WS
中华人民共和国卫生行业标准
厌氧菌的抗微生物药敏感试验方法
Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria
200×-××-××发布 200×-××-××实施
中华人民共和国卫生部 发布
目次
前言
1． 范围
2． 引用标准
3． 定义
4． 进行厌氧菌敏感试验的指征
5． 厌氧菌敏感试验的局限性
6． 抗微生物药
7． 常规试验和报告中抗微生物药的选择
8． 稀释试验接种物制备
9． 参考琼脂稀释法（Wadsworth法）
10. 微量肉汤稀释法
11.β-内酰胺酶试验
12. 质量控制的方法
附录：培养基和补充剂的制备
表1：厌氧菌试验应考虑的抗微生物药推荐分组
表2：解释标准和相对应最低抑菌浓度（MIC）值
表3：制备抗微生物药贮存液需要的溶剂和稀释液
表4：琼脂稀释法或微量肉汤稀释法敏感试验中抗微生物药稀释液的制备方案
表5：参比琼脂稀释试验标质控菌株的最低抑菌浓度（MIC）的质控允许范围
表6：微量肉汤稀释试验质控菌株的最低抑菌浓度（MIC）的质控允许范围
前言
临床细菌分离中由于厌氧菌感染日渐增多，厌氧菌的药敏试验和耐药监测已提到日程上。本标准是在卫生部颁发的《全国临床检验操作规程》（第三版）的基础上，依据美国国家临床实验室标准化委员会（National Committee for Clinical Laboratory Standards,NCCLS）M11-A5文件－厌氧菌的抗微生物药敏感试验方法（已批准的标准－第五版）[ISBN 1-56238-429-5]，结合中国国情及卫生系统的实际情况和要求制定。
本标准从2004年 月 日起实施。
本标准由卫生部提出。
本标准起草单位：北京大学人民医院检验科。
本标准主要起草人：张正 岳志红。
本标准由卫生部委托卫生部临床检验中心负责解释。
中华人民共和国卫生行业标准
WS/T×××-200×
厌氧菌的抗微生物药敏感试验方法
Methods for Antimicrobial Susceptibility
Testing of Anaerobic Bacteria
1. 范围
本文件所述方法主要用于测试普通分离到的厌氧菌。琼脂稀释法可用于测试大多数厌氧病原菌。目前微量肉汤稀释法仅用于测试脆弱拟杆菌菌群的病原菌。本标准适用于从事厌氧菌抗微生物药敏感试验的临床实验室使用。
2. 引用标准
下列标准条文主要根据美国NCCLS的M11-A5文件和中华人民共和国卫生部医政司编制的《全国临床检验操作规程》（第三版）而制定。
3. 定义
3.1琼脂稀释敏感试验
将某一种抗微生物药的系列浓度混入用于敏感试验的琼脂生长培养基进行的抗微生物药敏感试验。
3.2敏感
指该菌株所致感染可以用推荐用于此型感染及病原菌的抗微生物药剂量进行恰当地治疗。
3.3中介
药物在生理浓集的部位具有临床效力或者可用高于正常剂量的药物进行治疗；此还包括一个“缓冲区”可以防止微小的，未能控制的技术因素造成重大的结果解释错误。
3.4 耐药
指常规剂量抗微生物药通常达到的浓度不能抑制该菌株的生长和/或该菌株的MIC落于某范围内。在此范围内，可存在某些特定的耐药机制（如β-内酰胺酶类），并且治疗研究显示其临床疗效并不可靠。
3.5最小抑菌浓度
琼脂或肉汤稀释敏感试验中抗微生物药抑制某一种微生物可见生长的最低浓度。
4. 进行厌氧菌敏感试验的指征
临床上有厌氧菌感染存在，并在实验室分离出厌氧菌，原则上均应进行抗微生物药敏感试验。
4.1 常规试验
从脑脓肿、心内膜炎、骨髓炎、关节感染、人工装置或人工血管感染和菌血症分离到的特殊感染的标本应该测试，并应参考临床医生的合理建议。
当感染的性质不清楚，标本含有内源性厌氧菌菌群，而且病原菌与正在治疗的感染关系很少时，通常不必做敏感试验。当存在多种厌氧菌时，参考临床情况选择可能引起厌氧菌感染的最重要菌种进行敏感试验。一般分离到拟杆菌属、普雷沃氏菌属、梭杆菌属。梭菌属、嗜胆菌属和萨顿氏菌属的一些菌种应做敏感试验。
敏感试验应使用分纯后菌悬液。不能直接用临床标本进行敏感试验。MIC试验一般采用倍比稀释，采用本标准推荐方法，做好质控，结果报告采用在实际终点时的一个倍比稀释范围内较为科学。例如：终点为16μg/mL，真正报告应8μg/ml-32μg/ml范围更好。并做出敏感、中介或耐药判断，以供临床参考。
4.2 监测试验
当技术条件不允许每个实验室都进行厌氧菌敏感试验时，建议当地建立参考实验室，收集一定量临床菌株（不少于50-100株），集中测试后公布结果供大家参考。
5. 厌氧菌敏感试验的局限性
体外结果不足以预测某个病人对厌氧菌感染治疗的反应，仅供临床选药参考。此标准的试验方法也并不一定适用于所有的厌氧菌，以下2点需考虑。
5.1 折点和临床相关
关于确定厌氧菌对大多数抗微生物药的敏感性的折点，现在并无一致意见。目前折点的确定是基于动物模型或需氧和厌氧菌多重感染的病人的临床试验结果。因为大多数厌氧菌感染发生于密闭空间，涉及多种微生物，单一抗微生物药抗单一微生物的体外活性并不直接与其体内效力相关。
除数目分布和临床效力之外，MIC结果的敏感和中介折点解释是基于最大的推荐剂量获得的血清水平，因为厌氧菌感染通常推荐最大剂量用药。建立中介范围是因为有些药物难于判读终点和MIC在折点附近聚集。
5.2 病原菌
琼脂稀释法适用于测试多种不同的厌氧菌。至今为止，微量肉汤稀释法仅限于测试脆弱拟杆菌菌群。当测试菌呈蔓延生长时（例如艰难梭菌或破伤风梭菌），则需要尽量在琼脂平板上划开接种物。而对于败毒梭菌，每个平板只能测试一个分离株。
6. 抗微生物药
6.1 来源
抗微生物药标准品或参考药品可直接来自厂商，或来自中国药品及食品监督管理局检定所，或其他商业途径。不应把非肠道的制品用于敏感试验。可接受的药品应贴有标签，标明药品的通用名，批号，分析活力（常用每mg药品中含μg或国际单位（IU）表示）和有效期。贮存于规定的温度和湿度中。用时防止冷凝水进入。
6.2 抗微生物药的称量
实验室必须根据该批待用药品的分析结果来标化其抗微生物药溶液。抗微生物药品应使用经计量认证的分析天平称量。公式如下：
重量(mg)=体积（mL）×所需浓度（μg/mL）
分析活力（μg/mg）
或
体积（mL）=重量(mg) ×分析活力（μg/mg）
所需浓度（μg/mL）
6.3 制备贮存液
抗微生物药贮存液制备的浓度一般应该至少为1,000μg/mL(如1,280μg/mL)或者是最高测试浓度的10倍。某些药物必须溶解于非水溶剂中。此时，应使用尽量少的溶剂来溶解抗微生物药。最终的贮存液可用水或表3所述的合适的稀释剂进行稀释。贮存液分装后贮存于规定温度下，一般-60℃可保存半年。
6.4 测试浓度的数目
一种特定抗微生物药的测试浓度应包含表2所示的解释性折点，但实测的浓度数目是由实验室决定的。MIC结果报告推荐选用五个或更多浓度。建议选用的范围应包涵质控菌株的在控数值。
7. 常规试验和报告中抗微生物药的选择
敏感试验抗微生物药品种类选择可参考表1。在实际应用中，应结合我国实情，参考实验室所在的临床单位医生及控感科意见做出合适选择，不断积累经验。
完整的报告单应包括患者一般资料（姓名、性别、年龄和病理号等）。药品名称应按照我国药典颁布名称。菌种名称按照卫生部已公布名词标准。应报告敏感、中介和耐药。
8. 稀释试验接种物制备
受试菌应是从强化布氏血琼脂选择经充足时间孵育（24-48小时）产生的合适大小的菌落。菌落直径通常至少1毫米。快速生长菌如脆弱拟杆菌菌群和产气荚膜梭菌可经24小时孵育后测试，而其它大多数厌氧菌需要48小时孵育。对于缓慢生长的厌氧菌，如嗜胆菌属和纤细弯曲杆菌，可以从多个琼脂平板制备接种物以保证标准化的准确。可通过生长法或直接菌落悬液法制备接种物。
8.1 制备接种物时的浊度标准
为使敏感试验的接种浓度标准化，应使用一个等同于0.5号麦氏（McFarland）标准管的BaSO4浊度标准管或其光学等同物（如乳胶颗粒悬液）。BaSO4的0.5号麦氏标准管制备见附录。
8.2分离株的贮存和复苏
8.2.1 冷冻
大多数厌氧菌可在20％甘油中在-60℃或更低温度保存数年。将四份48小时肉汤培养物转移到含有一份无菌甘油的无菌玻璃瓶中。充分混匀成均一悬液后冷冻。预还原时使用不加糖的疱肉培养基。
另外，也可将48小时平板培养的若干菌落直接悬浮于20％灭菌脱脂牛奶中，-60℃冷冻。
8.2.2 复苏
冻存的分离株必须在强化布氏血琼脂上至少传代两次，用于敏感试验前必须证明其纯度。
8.3 生长法
（1） 从强化布氏血琼脂选择经24小时或充足时间孵育产生的合适大小的菌落（直径至少1毫米）。挑取形态特征完全一致的至少5个菌落，或用3mm直径的接种环取满一环，接种于无指示剂的硫代硫酸盐培养基。如果此步骤使用厌氧箱，可使用强化布氏肉汤，强化脑心浸液或Schaedler氏肉汤替代硫代硫酸盐肉汤。
（2） 孵育肉汤6-24小时或直至获得足够浊度。
（3） 加入布氏肉汤或其它使用前预还原或煮沸后冷却的肉汤，调整浊度等于0.5号麦氏标准。对于大肠杆菌ATCC25922或脆弱拟杆菌ATCC25285，此时悬液中细菌数约为1-2×108CFU/mL。但应注意到不同厌氧菌分离株接种大小的变化。
8.4 直接菌落悬液法
（1） 此法是从孵育了24-48小时强化布氏血琼脂平板挑取菌落。制备悬液时平板在有氧环境中不应超过30分钟。
（2） 轻轻挑取形态特征完全一致的至少5个菌落，直接转移到布氏肉汤或其它使用前预还原或煮沸后冷却的肉汤，获得相当于0.5麦氏标准的浊度。
（3） 此法制备厌氧菌的一些菌种菌悬液计数会轻度升高。
9. 参考琼脂稀释法（Wadsworth法）
9.1 试剂和材料
9.1.1 厌氧罐（箱）
采用环境含4-7％CO2厌氧罐（箱），并应有无氧状态指示剂。
9.1.2 强化布氏琼脂
使用的培养基是每mL布氏琼脂中添加5μg氯化血红素、1μg维生素K1和5％脱纤维羊血(v/v)。布氏琼脂的组成和制备，补充剂的制备和添加详见附录。也可提前配制琼脂，使用当天融化。制备抗微生物药稀释液后，抗微生物药和脱纤维羊血一起加入到融化琼脂中。
9.2 琼脂稀释平板的制备步骤
开始前，确定抗微生物药及其所用浓度。制备琼脂稀释平板时，15×100圆形平板需要20mL琼脂，方形平板需要30mL。平板的制备是将一份10×抗微生物药溶液加入到九份琼脂中。例如：制备20mL琼脂的圆形平板，需要在17mL已添加氯化血红素和维生素K1的融化的布氏琼脂（保持在45℃-50℃）中加入1mL脱纤维羊血和2mL10×抗微生物药溶液。方形平板则是25.5mL布氏琼脂、1.5mL脱纤维羊血和3mL10×抗微生物药溶液。
9.2.1 制备琼脂空白
（1） 试验前或试验中，准备足够已添加维生素K1和氯化血红素的布氏琼脂，分配合适的量到试管中。每种抗微生物药的每个浓度准备一管。
（2） 如果试验当天使用，分配后置于48℃-50℃水浴。如果提前制备，融化培养基（沸腾水浴，微波炉或高压锅），置于水浴（48℃-50℃）中冷却。
9.2.2 制备抗微生物药稀释液
（1） 融化以前制备的抗微生物药贮存液，或试验当天制备。
（2） 将设计好数量（见表4）的灭菌蒸馏水加入相应管中，制备稀释液空白。
（3） 使用表4所述稀释规则， 1:2，1:4，和1:8连续稀释制备中间浓度（10×）抗微生物药溶液，而不是直接倍比稀释。此方法制备稀释液可使稀释错误最小化。
9.2.3 制备琼脂稀释平板
（1） 标记制备的每一种抗微生物药的每一种浓度的平板，将平板置于水平台面上。
（2） 对于制备的每一种抗微生物药浓度，将1mL脱纤维羊血（对于方形平板1.5mL）和2mL10×抗微生物药溶液（对于方形平板3mL）加入到17mL融化并冷却的强化布氏琼脂（对于方形平板25.5mL）试管中。盖紧试管盖子，轻轻翻转数次混匀，小心不要产生气泡。倒入平板，固化。
（3） 如果测试一种抗微生物药，应准备另外四个不加抗微生物药的平板，和以上（2）相同的步骤，但用灭菌蒸馏水替代抗微生物药溶液。对于另外测试的每一种抗微生物药，准备另外一个不加抗微生物药的平板。
（4） 琼脂固化后，可将平板盖子半开置于层流罩或温箱约30分钟使其干燥。或者是翻转平板将琼脂底盖支在盖子上。
9.2.4 琼脂稀释平板的贮存
（1） 用于常规试验，试验前密封于塑料袋中于2℃-8℃贮存，不超过7天。
（2） 用于研究和评估目的，推荐贮存期不超过72小时。
（3） 含亚胺培南，克拉维酸或其它已知不稳定的β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合的抗微生物药的平板必须在试验当天配制。
9.3 接种琼脂稀释平板
接种物接种到琼脂表面的最简便的方法是使用多点接种器取1-2μL接种到琼脂表面。那么最终琼脂上接种物每点接近105CFU。由于大多数厌氧菌能暂时容忍暴露于氧气，所有操作可在外界环境中进行。一些苛养菌分离株则必需使用预还原平板和在厌氧环境中进行所有操作。
（1） 使微生物生长到浊度等于0.5号麦氏标准或将菌落直接制成悬液到相同浊度，制备标准化的接种物。
（2） 试管按顺序排列在架子上，将少量体积（约0.5mL）移至多点接种器的相应孔中。在琼脂平板上做标记，以标明接种点的方位。
（3） 小心避免飞溅。
（4） 顺序：从最低到最高的药物浓度依次接种。
（5） 质控：试验开始时首先接种两个无抗微生物药的对照平板。其中一个平板标记“pre-O2”（检查需氧菌污染），另外一个平板标记“pre-Ana”（厌氧菌最初生长对照）。每一系列平板之间，接种一个无抗微生物药的对照平板做生长对照。最后，再次接种两个平板，标记为“post-O2”和“post-Ana”，来证实最终病原菌生长力和纯度。
9.4 孵育琼脂稀释平板
（1） 平板一旦变干，翻转后置于厌氧罐或替代厌氧环境中35℃孵育42-48小时。
（2） 有氧孵育平板（证实有氧环境中未能生长）应置于含有5％CO2环境中35℃孵育42-48小时。
9.5 判读琼脂稀释终点
（1） 在黑色不反光的背景下观察每一平板。首先判读对照平板，寻找需氧菌可能污染或孔间交叉污染。如果检测到污染，则必需重新测试。
（2） 判读MIC终点是和厌氧菌对照平板相比生长特征发生显著抑制的测试平板的浓度。样本的一个显著生长变化包括薄雾状、多个细小菌落，或一个到数个正常大小菌落。
10. 微量肉汤稀释法
此法仅适用于测试脆弱拟杆菌菌群。
10.1 试剂和材料
10.1.1 厌氧罐（箱）
附录所述琼脂稀释法条件同样也适用于微量肉汤稀释法。
10.1.2 强化布氏肉汤
布氏肉汤的组成和制备，补充剂的制备和添加详见附录。
10.2 微量肉汤稀释板准备
（1） 本法被称为“微量稀释”是因为使用了小体积的肉汤。这些小体积肉汤被分配到无菌塑料微量稀释板。每个小孔至少应装0.1mL肉汤。
（2） 为制备（10×）抗微生物药溶液，应将浓缩的抗微生物药贮存液按表4所述内容进行稀释或进行倍比稀释。将一份10×抗微生物药溶液加入到九份肉汤中，得到所需最终浓度。
（3） 制备微量稀释板的最简便方法是使用分配装置。它可以用至少10mL肉汤制成的抗微生物药稀释液按照每孔0.1（±0.02）mL的量分配到标准的96孔中。
（4） 加完各种抗微生物药稀释液的微量稀释板应使用塑料袋密封并立即置于冰箱<-20℃（最好<-60℃）贮存。某些药物如克拉维酸和亚胺培南，必须贮存在-60℃以下。应防止反复冻融。
10.3 微量肉汤稀释板的接种
使微生物生长到浊度等于0.5号麦氏标准或将菌落直接制成悬液得到相同浊度，制备标准化的接种物。
（1） 调整好的接种菌悬液最好在15分钟内用水或盐水稀释，接种后每管或每孔大约含1×106CFU/mL。为获得此最终接种物而采取的稀释步骤，可因接种物加到单个孔的加样方法不同而不同，因此对于每一种情况都必须进行计算。计算时必须知道微量稀释试验要加到孔内的接种物的确切体积。例如，如果孔内培养基体积是0.1mL，接种物体积为0.01mL,那么应将0.5号麦氏悬液（约1.5×108CFU/mL）按1:15稀释以获得1×107CFU/mL的菌液。当取0.01mL此菌液接种肉汤时，细菌的最终测试浓度为1×106CFU/mL(或1×105CFU/孔)。
（2） 按上述方法对接种物进行标准化后15分钟内，可以用接种装置取体积不超过小孔体积10％的接种物（如在0.1mL抗微生物药液中接种物应≤10µL）接种微量稀释板的每个孔。相反，如果用0.05mL的吸管，每孔的内容物将被1:2稀释。
（3） 为菌落计数，实验室应经常用脆弱拟杆菌ATCC25285练习，以保证技术熟练。
10.4 微量肉汤稀释板孵育
