[转发]ORTHO BioVue柱 凝 集 系 统

ORTHO BioVue柱 凝 集 系 统

------四 川 莱 福 有 限 公 司 邓钢

美国强生（JOHNSON&JOHNSON）公司是全球最大的制药与医疗产品生产企业。其子公司Ortho Diagnostic Systems公司是全世界最大的血液筛查产品公司。由其开发生产的最新血型分析产品—Ortho BioVue^Tm System 是全球性专利产品，自93年投入临床使用以来在全世界各大医疗科研机构及医院输血科得到广泛使用，96年进入中国市场，现已在国内30余家大、中型医院输血科使用，并得到良好评价。

一、方法原理：

Ortho BioVue^Tm系统是根据抗原抗体凝结原理 ，采用柱凝集技术，运用完全不同于传统的玻片法或试管法的方法 ，在一种加有抗血清和微玻璃珠的特制柱中对血标本进行血型鉴定和分析。

微玻璃珠与稀释剂一起预制于微柱中。检测试验中，将试验血清与红细胞是悬液加入微柱上端反应腔内，经37°C 孵育，再置于专用离心机进行梯度离心，在这种离心过程中，速度是渐进的，它将反应红细胞逐步向下挤压，到达微玻璃珠部分时，由于发热的微玻璃珠之间的间隙仅为7-8微米，因而玻璃珠可起到分离过滤的作用。其中，发生凝集反应的红细胞则不能通过此玻璃珠“屏障”，全部集中留在玻璃珠的上端，则视为“阳性反应”；而非凝集的反应红细胞则能够顺利通过玻璃珠间隙到达“V”字形底部，则视为“阴性反应”。（如图示）

可见，运用这种方法所得结果极易观察，更客观。且由于标本定量加样，使得反应结果趋于标准化，结果稳定，可重复性高。

独特之处：利用密度梯度“清洗”红细胞。BioVue专利产品的一大独特之处是，微柱中除了含有BioVue抗血清等试剂外，还含有一种子大分子物质起到密度梯度的作用，此屏障在渐进离心过程中能够阴挡红细胞膜表面的血清蛋白通过，从而起到“清洗”红细胞的作用，而这，在抗人球蛋白试验中是必要的。

根据M.Valbones;M.D,L.Mosconi M.D等人所著的“对一种利用白蛋白密度梯度在抗球蛋白试验中预备红细胞的新方法中的评估”一文中所做的科学研究表明，运用I¹²⁵示踪物标定红细胞的方法证明，对照常规盐水三次清洗红细胞的效果与用BioVue柱中的白蛋白密度梯度去掉的红细胞膜上的血清蛋白的效果，后者效果明显优于前者。（如图示）

因此，用BioVue微柱法做抗人球试验，省略了传统 Coombs法中反复清洗细胞的繁琐过程 ，既节省了时间，又取得了更好的“清洗”效果。使得试验结果更加真实，可靠。

二、产品优点：

1、 分析程序：简单化、标准化；
2、 操作过程：轻松、高效、快速、省去了Coombs法中清洗红细胞的过程 ，生产力提高60%。
3、 分析结果：准确、清楚、稳定、可靠、灵敏度高、可重复性好。
4、 有利于质控。
5、 结果可保存，便于备查。
6、 可同时做大批量标本，也可上机操作，有利于血库数据微机化管理。
7、 解决了冷凝集的干扰问题，排除了缗线状红细胞排列造成的判读困难等诸多玻片法不易解决的问题。
8、 有利于判断交叉配血的溶血反应。

三、BioVue产品类型

仪 器 部 分 Instruments For Blood Banking

1、全自动血型鉴定与交叉配血仪（AutoVue）：

标本加样、红细胞悬液制备、试剂分配、孵育、离心、结果判定、 质控、数据保存、打印报告等全部自动化完成，可真正做到无人职守。

试验项目：ABO/Rh筛查、正反定型、Rh分型 、交叉配血试验；抗体筛选抗体鉴定；直接、间接抗球蛋白试验；酶测定；特定抗原分型；质控试验。

试验速度：样本架可载36个试管及6个急诊标本；试管架2排，共8种，实机可载博唯优卡240个（1440试验），单元分配，可探血凝，自动冲洗，无交叉污染。

2、自动化血型鉴定与交叉配血仪（MITIS）

由试剂/标本处理机、读数仪、孵育器和微机组成。可自动进行酶标板和博唯优血型鉴别条码识别原始试管，自动分配、稀释血浆/血球/试剂，血动孵育，自动读数判定，质控，数据保存，打印报告等。

试验项目：ABO/Rh筛查；正反定型 ；Rh分型 ；交叉配血；抗体筛选；抗体鉴定；酶法试验，特定抗原分型 ，质控试验。

试验速度：实机可载博唯优卡3×16（288试验），四探针分配试剂/标本；速度750孔/小时，博唯优测定速度：125标本/小时。蠕动泵稀释，无消耗品。

3、博唯优系统工作站：

由一台离心机，一台孵育器，一个工作架和两只加样枪组成，微机选配。手工加样，自动孵育，离心，人工判读结果（也可上机判读），微机记录，打印报告等。

试验项目：ABO/Rh正、反定型；Rh分型；抗体、酶法交叉配血，抗体筛查、抗体鉴定
试验速度：手工加样20-30标本/小时。孵育（交叉配血）10分钟/卡，离心5分钟/试验。 即平均每一个病员定血型需要7-8分种；抗人球交叉配血17分种/3个人。

试 剂 卡 部 分 BioVue System Reagents

1、ABO/Rh正反定型卡（卡名ABO-Rh/Reverse 编号：707100）

该卡的作用：用于定性测定人红细胞上的ABO血型和D（Rh₁）抗原。一人一卡。每卡均带质控管。

每张卡有6个柱（管），每个柱中含适用于一个实验用的BioClone^TM单抗血清特异试剂，即：分别含有抗-A血清（单克隆），抗-B血清（单克隆），抗-D血清（抗-Rh₁，单克隆）质控管（除不含抗血清、反定稀释液外，其余成分与其它5个柱相同），及两管反定型稀释液。

为确保具有广泛的特异性，每种试剂都有是由多种鼠源杂交或人/鼠异源杂交细胞组织的抗体混合而成。
血型试剂抗-A和抗-B是IgM抗体，目的是用于识别人红细胞上的A抗原及其亚型和/或B抗原。
血型试剂抗-D是IgM抗体，目的是用于对D阳性红细胞引起直接凝结，同时对一些弱D阳性红细胞也可引起直接凝结。

质控管：是用于作阴性对照，即用柱中的试剂作平行实验进行同时凝结。正常情况下反应红细胞在该管中应顺利通过到达底部。否则，说明该张卡或红细胞本身有问题。

反定稀释液：是一种含牛白蛋白和大分子量增强剂的缓冲液，其设计是用于直接凝结法检测ABO系统预期抗体的存在。

除此外，卡中试剂都有缓冲液，缓冲液中有牛白蛋白，0.1%叠氨钠；含有0.01M的EDTA防腐剂以及大分子量的增强剂。大分子量的物质构成“密度梯度”，起着“清洗”红细胞的作用。

每一个柱的液体下半部分都含有大量的微玻璃珠，这些玻璃珠呈圆珠状，光滑，均匀，玻珠之间的间隙为7-8微米，它对凝结红细胞起着筛漏、阴挡的作用。

实验结果解释：

血型	血型卡中各柱凝结状况						备注
	A	B	D	对照	A1	B
A型 B型 O型 AB型	+ - - +	- + - +	+ + + +	- - - -	- + + -	+ - + -	若抗D是“-”，则说明是Rh阴性需要进一步确认

特别说明：

1、 BioVue卡中的抗A试剂除能准确检测A抗原外，还可检测出许多A抗原的弱反应性的亚型，如：A₃、A_x和A subB的能力，且有研究表明，抗-A与Tn多可凝细胞没有反应性。
BioVue卡中的抗-B试剂与获得性B抗原没有反应性；
BioVue卡中的抗-D试剂可与弱D阳性红细胞发生直接凝结。

2、ABO及Rh分型卡（卡名ABO-Rh，编号707190）
6个柱分别含有：抗-A、抗-B、抗-AB、抗-D、抗-CDE和质控对照试剂。一人一卡。

3、Rh分型卡（卡名：Rh-hr，编号：707200）
6个柱分别含有：抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、和质控对照试剂。一人一卡。该卡用于检测红细胞上可能含有的D抗原和/或C抗原和/或E抗原和/或c抗原和/或e抗原。

4、Rh及K分型卡（卡名：Rh/K编号：707280）
6个柱中均含有：抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、抗-k和质控对照试剂 ，一人一卡。

5、反定型卡：（卡名Reverse，编号：707500）
6个柱中均有3%PEG反定型稀释液。专用于做ABO反定型试验：用已知抗原的反定型的试剂红细胞检测血清中的抗体，反定血型。3人一卡。

交叉配血卡

1、间接库博氏试验，交叉配血卡（卡名：Polyspecific AHG，编号：707300）

6个柱中均含有抗人球蛋白试剂，抗-IgG，抗-C₃d Or抗-C₃b。除此之外都有含有缓冲液，（牛白蛋白，0.01%叠氮钠）防腐剂 ，0.01M的EDTA，以及大分子量的增强剂。3人一卡。

由于BioVue卡中的稀释液中有大分子密度梯度，对红细胞起到效果良好的“清洗”其表面血清蛋白的作用，因而用BioVue AHG卡做库博氏交叉配血试验则免去了繁琐的盐水三次洗涤红细胞的操作步骤，使实验趋于简便化、标准化，实验结果更加准确、安全、客观。但同时也对样本的准备工作要求更高，对实验操作也要求严格，即要求准确、又要求精确。因而确保了输血的安全可靠。

操作方法：

（1）、分别取40ul受血者压积红细胞和献血者压积红细胞加入1ml生理盐水中制成4%的红细胞悬液。
（2）、在卡的背面记录受血者、献血者姓名，撕开两柱上端锡条，标明左侧一柱为“主测”管，右侧一柱为“次测”管。
（3）、主侧管中，加入受血者血清40ul+献血者红细胞悬液10ul；
次侧管中，加入受血者红细胞悬液10ul+献血者血清40ul。
（4）、孵育10分钟。
（5）、离心5分钟。
（6）、判读结果：

A、 阴性反应：

主、次侧管中反应红细胞全部经过微玻璃珠到达柱的“V”字形底部。说明配血相合。

B、 阳性反应：

主侧和/或次侧各管的反应红细胞全部被挡在微玻璃珠的上端；说明红细胞凝结，配血不合，若大部分红细胞被挡在上端，小部分进入微柱中，但未到达“V”形底部，也被视为配血不合；（若大部分红细胞到达“V”字形底部，小部分被挡在微玻璃珠中，多考虑是由于血浆蛋白、纤维蛋白原等因素的影响，可视为配血相合，为慎重起见，可用其它试验方法进一步验证。主测阴性，次测阳性或可凝，可考虑输洗涤RBC等成分血）用BioVue AHG（即有抗-IgG，又有抗-C3d）卡做交叉配血试验，是检测可能存在的不完全抗体导致阳性反应的最有效的方法，自然也是杜绝配血不合“假阴性反应”最完全、最安全的方法。

2、直接库博氏试验或弱D测定卡（卡名：IgG，编号：707400）

6个柱中都有含有单特异的抗-IgG。这是一种单特异试剂，它只能检测IgG而不能和补体致敏的细胞反应。

除此之外柱中含有缓冲剂、防腐败剂及大分子量增加剂。柱中的稀释液中有足够密度的试剂在离心过程中将未结合的血清蛋白从红细胞中分离开来。柱中含有的微玻璃珠能将凝结的红细胞挡住。
用于直接Coombs试验时，6个人一卡。
用于间接Coombs试验时，3个人一卡。操作方法与结果判读解释同1。

3、酶法交叉配血卡：（卡名：Neutral，编号：707680）

6个柱中均含有与经酶处理后的红细胞进行直接测试最优化的溶液，3人一卡。由于木瓜酶或菠萝酶等酶溶液不易保存，因而中性液卡中不含酶试剂，在试验中可采用一步法，分别往加完样的主、侧管中加一滴酶即可。
结果判读解释同1。
酶法配血对检测不完全抗体和Rh抗体，Kidd抗体较为敏感，尤其对后者特别敏感，但对M、N、S、Fy^a和Fy^b抗体不能检出，因而不尽安全，不如抗人球蛋白试验。3人一卡。

4、抗体鉴定卡：（卡名：Neutral 编号：707680）

卡中试剂内容同3

操作方法 ：

a、Coombs抗体筛选（加入法）：
（1）取两张中性液卡，预备Bliss液、已知抗原的试剂红细胞panel A或panelB（11种）和4%自动质控血浆。
（2）标记好标本后，在两张卡的12柱中分别加入一滴BLISS液。
（3）然后在两张卡的12个柱中分别加入已知抗原的试剂红细胞1-11各10ul，在最后一柱中加入4%质控血浆10ul。
（4）然后将待检病人血清40ul分别加入到这12个柱中。
（5）孵育10分钟。
（6）离心5分钟。
（7）判读结果：
根据试剂盘抗体反应表判读，便可筛选出血清中含有的相应的抗体。

5、抗体鉴定酶试验：

操作方法：

（1）取两张中性液卡，预备试剂红细胞panel C（酶处理），4%酶自动质控血浆。
（2）标记好标本后,分别在12个柱中加入10ul已知抗原的试剂红细胞（酶处理过）和自动质控。
（3）再加入40ul病人血清。
（4）孵育10分钟。
（5）离心5分钟。
（6）判读结果。
根据试剂盘抗体反应表判读，使可筛选出血清中含有的相应抗体。

BLISS液
抗原、抗体在低离子强度的条件下发生反应，可缩短检出大多数抗体所需要的温育时间。即红细胞在低离子环境时其表面抗原能更快地结合抗体。Ortho Bliss液即可为抗原抗体结合提供这样一种最理想的反应环境。

试剂成分：含有0.03Mnacl、甘氨酸、葡萄糖、核苷和嘌呤的磷酸盐的低离子缓冲液；并有氯霉素，三甲氧苄氨嘧啶和磺胺作为保存剂。

适用范围：
1、交叉配血试验：直接、间接库博氏抗人球蛋白试验。
2、 抗体筛选：库博氏抗体筛选（加入法）。
3、 弱D型测定试验。
　４、间接库博氏试验（加入法和再悬浮法）。

血型分析试剂 Blood Groupling Reagents

1 ORTHO^TMReagent Red Blood Cells）

• 可靠性—非常可靠

• 专利技术的Ortho细胞悬浮液，延长红细胞寿命

• 抗原稳定期达4周，无溶血发生

• 专利的使用单抗抗体检测HLA-1抗原技术

• 灵敏度—非常灵敏

• 傲拓 汇集筛选细胞(OPSC)

• 埃菲玛真 反定型试剂红细胞

• 筛莱真 抗体筛查红细胞

• 瑞少沃 抗体筛查质控盘A

• 瑞少沃 抗体筛查质控盘B

• 瑞少沃 抗体筛查质控盘C

2、BioClone^TM（博科隆）单抗血型测定试剂（BioClone Monoclonal Antibodies）

博科隆ABO系统

• 反应强，试验结果明确

• 试剂批间稳定，检测可靠

• 极少难定型 ，节约时间与成本

• 单抗产品，减少对操作人员的威胁

博科隆Rh系统

• 完善，完全的单抗试剂系统

• 由IgG单抗组成的试剂，在低蛋白稀释液下反应十分强烈
  由IgM和IgG抗体组成抗D试剂，结果最佳。
  不需要试剂对照及很少重复试验。

特殊试验

• 抗Lea和抗Leb试剂瞬间完成

• 抗JK^a和JK^b仅需要5分钟室温孵育

• 抗人球蛋白试剂

• 由IgG多抗和补体单抗，组成完美特异性

• 单抗技术可控制对补体的灵敏度

• 50余年多抗技术与最新单抗技术造就了极高的重复性

BioVue 产 品 的 质 控 标 准

一、如果不按本试剂盒中指定的方法进行试验，则必须对您准备采用的试验程序标准化，以　确保实验的准确和安全。
二、在操作过程中使用了被污染的材料可能会出现假阳性或假阴性结果。
三、多种药物（包括大剂量抗菌素）的使用或在某种疾病状下，与直接抗人球试验的阳性结果有关。
四、试剂卡柱子中微玻璃珠有破裂（裂纹或有气泡或形成块状时）均可阻碍红细胞的通过，这种柱子不能使用。
五、低离子增强剂（例如: ORTHO BLISS液）能够增强抗原-抗体的反应。但偶尔会遇到一些标本中含有特殊的抗体，如:Anti-Kell，这些抗体在Liss液环境中非最佳反应条件。
六、适当的血清与ORTHO BLISS液的配合比例将能达到最佳的低离子增强效果。如果改变这种比例或容量将影响直接抗人球试验的灵敏度和（或）特异性。
七、被酶过度处理的红细胞将会产生非特异性凝结。
八、必须使用BioVue专用离心机，因为它提供该系统试验所必需的离心参数。必要时对离心机进行适当的校正，以确保结果的准确。
九、下列情况可以造成结果的异常：

血清或血浆中含有较多纤维蛋白或血凝块；
标本红细胞的不完全冲洗；
反应物与试剂在柱中混合(IDAL)；
红细胞粘附在反应室的壁上；
气泡会阻碍未凝集红细胞的通过。

异常的结果可能是在微玻璃球上形成节，要避免这种异常结果可以在试验前将标本离心，除去纤维蛋白或特异成分，至少冲洗一次红细胞，以除去残留的血浆和（或）血小板，以及在试验完成后1小时内判读结果；遇到其他的一此异常结果，应重复试验加以观察。

十、 凝成血块的全血标本必须谨慎使用，避免把血块吸入到反应腔中，从凝块标本抽取的红细胞在三天后试验可能会完全凝固而出现阳性结果。
十一、再悬浮法中，试剂红细胞必须在悬殊浮于BLISS中之前进行冲洗。未清洗的红细胞在悬浮BLISS中时会降低红细胞表面抗原的稳定性。
十二、当被测定的红细胞被抗体严重包被时，测定的结果可能是无效的。（包括Rh抗D检测）
十三、被测定的血清中蛋白含量异常时会出现假阳性结果，细胞凝聚团往往被误认为是阳性凝结。

十四、不准确的加样或加入了过量的试剂均可引起假阳性结果。
十五、当用Coombs反应进行抗原试验时，不能使用高蛋白含量的试剂。
十六、浓度大于5%或小于3%的红细胞悬液可能对测定结果产生干扰。
十七、由于抗原有效期问题，与新鲜的红细胞相比，存放过久的红细胞的抗原反应明显减弱。
十八、血浆或血清中含有颗粒状的物质可能会阻碍红细胞顺利通过微玻璃珠，应首先对这些样品进离心处理分离。
十九、样品红细胞亦不应含有颗粒状物质，此种物质同样会阻碍红细胞顺利通过玻璃珠。
二十、标本严重溶血对结果的判读产生干扰，不应使用。
二一、ORTHO BioVue系统的实验室应培养1-2名操作人员专门负责正确使用该系统和产品的处理，然后进行档案管理培训和平行性研究及现行测定记录。这些工作完成以后，ORTHO BioVue系统的测定记录则可作为科研和临床检验记录。