[原创]色普法概论及原理

色谱发展史

最早创立色谱法的是俄国植物学家Tswett。他在研究植物叶子的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。当时Tswett把这种色带叫做“色谱”（Chromatographie，Tswett于1906年发表在德国植物学杂志上用此名，英译名为Chromatogra- phy），在这一方法中把玻璃管叫作“色谱柱”，碳酸钙叫作“固定相”，纯净的石油醚叫作“流动相”。
在Tswett提出色谱概念后的20多年里没有人关注这一伟大的发明。值到1931年德国的Kuhn和Lederer才重复了Tswett的某些实验，用氧化铝和碳酸钙分离了α-，β-，和γ-胡萝卜素，此后用这种方法分离了60多种这类色素。Martin和Synge在 1940年提出液液分配色谱法（Liquid－Liquid Partition Chromatography），即固定相是吸附在硅胶上的水，流动相是某种有机溶剂。1941年Martin和Syngee提出用气体代替液体作流动相的可能性，11年之后James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱方法（Gas－Liquid Chromatography），因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。在此基础上，1957年Golay开创了开管柱气相色谱法（Open－Tubular Column Chromatography），习惯上称为毛细管柱气相色谱法（Capillary Column Chromatography ）。1956年Van Deemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论，1965年Giddings总结和扩展了前人的色谱理论，为色谱的发展奠定了理论基础。另一方面早在1944年Consden等就发展了纸色谱，1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（TLC ）得以实际应用，而在1956年Stahl开发出薄层色谱板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。在60年代末把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，出现了高效液相色谱（HPLC）。80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到发展，但在90年代后未得到较广泛的应用。而在80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳”（CZE），在90年代得到广泛的发展和应用。同时集HPLC和CZE优点的毛细管电色谱在90年代后期受到重视。到21世纪色谱科学将在生命科学等前沿科学领域发挥不可代替的重要作用。

色谱法在分析化学中的地位和作用

色谱分析法的特点是它具有高超的分离能力，而各种分析对象又大都是混合物，为了分析鉴定它们是由什么物质组成和含量是多少，必须进行分离，所以色谱法成为许多分析方法的先决条件和必需的步骤。

色谱法的特点和优点

1．色谱法的特点
色谱法是以其高超的分离能力为特点，它的分离效率远远高于其它分离技术如蒸馏、萃取、离心等方法。
2．色谱法的优点

（1）	分离效率高。例如毛细管气相色谱柱（0.1~0.25μm i. d．）30~50m其理论塔板数可以到 7万~12万。而毛细管电泳柱一般都有几十万理论塔板数的柱效，至于凝胶毛细管电泳柱可达上千万理论塔板数的柱效。
（2）	应用范围广。它几乎可用于所有化合物的分离和测定，无论是有机物、无机物、低分子或高分子化合物，甚至有生物活性的生物大分子也可以进行分离和测定。
（3）	分析速度快。一般在几分钟到几十分钟就可以完成一次复杂样品的分离和分析。近来的小内径（0.1mm i. d．）、薄液膜（0.2μm）、短毛细管柱（1~10 m）比原来的方法提高速度5~10倍。
（4）	样品用量少。用极少的样品就可以完成一次分离和测定。
（5）	灵敏度高。例如GC可以分析几纳克的样品，FID可达10-2g／s，ECD达10-3g／s；检测限为10-9 g／L和10-12 g／L的浓度。
（6）	分离和测定一次完成。可以和多种波谱分析仪器联用。
（7）	易于自动化，可在工业流程中使用。

色谱法的定义和分类

色谱法或色谱分析（chromatography）也称之为色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，当溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。可完成这种分离的仪器即色谱仪。
色谱法的分类可按两相的状态及应用领域的不同分为两大类。
1. 按流动相和固定相的状态分类

2. 按使用领域不同对色谱仪的分类

各种色谱法的性能

色谱方法	GC 气相色谱仪	HPLC 高效液相色谱	SFC 超临界流体色谱仪	TLC 薄层色谱法	CE 毛细管电色谱仪
流动相 密度（g/mL） 扩散系数（cm2/s） 使用压力（MPa） 分子间作用力 酸碱性 升温 驱动方式 线速度（cm/s）	气体 0.001 1~10-2 0.2~1.0 无~微 - 可以 压力差 10~50	液体 1 5×10-5~10-6 ≈5~40 有 有 可以 压力差 0.01~0.5	高密度气体 0.2~0.3 10-3 ≈13 弱 无~微（有时改性剂呈酸碱性） 可以 压力差 ~10	液体 1 10-5~10-6 常压 有 有 - 毛细现象 ~0.01	液体 1 10-5~10-6 常压 有 有 - 电渗流 ~0.5
固定相 扩散系数（cm2/s） 膜厚 (μm) 分子间作用力	粘稠液体固体吸附剂键合分子层 10-5~10-7 0.1~10 有	固体吸附剂键合分子层 10-5~10-7 0.5~5 有	固体吸附剂键合分子层 10-6~10-7 0.1~5 有	硅胶，氧化铝，键合分子层 10-5~10-7 1nm 有	胶束，添加剂 - - 有
控制分离的因素 分子量 溶质的极性、官能团 分子量范围	分子量小的先流出 有影响 ≈1000	GPC分子量大的先流出 影响大 ≈10000000	有影响 ≈10000	影响大 ≈10000	分子量小的先流出 有影响 ≈1000000
样品适应性 气体 液体 固体（溶剂可溶的） 专一性样品 进样量（g）	可以 可以 可以 气体样品 挥发性液体 异构体 化学安定的样品 10-9~10-3	- 可以 可以 液体样品 热不稳定样品 异构体 离子性样品 10-9~10-1	- 可以 可以 分子量10000左右的齐聚物 　 10-9~10-3	- 可以 可以 液体样品 10-6~10-3	- 可以 可以 离子或中性样品，分子量大的样品 10-7~10-13
色谱柱 分析用填充柱（内径×长/cm×cm） 分析用毛细柱（内径×长/cm×cm）	0.2×500 （0.01~0.053）×（500~6000）	（0.4~0.6）×（5~25） （0.05~0.1）×（20~50）	（0.4~0.6）×（5~25） （0.005~0.01）×（30~50）	平面	（0.005~0.01）×（20~70）
检测器 通用 选择性	TCD，FID ECD，FPD	示差折光，蒸发光散射 荧光	FID UV	碘或硫酸 显色	电导 UV，荧光

色谱分离的本质

在色谱分离中，如果将样品注入色谱柱头，样品本身很快就会在固定相和流动相之间达到分配平衡。当流动相流过时，样品将在流动相和新的固定相上又达到分配平衡。同时，原来仍在固定相中的样品与新的流动相之间也会形成新的分配平衡。随着流动相不断的流过，它们就会携带发生分配平衡后而存在于流动相的样品沿着柱子向前移动。由于这过程涉及到两相之间的分配平衡，所以可以用分配系数K来进行定量讨论。 分配系数是在一定温度下，溶质在互不相溶的两相间浓度之比。色谱的分配系数是被分离组分在固定相和流动相之间浓度之比。分配系数的差异是所有色谱分离的实质性的原因。以K表示如下式：

式中C_s:每1mL固定相中溶解溶质的质量；
C_m:每1mL流动相中溶解溶质的质量。

色谱分离的塔板理论

塔板理论是将色谱柱与蒸馏塔类比为基础的半经验式的理论。塔板模型将一根色谱柱视为一个精馏塔，即色谱柱是由一系列连续的，相等的水平塔板组成，每一块塔板的高度用H表示，称为理论塔板高度。塔板理论假设：在每一块塔板上，溶质在两相中很快就达到平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前转移，而导引出一个描述色谱流出曲线的数学表示式：

式中

c:	色谱流出曲线上任意一点样品的浓度；
n:	理论塔板数；
m:	溶质的质量；
VR:	溶质的保留体积，即从进样到色谱峰极大点出现时通入色谱柱载气的体积；
V:	在色谱流出曲线上任意一点的保留体积。

典型的色谱图

在用热导检测器时，往色谱仪中注入少量空气的单一样品时，得到图5-1的典型气相色谱图

图5-1 典型气相色谱图

在图5-1中当没有样品进入色谱仪检测器时0 t是噪声随时间变化的曲线，一般是一条直线，叫做“基线”。h是峰高。

区域宽度

色谱峰的区域宽度是组分在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱区域宽度通常有三种方法：

1. 半峰宽（peak width at half height）(W_h/2) 是在峰高一半处的色谱峰的宽度，单位可用时间或距离表示。

2. 峰宽（peak width）(W) 是在流出曲线拐点处作切线，于基线相交与两点，此两点间的距离叫峰宽，有些书上叫做“基线宽度”

3. 标准偏差（σ） 即0.607倍峰高处的色谱峰宽的一半。

在这三种表示方法中以前两者使用较多，三者的关系是：

保留值

保留值是总称，具体参数的名称有以下一些：
1.死时间（dead time）(t_M)
一些不被固定相吸附或吸收的气体通过色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，以s或min为单位表示。
2.死体积（dead volume）(V_M)
指色谱柱中不被固定相占据的空间及色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和，等于死时间乘以载气的流速。
3.死区域（dead zone）(V_G)
指色谱柱中不被固定相占据的空间。
4. 保留时间（retention time）(t_R)
试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，它相应与样品到达柱末端的检测器所需的时间，以s或min为单位表示。
5. 调整保留时间（adjusted retention time）( )
某组分的保留时间扣除死时间后称为该组分的调整保留时间，即t_R－t_M。
6. 保留体积（retention volume）(V_R)
从注射样品到色谱峰顶出现时，通过色谱系统载气的体积，一般可用保留时间乘载气流速求得，以mL为单位表示。
7. 调整保留体积（adjusted retention volume）（ ）
某组分的保留体积扣除死体积后称为该组分的调整保留体积，即V_R－V_M。
8. 净保留体积（net retention volume）(V_N)
经压力修正的调整保留体积，即： 式中 j--色谱柱进口和出口之间的压力梯度校正系数。

（5-5b）

式中:

pi	--色谱柱进口压力；
po	--色谱柱出口压力。

9. 比保留体积（specific retention volume）(V_g)
把净保留体积进一步校正到单位质量固定液和273K时的保留体积，如下式：

（2-6）

式中:

VL	--固定液的体积；
ρL	--固定液的密度；
	--固定液的质量。

10. 相对保留值（relative retention）(r_i,s)
在一定色谱条件下被测化合物和标准化合物调整保留时间之比。

（2-7）

式中

	--被测化合物的调整保留时间；
	--标准化合物的调整保留时间。

很多文献用分离因子（Separation factor）α来表示相对保留值。
11. 保留指数（retention index）( I )
保留指数用以表示化合物在一定温度下在某种固定液上的相对保留值，具体说它是以一系列正构烷烃坐标准的相对保留值，其定义如下：

	--某化合物在某一固定液上的调整保留时间；
	--在同一固定液上，碳数为n和n+1的正构烷烃的调整保留时间，在测定时要求 ，规定在任何固定液上、任何温度下正烷烃的保留指数均为100n（n为正构烷烃的碳数）。

12. 保留指数差（△I）
化合物x在某一固定液s上测得的保留指数 减去x在角鲨烷固定液上得到的保留指数 ，即 ，△ 叫做化合物x在固定液s上的保留指数差。

容量因子

容量因子（也称之为分配容量capacity factor）K’的定义是在平衡状态下组分在固定相与流动相中质量之比，即

（5-10）

式中:
V_L--色谱柱内固定相的体积；
V_G--色谱柱内流动相的体积。
（5-10）式中的β叫做“相比率”。其含义是在色谱柱中流动相体积与固定相体积之比。填充柱气相色谱柱的β值在5~35的范围，而毛细管气相色谱柱的β值在50~200的范围。

色谱柱的柱效率和分离度

1. 柱效率（column efficiency）和溶剂效率（solvent efficiency）
色谱理论主要包括两方面的问题，即柱效率和溶剂效率。柱效率是指溶质通过色谱柱之后其区域宽度增加了多少，它与溶质在两相中的扩散及传质情况有关，这是所谓色谱的动力学过程。溶剂效率是与两个物质在固定相上的相对保留值大小有关，从微观角度讲是与两个物质和固定相（在液相色谱中还与流动相）的分子间作用力不同有关。这是所谓色谱的热力学过程。柱效率常以理论塔板数（n）或理论塔板高度 （H）表示。而溶剂效率是以相对保留值（r_i，s）表示。要提高柱效率，就得改善色谱柱性能和操作条件；要提高溶剂效率就得提高固定相的选择性。
2. 理论塔板数（n）的计算和测定
色谱柱的柱效率可以用理论板数（n），也可以用理论板高（HEPT，height equivelent to one theoretical plate）(H)表示。

H=L/n

（5-11）

式中L是色谱柱的柱长，L，H均以mm表示。 计算理论塔板数（n）的计算公式是：

(5-12)

测定理论塔板数（n）是在一定的色谱条件下（即一定的色谱柱，一定的柱温、流速下）注入某一测试样品，记录色谱图，测定色谱峰的半高峰宽（或峰宽）和进样点到色谱峰极大点的距离，二者的单位要一致。
3. 有效板数（n_eff）
为了消除色谱柱中死体积对柱效的影响，人们常用有效理论塔板数（n_eff）表征色谱柱的实际柱效，按下式计算 相应的有效理论塔板高度（H_eff）为

Heff＝L／neff

(5-14)

4. 溶剂效率
溶剂效率是固定相对某两个混合物分离能力的表征，即用r_i，s值表示：

(5-15)

r_i，s值又称作分离因子（α）、“选择性因子”，是描述固定相分离混合物能力的参数。
5. 分离度（resolution）（R）
分离度又称作分辨率。是把柱效率和溶剂效率结合在一起的参数，是表示色谱柱在一定的色谱条件下对混合物综合分离能力的指标。它是指2倍的峰顶距离除以两峰宽之和：

(5-16)

当R＝1时，两峰的峰面积有5％的重叠，即两峰分开的程度为95％。当R=1.5时，分离程度可达到99.7％，可视为达到基线分离。

各色谱参数间的关系

1. 保留时间和分配容量的关系

（5-17）

这是一个在色谱中很重要的公式，也可以写成下式：

（5-18）

式中 --载气的平均线流速； L--色谱柱柱长。 从（5－18）式可导出

（5-19）

2. 分离度、柱效率和容量因子间的关系
当某一物质对用某一色谱柱进行分离时，此两物质的α和K’已知，要使它们的分离度达到R，要求色谱柱的n _ne为:

（5-20）

把（5-20）改写一下，又可得到下边的重要公式：

（5-21）

液相色谱法中常用术语和参数

在高效液相色谱中有许多术语和参数与气相色谱相同，下面只就高效液相色谱中特有的一些术语和参数加以说明。
1. 色谱图和保留值
其表示方法和参数与气相色谱几乎完全相同，只有个别地方的表示略有差别。在高效液相色谱中容量因子用k’表示，如下式：

(5-22)

在高效液相色谱中没有比保留体积（V_g）和保留指数（I）的概念，而有一些独有的参数：
（1）粒间体积（interstitial volume）（Vo ）
色谱柱填充剂颗粒间隙中流动相所占有的体积。
（2）（多孔填充剂的）孔体积（pore volume[of porous packing]）（V）
色谱柱中多孔填充剂的所有孔洞中流动相所占有的体积。
（3）柱外体积（extra-columnvolume）（V _ext）
从进样系统到检测器之间色谱柱以外的液路部分中流动相所占有的体积。
（4）液体总体积（total liquid volume）（V_tot）
粒间体积，孔体积和柱外体积之和。 V_tot= V_g+ V_o+ V _ext （2-23）
（5）淋洗体积（Emlution volume）（V）
从进样开始计算的通过色谱柱的实际淋洗体积。
（6）流体力学体积（hydrodynamic volume）（V_h）
每摩尔的高分子化合物在溶液中运动时所占的体积，与高分子化合物的相对分子质量和特性粘度的乘积成正比。
2. 和柱效能有关的参数
大部分的参数表示方法和气相色谱相同，如表示柱效率的理论板数，但在高效液相色谱中也有一些特有的参数：
（1）折合板高（reduced plate heigh）（h_r） 折合成固定相单位粒径的理论板高。
（2）折合流动相速度 （v_r）

典型的色谱图

速率理论是在塔板理论的基础之上发展起来的，它吸收了塔板理论中理论塔板高度的概念，并同时考虑理论塔板高度的动力学因素。指出，填充性的柱效应受分子扩散、传质阻力、载气流速等因素的影响，从而较好的解释了影响理论塔板高度的各种因素:

		(5-24)
A:	涡流扩散项			B:	纵向扩散项
C:	传质阻力项			:	载气的平均流速

当 一定时，只有当A、B、C较小是，H才能小，柱效才会高，反之则柱效较低，色谱峰扩张。
1. 涡流扩散项A
在填充色谱柱中，流动相通过填充物的不规则空隙时，其流动方向不断的改变，因而形成紊乱的类似“涡流”的波动。对于填充物的大小，形状各异以及填充的不均匀性，使组分各分子在色谱柱中经过的通道直径和长度不同，从而使它们在柱中的停留时间不等，其结果使色谱峰边宽。色谱峰变宽的程度由下式决定：

(5-25)

上式表明，A与填充物的平均直径 的大小和填充的不规则因子λ有关，与流动相的性质，线速度和组分性质无关，使用粒度细和颗粒均匀的填料，均匀填充，是减小涡流的有效途径。
2. 气体分子扩散项B
当样品以“塞子”形式进入色谱柱后，便在色谱柱所轴向上造成浓度梯度，使组分分子产生浓度扩散，故该项也称为纵向扩散项。气体分子扩散项的系数为：

(5-26)

γ是填充柱内气体扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，D_G为组分在气相中的扩散系数(m².s^-1)，B∝D_G，由于D_G除与组分性质有关外，还与组分在气相中的停留时间，载气的性质，柱温等因素有关。因此，为了减小B项，可采用较高的载气流速，使用相对分子质量较大的载气，控制较低的柱温。
3. 传质阻力C
物质系统由于浓度不均匀而发生的物质迁移过程,称为传质。影响这个过程进行速度的阻力，叫传质阻力。传质阻力系数C包括气相传质阻力系数C_g和液相传质阻力系数C_l ,即C=C_g+C_l。
气相传质过程是指试样在气相和气液界面上的传质。由于传质阻力的存在，使得试样在、两界面上不能瞬间达到分配平衡。所以，有的分子还来不及进入两相界面，,就被气相带走，出现超前现象。上面这些现象均将造成谱峰扩宽.对于填充柱，气相传质阻力系数C_g为：

(5-27)

从上式可以看出，气相传质阻力与填充物粒度的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数成反比，因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体做载气,可减少C_g,提高柱效。
与气相传质阻力一样，在气液色谱中，,液相传质阻力也回引起谱峰的扩张，,不过它是发生在气液界面和固定相之间，液相传质阻力系数C_l为：

(5-28)

由上式可见,减小固定液的液膜厚度 ，增大组分在液相中的扩散系数，可以减小C_l。显然，降低固定液的含量，可以降低液膜厚度。但K’值随之变小,又会使C_l增大,当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低。因此，一般采用比表面积较大的载体来降低膜厚度，应该指出，提高柱温，,虽然可以增大D_l，但会使K’值减小，为了保持适当的C_l值，应该控制适宜的柱温。
综上得Van Deemter 方程:

(5-29)

这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填充粒度的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。
但是应该指出，,除上述造成谱峰扩宽的因素外，还应该考虑柱径，柱长等因素的影响。
速率理论能较解释色谱过程，得到了大家的公认。但是，速率理论却无法解决组分分配系数K’的计算，有待色谱过程热力学来解释。

液相速率理论

1. 高效液相色谱的速率理论方程

在液相色谱中速率方程以下式表示：

（5-30）

其中涡流扩散项为 流动相传质阻力项是:

（5-31）

纵向扩散项是

（5-32）

停滞流动相扩散项是

（5-33）

固定相传质阻力项是

（5-34）

从式（5-29）到式（5-32）中，C_e、C_m、C_d、C_sm、C_s是理论塔板高度系数， 是填料子均粒径， 是固定相膜厚，u是流动相流速，D_s是在固定相中的扩散系数，D_m是在流动相中的扩散系数，A、B、C、D是给定的柱常数。
2. 高效液相色谱的折合参数
在高效液相色谱中Giddings提出折合参数，即折合板高和折合流动相速度。
(1) 折合板高（ h_r ）用下式表示：

（5-35）

(2) 折合流动相速度（ v_r ）用下式表示：

（5-36）

用折合参数表示的速率理论方程如下：

（5-37）

式中，C_e、C_m、C_d、C_sm是取决于色谱柱填充好坏的常数。

其它速率理论的表达方程

1. Giddings的速率理论方程
1961年Giddings对Van Deemter方程做了修正，认为流动相流速对涡流扩散项是有影响的，他的速率理论方程如下：

(5-38)

2. Huber的速率理论方程
Huber于1967年又进一步把Giddings方程做了修改：

(5-39)

式中，A、B、C、D、E均为常数。这一方程适用于各种色谱。
3. Horvath 速率理论方程
1976 年 Horvath 和 Lin 把 Huber 的速率理论方程修正为：

(5-40)

式中，A、B、C、D、E均为常数。这一方程适用于各种色谱。
4. Knox速率理论方程
1976年Knox等提出速率理论的折合参数方程：

(5-41)