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血细胞分析仪是医院临床检验应用非常广泛的仪器之一，是指对一定体积内血细胞数量及异质性进行分析的仪器。20世纪90年代以来，随着电子技术、流式细胞技术、激光技术、电子计算机技术和新荧光化学物质等各种高新技术在血细胞分析仪中的应用.使血细胞分析仪的检测原理不断完善、测量参数不断增加、检测水平不断提高.尤其在白细胞五分类技术方面，已发展到利用多项技术(如射频、细胞化学染色、流式细胞术和荧光染色技术等)联合同时检测一个白细胞.再用先进的计算机技术区分、辨别经上述方法处理后的各自细胞间的细胞差别.综合分析实验数据，得出较为准确的白细胞分类结果。为临床疾病的诊断、治疗提供了重要的实验室依据。近年来。可以对白细胞进行五分类计数的血细胞分析仪已经普遍使用。本文就目前血细胞五分类测定中常用技术及其最新应用进展作一综述。 1 血细胞五分类技术的原理
1.1 流式细胞术
流式细胞术(flowcytometry，FCM)是一种综合应用光学、机械学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分子免疫学等学科技术，使被测溶液流经测量区域，并逐一检测其中每一个细胞的物理和化学特性，从而对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。 首先，待测细胞经处理或染色后被压人流动室，与此同时，不含细胞的缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管人口方向与待测样品流成一定角度，这样鞘液就能被包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在包绕下单行排列，依次通过检测区域.在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两个光源信号分别反映了细胞体积的大小和内部的信息.经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模，数转换器.将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，经计算机处理，可将分析结果显示在屏幕上。 为了保证细胞单个排列地逐一通过检测区域，鞘流技术在流式细胞术中被广泛应用。根据层流理论，由于两种液体的流速和压力不同。在一定条件下样品溶液与包裹它的鞘液在流动中可以保持相互分离并且同轴。同时鞘液流可以加速样品溶液中颗粒的流动并迫使他们的流动轨迹保持在液流的中轴线上，使细胞单排列地逐一通过检测区域，这便是所谓的液流聚焦原理 1_2 阻抗法
根据库尔特原理，将不良导体血液按一定比例稀释于等渗的电解液中，在小孔电极的两侧加一恒流源.在负压作用下，使稀释的血细胞通过小孔。当细胞通过截面时会由于电阻增大产生相应的脉冲，其脉冲的幅度与细胞的体积成正比，脉冲的频度与细胞的数量成正比。这便是著名的库尔特原理或称变阻脉冲原理。利用库尔特原理可以有效地区分淋巴及单核细胞。 1.3 激光散射法／多角度偏振光散射技术
根据光散射理论，当激光照射到流动室内流过的每一个细胞时，由于细胞的物理特性，部分光线从细胞上经不同的角度散射。其中，前向小角度散射光的光强可以反应细胞体积；大角度散射光的光强可以反应细胞核，浆复杂度和细胞颗粒的信息；而侧向散射光的光强可以反应细胞膜、核膜、细胞质的变化。因此，可以依据细胞表明光散射的特点对细胞进行分类。用激光光源产生的单色光束直接进入计数池的敏感区，在不同角度(10度～7O度)对每个细胞进行扫描分析，测定其散射光强度，从而提供细胞结构、形态的光散射信息。由于粗颗粒细胞的散射强度比细颗粒细胞更强，故光散射对细胞颗粒的构型和颗粒质量具有很好的区别能力。 多角度偏振散射技术用偏振激光束射照单个排列细胞，并进一步分辨细胞。该技术采用了l0度窄角和偏振加消偏振检测法，分辨能力有所提高。它首先测试中性，单核细胞，用0度～90度的散射数据，再测得90度D的衍射差，将嗜酸性和中性细胞分开.而嗜碱性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞则按其大小和内部结构不同的复杂性，所产生的散射光也各异，用可调较的门限加以区分。其采用特定程序自动储存分析数据，并经计算机软件处理，在屏幕上显示6个散点图和2个直方图。 1.4 各种细胞化学特性应用技术
利用五种白细胞自身不同的化学性质.应用相应的化学试剂加以区分 由于嗜酸性(或嗜碱性)粒细胞均有较强的碱性(或酸性)，因此在特殊的溶血剂作用下，经过特定时间及温度的孵育，可使除嗜酸性(嗜碱性)粒细胞之外的所有细胞溶解或萎缩.经处理之后的细胞根据阻抗脉冲计数法，可得相应嗜酸性(嗜碱性)细胞有效数值。 利用五种白细胞过氧化物酶活性的差异对白细胞进行染色，测定其酶反应强度，对白细胞进行分析。血液中五种白细胞的过氧化物酶活性排列顺序为：嗜酸性粒细胞>中性粒细胞>单核细胞。淋巴细胞和嗜碱性粒细胞均无过氧化物酶。将待测血液加入清洗剂和甲醛的等渗液体内经孵育，再加入过氧化氢和四氯一萘酚，细胞内过氧化酶分解产生氧离子，使四氯一萘酚显色并沉淀，并定位于酶反应部位。根据酶反应强度的不同，利用光电检测技术测定相应吸光度值的方法,用以区分嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞。 1.5 电导，射频法
与早期的三分类血液分析仪利用库尔特原理不同的是，它在内外电极上加了一个RF射频发生器。RF是射频电流的简称.它是一种高频交流变化电磁波。按照工作频率的不同，RF可以分为低频(LF)、高频(HF)、超高频(UHF)和微波等不同种类.不同频段的RF工作原理不同， 和HF频段一般采用电磁耦合原理，而UHF及微波频段的RF一般采用电磁反射原理。在血液分析仪中多采用高频电磁波，其原理是交变电流通过导体时，会在导体周围形成交变电磁场，形成电磁波。因导体的密度及导电性质等差异，其周围所形成的电磁场也不相同。因此当射频电流穿透细胞膜透入胞内时，由于核的大小、化学组分、颗粒多少以及浆核比例的不同，使RF信号发生不同的变化。借此可以将体积大小相同但内部结构不同的细胞区分开来，如淋巴细胞与嗜碱性细胞。 1.6 荧光法
利用不同细胞的细胞膜、胞内因子以及胞内DNA、RNA、胞内离子钙等不同染色特性，选用具有特异性抗原或抗体的荧光染料载体，使待分离的细胞分别标记相应的荧光物质，经过特定波长的激光照射激发出不同波长的荧光，利用各种PMT管检测荧光信号的个数，可以完成待检细胞的计数 如进一步分析计数淋巴细胞或网织红细胞等
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