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流式细胞仪常用试剂配制
1．氯化铵溶血剂(Ammonium chloride lysing solution,)
贮存液(10′)：
80.2g NH4Cl (1.5M)
8.4g NaHCO3(100mM)
3.7g EDTA Na2(10mM)
蒸馏水900 ml
调节pH至7.4 (用1N HCl 或NaOH)
加蒸馏水至1升
4oC保存6个月以内
工作液(1′)：蒸馏水1:9稀释, 新鲜配制, 冷藏保存
注: 1) 贮存液不可小于10′, 否则会形成碳酸铵而失效
2) NaHCO3可由10g KHCO3替代, EDTA Na2可由3.66g EDTA Na4(8.2mM)替代
3) 有些科研工作者习惯采用1/10浓度的EDTA, 即 1mM EDTA Na2或0.32mM EDTA Na4
西苑医院：16.04 g NH4Cl (1.5M)+1.68g NaHCO3/2000ml 4oC保存
2．PBS(phosphate-buffered saline, 磷酸缓冲液)配制
0.23 g NaH2PO4 (无水; 1.9 mM)
1.15 g Na2HPO4 (无水; 8.1 mM)
9.00 g NaCl (154 mM)
加蒸馏水至 900 ml
若需要, 用1M NaOH或1M HCl调节pH至7.2~7.4
过滤除菌, 4oC保存
注: 1) 不调pH值, pH通常约为7.3
2) 有些实验室将PBS配成 10′浓缩液, 用时稀释
3．1% 多聚甲醛(paraformaldehyde)固定液配制
0. 5g 多聚甲醛加至45ml蒸馏水中, 加4ml 10N的NaOH, 加温至65oC. 待粉末完全溶解(通常在30分钟以内)后, 加5ml 10′ PBS, 调节pH值至7.4, 0.2mm滤膜过滤除去未溶颗粒.
注: 4oC可保存2周
4．用氯化铵溶血剂的溶血方法
1) 100ml 全血加2mL氯化铵溶血剂, 混匀
2) 避光孵育10~15分钟
3) 离心, 去上清, PBS洗2次
4) 抗体染色后, PBS洗
5) 1ml 1%多聚甲醛固定, 2oC-直至上机检测
5．血小板活化检测
1. 先固定后染色
1) 将100ml全血加入1ml 1% 冷(2oC-8oC) 多聚甲醛中(100ml全血至少可做20tests)
2) 2oC-8oC固定30分钟. (固定的血小板可保存5天)
3) 抗体染色前, 1200g室温离心5分钟
4) 去上清, PBS洗1次, 1ml PBS重悬
5) 取50ml重悬液, 加适当抗体, 避光孵育15-20分钟
6) 加1ml 1% 冷(2oC-8oC) 多聚甲醛, 2oC-8oC避光30分钟, 但不可超过24小时
2. 先染色后固定
1) 5ml全血加入适当抗体, 避光孵育15-20分钟
2) 加1ml 1% 冷(2oC-8oC) 多聚甲醛, 2oC-8oC避光30分钟, 但不可超过24小时
注: 1) 抗凝剂可选用EDTA或柠檬酸钠, 但不能用肝素, 因肝素对血小板有刺激活化的作用
2) 染色或固定应在采血后10分钟内进行
3) 先固定后染色可降低血小板的自发活化, 避免标本处理过程中的人为活化, 然而有些血小板活化抗原, 如PAC-1, CD62p等在固定剂的作用下会失活,
造成表达率的降低, 因此需要先染色再固定
4) 1987年 Shattil SJ等的经典方法：
¨ 采血时掌心朝上，轻扎或不扎止血带，肘前静脉采血。先弃除最初的2mL血, 然后再采4.5mL血入含0.5mL 3.8%柠檬酸钠的抗凝塑料注射器内
¨ 采血后1分钟内, 将5ml血加入含50mlPBS和适量抗体的标本管中, 孵育15分钟
¨ 500ml PBS稀释, 上机检测
6．PI染液配制
生理盐水 32.4ml
PI 2.5mg
Rnase 0.5mg
Triton-X-100 0.25ml
枸橼酸钠 50mg
加蒸馏水至 50ml
4oC避光保存数月
染色方法: 106细胞中加入1ml PI染液, 避光染色至少30 min, 上机检测。
7．TO染液配比方法
甲醇 1ml
TO 1mg (储存液)
储存液至工作液
储存液用PBS 1：1000稀释
染色方法：5ul全血+50ul TO工作液染色20分钟 PBS复容至1 ml上机检测
阴性对照5ul全血+1mlPBS
8. 破膜细胞的GFP和DNA含量检测
试剂：1×PBS
2%多聚甲醛
70%冰乙醇
PI储存液（1mg/ml in PBS）
RNA酶A
12×75流式管
涡旋振荡器
37°C水浴箱
方法：
用多聚甲醛固定细胞
1. 计数细胞
2. 放10^6细胞到12×75管中，2-8°C以300g 5分钟用PBS离心洗涤一次
3. 弃上清，加入500ulPBS，轻轻混匀。加入500ul冷2%多聚甲醛，混匀。2-8°C一小时。
用乙醇破膜
4. 同上离心洗涤一次。边振荡边加入70%冰冷乙醇。2-8°C过夜。
离心，去上清，加入1ml含有40ug/mlPI和100ug/ml的RNA酶A。37°C避光孵育30分钟。过网后上机。 | 
