[转发]辉煌之星全自动酶免分析连体机性能综合评价

辉煌之星全自动酶免分析连体机性能综合评价

陈新瑞 杨一芬 唐亚梅（中南大学湘雅二医院检验科，湖南长沙410011）

摘要： 目的 全面评价辉煌之星全自动酶免分析连体机的综合性能。 方法 用Evan’s Blue和对硝基苯酚对仪器的比色部分进行通道差、精密度、线性等测定；用高浓度的HBsAg和Hb了解八道加样钢针和24针洗板头的互染和抗干扰作用；用称量法测定加样钢针和分配注射器的加样(试剂)误差；同时与手工操作测定HBsAg进行比较。 结果 各项检测指标均在允许范围内，高浓度的HBsAg和Hb无互染和干扰作用，88份标本的手工操作与仪器对比测定，全自动酶免分析系统测定HBsAg阳性率为43.2%(38/88)，手工操作阳性率为42.0%(37/88)，结果无显著性差别（配对χ2检验P>0.05）。 结论 仪器综合性能符合要求，避免了手工操作的误差, 使实验过程中各个步骤标准化、规范化,提高了实验的灵敏度和精确度。 关键词：仪器评价 酶联免疫吸附试验 辉煌之星全自动酶免分析连体机是第三代全自动酶联免疫吸附试验(ELISA)分析系统的代表产品之一，具有处理速度快，多任务，多通道，试剂全开放，多项目批量测定的优势，对提高临床实验室酶免分析准确性和客观性，促进实验室操作标准化，有十分重要的意义。为了解这种仪器的性能，进一步发挥好仪器的功能，我们参照有关文献，对辉煌之星全自动酶免分析连体机的综合性能进行了评价，现报告如下。 1. 材料和方法 1.1 材料 1.1.1. 辉煌之星全自动酶免分析连体机由STAR第五代随机样本处理工作站和FAME24/30全自动酶免分析系统组成，为瑞士HAMILTON公司产品，操作软件为Microlab STAR3.2英文版，FAME2.2英文版和AusLab2.5酶标实验室管理系统。 1.1.2 AA-250型电子天平，Denver Instrument Company产品；CD1700血球分析仪，ABBOTT产品；微量加样器，Finnpipette Digital产品；U型平底酶标微孔板，Nunc产品。 1.1.3 肝炎病毒标志物测定试剂盒，厦门新创公司产品，批号200307619。HBsAg定值血清 0.5μg/ml，1μg/ml，5μg/ml，卫生部临床检验中心产品，批号0301。 1.1.4 Evan’s Blue，B.D.H进口分装。准确配制0.1g/L Evan’s Blue，用蒸馏水对倍稀释成50mg/L、25mg/L、 12.5mg/L和0.39mg/L等系列浓度。 1.1.5 对硝基酚，广州化学试剂厂。精制后，准确配制 1.28mmol／L对硝基苯酚水溶液。 1.1.6 我院就诊的临床患者的血清标本88人份，新鲜分离，冰冻保存。已知HBsAg阳性高浓度（S/CO＞19）样品8份，已知HBsAg阴性（S/CO < 1）样品24份，已知HBsAg阴性经冰冻方法处理造成明显或高度溶血的标本8份。 1.2 评价指标和方法 1.2.1 通道差与孔间差、零漂、.精密度、.线性测定： 按文献[1]的方法，分别用相应的Evan’s Blue 溶液、对硝基苯酚溶液、蒸馏水与Nunc板和新创板微孔进行测定。 1.2.2 互染和干扰测定：将已知HBsAg高浓度阳性血清和阴性血清以及HBsAg阴性的溶血血清和正常血清用Microlab STAR上HBsAg专用加样程序进行操作，并进入FAME中按HBsAg程序测定。 1.2.3 加样和试剂的体积测定：将1ml刻度离心管放置在Microlab STAR的试管载架上，采用HCV加样稀释程序进行操作，将100μl超纯水分别加入到32个刻度离心管内，称量加超纯水前、后刻度离心管重量；在FAME中，新编程序用注射器将超纯水分配到活动微孔板条上，每6个微孔条仅加1孔，体积50μl，称量加超纯水50μl前、后6个微孔条的重量，计算体积[5]。 1.2.4 孵育温度测定：在FAME中新编孵育程序，设定孵育温度设为37℃和40℃，自动孵育时间10min，用精度为0.1℃的水银温度计，测定孵育盒内温度，重复四次。 1.2.5 与手工操作比较：88份血清，测定HBsAg，全部实验操作过程严格按试剂盒说明书进行。分别由手工和Microlab STAR、FAME完成加样、加试剂、孵育、洗板、判读结果等过程，同时作空白、阴、阳性对照和质控品。 1.2.6 各数据的统计学处理采用SPSS统计软件包，11.0版。 2 结果 2.1通道差与孔间差的检测结果：通道差为0.015，孔间差值为±0.0045。 零点飘移：仪器八个通道的零点飘移A值均在0.0027±0.0084内波动。 精密度评价：精密度按NCCLS公式[2]计算，结果见表1。 .线性测定: 在主波长620nm，参考波长450nm处进行平行测定一系列浓度Evan’s Blue溶液，线性回归结果为：r=0.996，回归方程Y=0.03062X + 0.0558，标准估计误差Sy,x=0.0056，最低测定Evan’s Blue溶液浓度为0.39mg/L。 在主波长405nm，参考波长620nm处进行平行测定一系列浓度对硝基酚溶液，线性回归结果为：r=0.999,回归方程Y=71.074X - 1.749，标准估计误差Sy,x=2.551，最低测定对硝基酚溶液浓度为5μmol/L。 表1　三种浓度Evan’s Blue溶液精密度[CV(%)]评价结果 浓度 A均值 批内精密度 日内精密度 日间精密度 总精密度 12.5mg/L 0.405 0.402 1.026 0.651 1.015 25.0mg/L 0.993 0.479 1.023 0.936 1.216 50.0mg/L 1.867 1.047 0.814 0.608 1.378 2.2 互染和干扰测定评价：结果表明高浓度HBsAg阳性血清不造成邻近微孔出现假阳性，说明加样钢针洗涤可靠，见表2、表3。 表2 八道钢针加高浓度HBsAg阳性血清后对邻近微孔阴性血清的影响（S/CO） 孔序 血清 A B C D E F G H 1 HBsAg+ 26.49 27.43 27.23 94.84 19.02 94.84 26.05 25.42 2 HBsAg- 0.07 0.01 -0.04 -0.01 0.00 0.00 0.00 -0.01 3 HBsAg- 0.01 0.02 -0.02 0.01 0.01 0.00 -0.02 -0.01 注：CUTOFF(CO)= 0.105, NC1=0.03, NC2=0.00, PC=11.87 表3 高浓度Hb对溶血孔及对邻近微孔HBsAg阴性血清的影响（S/CO） 孔序 血清 A B C D E F G H 1 含Hb(g/L) HBsAg- 46 14 26 14 32 39 23 55 0.01 0.02 -0.02 0.01 0.01 0.00 -0.02 -0.01 2 HBsAg- 0.00 0.02 -0.02 0.00 0.02 0.00 -0.01 -0.01 3 HBsAg- 0.01 0.02 -0.02 0.01 0.01 0.00 -0.02 -0.01 注：CUTOFF(CO)= 0.105, NC1=0.00，NC2=0.03, PC=11.87。 高浓度Hb对HBsAg阴性血清不造成微孔出现假阳性，说明通过实验设定的洗板程序对干扰物Hb洗涤充分，防止了假阳性形成，结果表明仪器可以有效地消除溶血对测定结果的影响 2.3 加样和试剂的体积测定结果： 1000μl加样钢针对刻度离心管加入超纯水标示值为100μl，实测为100.009±0.735μg (27℃)，相对误差为0.01% ，CV为0.74%。 FAME中试剂分配注射器加入一个微孔的超纯水标示值为50μl，实测为49.47±0.99μg (27℃)，相对误差为-1.06%，CV为2.0%。 2.4 孵育温度测定结果：进板10min, 测量37度孵育盒温度为36.2~36.3℃，测量40度孵育盒温度为39.1~39.4℃，均在实验允许范围内。 2.5 与手工操作比较结果：对88份标本的对比测定，全自动酶免分析系统测定阳性率为43.2%(38/88)，手工操作测定阳性率为42.0%(37/88)，经配对χ2检验P>0.05结果无显著性差别。但全自动酶免分析系统比手工操作所得的实验结果S/CO值普遍高一点（见表4）。 表4 全自动酶免分析系统与手工操作的实验结果比较（S/CO） 方法 HBsAg阳性 HBsAg阴性 N X s N X s 仪器 38 22.66 7.25 50 0.053 0.11 手工 37 20.63 8.69 51 0.043 0.12 注：CUTOFF(CO)=0.105, 仪器PC S/CO = 16.85；手工PC S/CO = 11.74 3．讨论 3.1酶联免疫吸附试验以其相对较高的灵敏度和特异性等特点，广泛应用临床实验室中,由于实验过程采用手工操作，出现人为误差的机率较大，不同的实验室操作人员常会得出不尽相同的检测结果, 随着科学技术的进步，新型的全自动酶免分析系统已经从传统各自独立的加样器、洗板机、温箱、酶标仪，飞速发展成一个分析系统，辉煌之星全自动酶免分析连体机系统有八道加样钢针、机械手传输系统、30个温度可调节孵育盒、24个试剂位、2个24针洗板机和八道比色系统融为一体使ELISA从加样到出结果的实验过程标准化、规范化，避免了手工操作的误差，提高了检测的精确度和特异性,重复性好，同时大大降低了操作人员的劳动强度,提高了工作效率，且能减少操作失误，避免交叉污染，也提高了操作人员的自身安全性，特别适合医院大批量标本的检验。本着对病人负责的态度，在临床实验室中应用前对整个系统进行全面、系统的综合评价是十分必要的。 3.2 采用Evan’s Blue和对硝基酚的一系列浓度溶液和蒸馏水对比色系统的通道差、孔间差、零点飘移、精密度和线性进行了测定，结果满意。精密度按照NCCLS指南文件要求进行，批内精密度和总精密度都符合要求；线性在0~3.0Abs内与100mg/L、50mg/L、…….0.36mg/L的Evan’s Blue和160μmol/L、80μmol/L、…….5μmol/L的对硝基酚系列浓度溶液在相应波长下成正比，相关系数为0.996以上。 3.3 辉煌之星全自动酶免分析连体机中Microlab STAR有三个洗站和三套加样钢针，循环使用，洗站的洗涤水流速度为12ml/s；每套钢针有八个通道，一次加样为八个标本，因此加样速度很快；为了掌握八通道干扰和互染的来源，以及可能预计的结果，我们在Microlab STAR上设计HBsAg专用加样程序，只采用一个洗站和一套钢针进行加样和加酶结合物。这样我们观察STAR钢针加样过程为：取针 → 加高浓度HBsAg阳性血清 → 洗针 → 加HBsAg阴性血清 → 洗针 → 加HBsAg阴性血清 → 洗针。这样有没有交叉污染十分清楚，通过互染实验，我们可知洗站洗涤的钢针是可靠的，没有交叉污染。同样，为了解干扰对ELISA的影响，一般认为溶血是最干扰测定的[4]，因此我们设计了冰冻溶血方法，上清用CD1700血球仪测定Hb浓度，避免了外来HBsAg等干扰因素对其造成影响，而加样仍采用这个HBsAg专用加样程序。 3.4 辉煌之星全自动酶免分析连体机中FAME上洗板系统，是三排24通道48针洗板，20秒可以洗涤一遍96孔板，而且具备有洗板方式（条式、板式、底部）、洗涤液及洗涤量、洗涤强度与特殊洗板处理（流水冲洗、底部扫洗）等等参数的设置，为了保证洗涤效果，我们先进行预试。而洗板要求则按预试中测定HBsAg的定值血清0.5μg/ml ，以其吸光度A值稍微大于0.105，或者说S/CO值在1~2之间得出参数：每微孔洗液总体积为320μl，连续冲洗附加体积300μl，孔底扫洗附加体积300μl，洗4次，静置20秒。Hb之所以干扰，是因为Hb的过氧化酶样活性而手工洗涤不够造成[4]，仪器通过上述的洗涤，干扰物Hb已经充分洗去对HBsAg测定没有影响。 3.5 从仪器状态监视窗口可以观察到， 孵育盒由于微板的进入，原来已经恒温的孵育盒，温度迅速降低1~2℃，再慢慢上升，6min左右才达到恒温状态，温度测定结果也说明了这个问题，因此对于孵育时间短的试验必须选择加温速度快的选项。 3.6 手工操作与全自动酶免分析系统同时对88份标本进行HBsAg检测，全自动酶免分析系统测定阳性率为43.2%(38/88)，手工操作测定阳性率为42.0%(37/88)，经配对X2检验P>0.05结果无显著性差别。但全自动酶免分析系统比手工操作所得的实验结果S/CO值普遍高一点，有1份标本全自动酶免分析系统判为HBsAg阳性，而手工操作则判为HBsAg弱阳性，而1份标本全自动酶免分析系统判为HBsAg弱阳性，而手工操作则判为HBsAg阴性，经复查证实为HBsAg阳性或弱阳性。其测定结果表明，全自动酶免分析系统避免了手工操作的误差, 使实验过程中孵育、洗板、判读等各个步骤更加标准化、规范化,提高了实验的灵敏度和精确度。 我们对辉煌之星全自动酶免分析连体机进行了质量评价，认为符合仪器本身的技术性能要求。 参考文献 1． 成军 孙关忠 郑怀竞等，酶标仪性能评价与鉴定的基本方法及其初步应用 中华医学检验杂志1998； 21（1）；50~51 2． 杨昌国 许叶 张抗 精密度评价和方法比较中NCCLS评价方案的应用 临床检验杂志1999;17(1);47~50 3． 吴太虎 孙英勇 新型生化分析仪器性能确认及评价方法 医疗卫生装备 1999；1；21~23 4． 曹文飞 酶联免疫测定的干扰因素与对策 中国实验临床免疫学杂志 1998;10(3);60 5． 王继贵 主编 临床生化检验（第二版）湖南科学技术出版社出版 1996， 11~17 6． Kierek JaszczukD,Masi A,Grudeski E,Viel D. 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