有广泛脂肪浸润，大于10mg的组织至少获得10μg的RNA或DNA。不同组织的蛋白质的量和类型各不相同，核酸分离方法也因组织而异。按照特定来源的组织，根据厂家建议分离DNA或RNA。
病理科医生通常从大块组织中采取有代表性的部分组织进行固定、染色、显微镜检测和病理诊断，或者选择有代表性的组织提取DNA或RNA进行分子学分析。一般选择病灶组织进行检测、非病灶组织作为对照。对照组织对某些分子检测是至关重要的，如杂合性缺失分析或微卫星不稳定性试验。
2）基于密度的细胞富集（淘洗）
3）抗体富集（FACS、磁珠捕获）
4）激光捕获微切割（LCM）
3.2 病原体富集和浓缩方法 分子检测的灵敏度通常通过扩增实现，一般不需要标本的富集或浓缩。利用巢氏扩增能最大程度地提高分子检测的灵敏度，PCR中的富集也可指去除干扰抑制性物质的过程。在实验室中，标本病原体的富集利用重力和离心力来分离混合的血液、粘液、炎性物质或其他干扰分子学分析的碎片。特殊情况，实验室需要浓缩标本来富集病原体或游离的循环核酸进行扩增，可采用高速离心法或过滤法进行浓缩。
3.3 核酸制备
3.3.1 病毒核酸分离 病毒核酸的纯化有一定的挑战性，因为通常生物标本的病毒滴度较低，而蛋白或其他污染物较多。纯化方法应提供定量的核酸恢复，并完全去除污染物。很多生物原始材料含有丰富的RNase，因此纯化方法需要使用有效的RNase抑制剂。纯化方法包括：有机提取方法、目标捕获方法、硅技术法。如果临床标本，如粪便、血浆、尿液、脑脊液或其他体液，通常仅包含少量的细胞或病毒，应对标本进行浓缩，可通过离心、过滤、阳离子表面活性剂等方法实现。
3.3.2 基因组DNA分离 动物、人类、酵母、细菌细胞裂解液中的DNA提取方法同组织标本DNA提取类似。不同的原始材料含有的不同特征可能会影响DNA分离，标本的破碎和裂解对组织标本DNA的释放也会造成一定的影响。破碎和裂解不完全会降低DNA产量。破碎通常采用裂解缓冲液，包括表面活性剂（破裂细胞膜）和蛋白酶（消化细胞或病原体中的蛋白）。有些细胞类型需要额外的处理才能有效裂解。利用注射器和细针使细胞或组织裂解液均一化。将裂解液通过0.9mm的针管可筛选高分子量DNA，加上无菌塑料注射器，至少5-10次，直到得到均一的裂解液。基因组DNA的提取方法很多，包括有机提取法、盐析法、氯化铯密度梯度、硅方法、离子交换法、滤纸法，其基本原理是包括原始材料的破碎和裂解，继而去除蛋白和其他污染物，最后恢复DNA。
3.3.3 RNA提取 RNA提取首先应使原始材料破碎和均质化，一般使用有机溶剂或强解离剂，防止内源性RNase的释放。但在破碎和均值化过程中或之前，RNA的表达可能会发生改变。对于准确的基因表达分析，应先稳定标本，需要添加RNase抑制剂。组织破碎和均值化方法包括定转子均质器、研磨珠、研钵、杵、旋转柱均质器等。RNA提取方法也很多，典型的方案是将几种技术结合使用，根据特定的RNA类型、纯度要求、每个标本的期望时间和成本、RNA是否需要保持完整选择特定的方案，具体包括酶消化、有机提取、强变性剂提取、乙醇和LiCl沉淀、CsCl和蔗糖密度梯度、阴离子交换层析、硅方法、寡核苷酸（dT）亲和层析等。
4 标本储存
大部分标本来源于试管血，包括血浆、PBMCs、细胞沉淀、全血细胞、白细胞层等。核酸可从这些标本中提取用于不同的分子诊断试验。选择的细胞分离或富集方法，以及细胞激活阶段或分化阶段会影响核酸的产量和质量。注意：中性粒细胞表达的mRNA水平一般很低，但包含全血标本的大部分基因组DNA。通过梯度离心得到的
PBMCs可能会明显降低DNA产量，因为该部分细胞不包括中性粒细胞。
4.1 DNA储存要求 DNA是相对比较稳定的大分子，室温储存8天的血液仍可用于DNA提取。一旦分离，DNA可在2-8℃下稳定至少1年。通常，DNA以液体的形式进行储存。事实上，如果分离的DNA在几天内用于PCR或内切酶消化，可直接用蒸馏水保存。Tris/EDTA(pH 7.2)为最佳的DNA储存液，可限制PH的变化，避免DNA自发降
解。冰冻核酸的长期储存仍能保留其主要特征。建议将DNA溶液冰冻储存于-70℃或更低的温度中。如果标本需要用于多个试验，应将DNA标本分成多份，小份冰冻于-70℃或以下，避免反复冻融引起核酸的降解，同时也降低了标本污染的概率。
4.2 RNA储存要求 RNA是极度不稳定的大分子。纯化RNA最好以沉淀的形式-70℃储存于乙醇中。储存纯化的RNA应使用无菌、干燥的塑料管，处理时应带上手套，并用焦碳酸二乙酯水处理去除管中的RNase。碱性条件（PH 7.1-7.5）较酸性和中性条件更能保护RNA标本。纯化的RNA在第一次冻融后可稳定存在3小时，反复冻融会导致RNA的降解。
4.3 外周血单个核细胞（PBMC）的低温储存 PBMCs可从EDTA、ACD或肝素抗凝血利用密度梯度离心法分离得到，其产量取决于每个患者的白细胞计数和分化程度。WBC计数为5000，淋巴细胞比例为40%的全血大约每毫升可获得2×106个细胞，因为密度梯度离心去除了大部分中性粒细胞。对未知细胞计数的全血通过密度梯度离心大概每毫升可获得1000000个细胞（主要为淋巴细胞）。
将细胞分成小份储存于聚乙烯小瓶中，放入数量冰冻容器中-70℃储存。用于体外功能分析的PBMC低温储存和融化应进行验证。建议用于体外功能研究的低温储存标本的生存率为80%，恢复率为75%。
建议以10%DMSO和11.25%蛋白的终浓度，用无血清细胞冻存培养基冰冻PBMC。冷冻剂如DMSO能减少冰冻过程中形成的冰量，降低溶液的浓度，以减少渗透效应。但是，这些化合物本身是高渗的，其加入或去除可引起渗透性损伤。
参考文献
[1] CLSI. MM13-A—Collection, Transport, Preparation,and Storage of Specimens for Molecular Methods; Approved Guideline. | 
