PCR原理

PCR基因扩增的原理及应用

第一节 聚合酶链反应

一、PCR(polymerase chain reaction,PCR)的基本原理

1、掌握PCR的定义及PCR的工作原理。PCR技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术，是一种在体外（试管、切片…）扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到2³⁰拷贝（约为10⁹个分子）。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。

2、掌握PCR反应的基本步骤。PCR反应的基本步骤包括高温变性（denaturation）；低温退火（annealing）；中温延伸（extension）三步反应。

二、PCR 引物设计

1、掌握PCR引物设计的原则。PCR反应的特异性及成功与否将与引物设计的好坏直接相关，PCR引物的设计又是立足于模板序列，而模板序列必须是已知的。PCR作为一个体外酶促反应，其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。

2、掌握引物设计的方法。（1）手工设计：以基因或cDNA的5’→3’方向的单链为标准，确定待扩增片段两侧的引物序列。按5’→3’方向，照抄模板的序列，先写下5’端引物的序列；然后根据模板3’的序列，写下由5’→3’方向的互补链的碱基序列，即为3’引物的序列。（2）计算机软

件设计引物：目前在Internet网上提供很多免费在线引物设计程序，根据PCR引物设计的基本原则，输入诸如模板序列﹑扩增区域﹑扩增子长度﹑引物长度等限定参数时，便可得到有关引物最佳序列﹑引物起始碱基位置﹑引物的Tm值﹑引物GC%﹑引物的二级结构（如自身二聚体形成的发夹结构﹑引物间二聚体）﹑模板和引物结合的热函﹑自由能等热力学参数。能提供PCR引物设计程序的网站有：http：//www.genome.wi.mit.edu等, 不同的程序都有自己的特色，但都能满足设计引物的基本需要。此外还可以与有些生物技术公司联系，购买商品化的引物设计软件。

三、模板的制备

了解PCR的模板的种类及制备方法。DNA和RNA均可作为PCR的模板。DNA可以直接作模板加入反应体系进行扩增，RNA的扩增需要逆转录为cDNA后才能进行PCR扩增，故又称这种扩增方式为RT-PCR。

核酸模板的取材主要依据PCR的扩增对象，常见的病原体标本有病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等。病理生理标本有细胞、血液、绒毛、羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养细胞系。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。还可从考古样品制备核酸模板。

四、PCR技术的特点

了解PCR技术的特点。检验PCR扩增效率的指标为特异性、高效性和忠实性。PCR技术有如下特点：（1）操作简便；（2）省时；（3）灵敏度高；（4）特异性强；（5）模板材料易获得；（6）有一程度的单核苷酸错误掺入；（7）TagDNA聚合酶催化的PCR扩增终产物3’端加尾，这种多出来的“毛边”碱基几乎总是A；（8）PCR反应过程遵循酶促动力学规律。

五、PCR基本反应及反应条件的控制

熟悉PCR的基本反应及了解PCR反应条件的优化。

PCR的基本反应包括以DNA为模板的反应和以mRNA为模板的反应。

PCR反应条件的优化包括控制引物浓度、调整缓冲液浓度及pH值、控制Mg²⁺离子和dNTP浓度、采用合适的耐热DNA聚合酶、设置合理的循环参数和循环数等。

六、PCR实验中应注意的事项

了解PCR实验中应注意的事项。由于PCR反应极强的扩增能力和检测的灵敏性，微量样品污染便有可能导致假阳性结果的出现。为此在实验操作中应谨防污染的发生，并设置严格的对照，以提高PCR结果的正确性。

七、PCR技术的主要类型

了解PCR技术的主要类型及其应用。

PCR技术的主要类型有1、筑巢PCR；2、共享引物PCR；3、多重PCR； 4、不对称PCR；5、锚定PCR；6、反向PCR；7、彩色PCR；8、原位PCR；9、定量PCR；10、差异显示PCR；11、重组PCR等。

这些技术具其较高的实用性而在各个领域广泛使用。

八、PCR 技术的应用

了解PCR技术在医学及分子生物学中的应用。PCR技术广泛的应用于遗传性疾病的诊断，传染病病原体的检测、法医学，考古学和分子生物学的各个领域。

PCR基因扩增仪的类型

2002.12.05

型　PCR基因扩增仪的设计均按照DNA变性、复性和延伸三个环节以及温度均恒、传导快和升降温迅速等原则，结合传感技术、微电子技术和电子计算机等技术发展而成的自动化和智能化的仪器设备，下面仅从保温和变温的角度介绍几类PCR仪的原理。

1. 水浴式PCR基因扩增仪　水浴式PCR基因扩增仪一般由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成，样品管分别浸于三个水浴槽中，完成变性、复性和延伸三个过程，反应管在每个槽中停留的时间和槽间移动通过微电脑及其控制的机械臂完成。该仪温度可调、恒温精度高、温度均匀，价格低廉，适用于基层实验室使用，但机械臂易出故障，水浴槽中水份易蒸发（覆盖矿物油可防止蒸发），体积较大。国内生产厂家有：华美生物工程公司(ZW－1型)，北京新技术研究所（1109型），天津第二医学院(TE－1型)，中科院遗传研究所（PCR－90A型），上海复旦生物技术所（FR－800型）等。此外还有一类水浴式PCR仪，只有一个固定样品槽，通过微机控制将不同温度的水泵入或排出达到温度控制完成DNA扩增的目的，此类型的PCR仪应用较少。

2. 气流式PCR基因扩增仪　气流式PCR仪主要由对流恒温箱（机壳）、热气源、冷气源、控制器等组成，将样品管置于对流恒温箱中，由控制器控制热空气枪、热辐射源和大功力风扇，以提供冷热空气，变换反应管的温度。该仪的成本低，整个系统没有液体流动，安全度高。国内生产厂家有：军事医学科学院（PTC－51B型、JK－232B型），上海复生公司（FS－318和818型）；国外有美国安普科技中心1605型毛细管气流式PCR扩增仪。

3. 金属模块式PCR基因扩增仪　此类扩增仪的核心为铝或不锈钢加热块，上面分布数量不等的样品管孔，采用电阻加热、压缩机制冷、半导体调制温度或电子调制温度。该机体积小，升降温速度快，样品基座温度准确、均一度高，自动化程度高，扩增程序容量较大，检测样品数目多，可用于普通0.5ml管、薄壁管DNA扩增和原位DNA扩增。操作简单、方便，检测结果稳定可靠性高，但价格比较昂贵，适宜于大型综合性科研机构或诊断、检疫单位使用。是目前国内外生产和使用较为普遍的PCR基因扩增仪。国内外生产厂家主要有美国PE公司（PT系列）、MJ公司（PCT系列）、Ericomp公司（TCX系列）等等，英国Techne公司MW－1型，珠海黑马医学仪器公司（Hema 480型），西安康怡公司CY系列，南京桑利司（SL－1型），军事医学科学院（JK－236B型）和中科院遗传研究所（PCR－90B型）等。