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李金明
卫生部北京医院，卫生部临床检验中心，100730
所谓的临床分子诊断方法系指以蛋白大分子和核酸分子为检测目的物从而诊断临床疾病的手段，具体方法主要包括酶免疫试验（Enzyme immunoassay, EIA）、放射免疫试验（Radioimmunoassay，RIA）、荧光免疫测定（Fluorescent immunoassay, FIA）和化学发光免疫测定（Chemiluminescent immunoassay，CIA）等免疫测定方法以及聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）和核酸杂交（Nucleic acid hybridization）等基因检测方法。临床分子诊断是临床检验各学科中最具发展潜力的领域，无疑将成为二十一世纪的主导检验技术，随着人类基因组计划的完成和蛋白质组计划的启动，临床分子诊断方法将在更深层次揭示临床疾病的本质，进而指导临床诊断和治疗。
从理论上说，一种生物或生理活性物质，只要能得到其特异的抗体，就可以建立这种物质的免疫测定方法。以前一些难以进行质量测定的微量生物活性物质，如激素、受体、细胞因子以及酶等现已均可使用免疫测定技术来测定。免疫测定是以抗原抗体间的特异结合反应为基础的，其与临床生化的化学反应有着本质的区别，并且由于标记物如同位素、酶、荧光素、微量元素、发光物质等的掺入，免疫测定技术从低灵敏的免疫沉淀和免疫凝集反应进入了高灵敏的放射免疫、酶免疫、荧光免疫和发光免疫测定时代，其主要是用于生物活性物质的微量测定。核酸是生命现象的基础，受体、细胞因子、酶、激素等不过是发挥功能作用的表型。在核苷酸序列上哪怕是单个碱基的变异，都有可能会引起表型的完全改变，并进而影响生命功能的发挥，导致疾病的发生。因此，在基因水平上检测，对临床疾病本质的揭示就要更深一步。
临床上，很多重要的疾病诊断标志物均使用分子诊断方法来检测，如感染性疾病血清学标志物、激素、肿瘤标志物、自身抗体、特种蛋白、细胞因子和治疗药物以及病原体基因、遗传病基因、肿瘤基因、基因突变等，这些标志物的检测质量直接关系到患者的临床诊断和治疗。而在血站，感染性疾病血清学标志物的检测，哪怕是1％的错误，对将要接受输血的特定患者来说，就是100％的灾难。近期，在电视、报纸等新闻媒体中，常可见到一些有关医患纠纷的报道，其中一些就与我们的免疫及PCR检验有关，如输血后丙肝病毒、艾滋病毒感染的发生，性病检测的假阳性等。此外,象肿瘤和遗传病的分子诊断,如不能正确应用相应的检验项目或合理的解释应用检测结果,轻则会导致误诊,降低患者的生活质量,重则会危及一个生命的存在。当今，我国正处在一个与时俱进的变革年代，医疗体制亦不例外，如医疗事故处理条例的出台，首次将患者真正放在了一个被服务的对象位置，而当代医学对一个疾病的诊断正越来越多的依赖于实验室检验这一关键性环节，其为疾病诊断提供了许多最为直接的证据。因此，建立实际有效的临床分子诊断的质量保证措施,将最大程度的减少因实验室诊断所致的误诊的发生，也将使医患纠纷的处理有据可依。
质量保证的原始概念是，为一产品或服务满足特定的质量要求提供充分可信性所必要的有计划的和系统的措施。这个概念用在临床分子诊断中可改为，为临床分子诊断检验报告满足准确及时的质量要求提供充分可信性所必要的有计划的和系统的措施。所谓的有计划的和系统的措施即是对涉及到可能会影响测定结果的每一步骤都要写出标准操作程序（Standard Operation Procedure, SOP）和有效的室内质量控制方法。那么影响测定结果的步骤又有哪些呢？我们知道当一个病人到医院看病，在临床医生确定检测项目以后，病人进行适当的准备，再进行标本的采集，采集好的标本运送到实验室，由实验室接收及编号，并按要求进行适当的预处理，预处理后，就进入测定程序。如不即时测定，则标本必须有适当的保存。测定后，要判断测定的有效性。有效，则发出报告，并对结果有合理的解释。上述任一步骤的不当，均会影响测定结果及其病人临床诊断和治疗，均为质量保证应涵括的范畴。
谈到质量控制，我们都知道有室内质量控制(Internal quality control, IQC)和室间质量评价(External quality assessment,EQA)。这是质量保证的两个很重要的方面。IQC的核心含义就是在实验室内由本室工作人员所采取的质量控制措施，它决定了即时的测定结果是否有效及报告能否发出。而EQA却是对实验室测定结果的回顾性评价。IQC主要是为了监测实验室测定日间重复性（即精密度）和发现测定方法在某一天出现的重大误差。而EQA主要是测定一实验室的结果与其它实验室结果之间存在的差异（偏差），建立实验室间测定的可比性，其评价的是实验室测定的准确度。可见这二者在临床实验室的质量控制中是相辅相成，互为补充的。
IQC以前强调的是统计学质控。现在IQC的含义已有扩展，主要包括三个方面：（1）测定前的质量控制；（2）统计学质量控制和（3）质量控制的评价。测定前的质量控制包括仪器设备的维护校准、试剂及消耗品的质检、切合实际的实验SOP的制定以及人员的培训等。其跟测定中的统计学质控具有同样的重要性。试想如果实验室的仪器设备处于非良好状态，或所使用的检测试剂及消耗品达不到质量要求，或实验人员业务知识及操作水平低下，测定质量又从何谈起。同样，对室内质控情况定期进行总结评价，找出存在的问题并加以改进，是提高质控水平的必不可少的一步。统计学质控是监测实验过程中可能存在问题的行之有效的方法，目前常用来自于Shewhart工业质控图的Levey-Jennings质控图和Westgard质控规则。临床分子诊断通常有定性和定量测定两类，定量测定一般沿用通常的临床化学室内质控作法即可，而定性测定的结果是“有”和“无”，即“阳性”和“阴性”之分，并且室内质控样本为能灵敏地反映测定变化的弱阳性质控物，因此，完全套用上述定量测定质控规则就不太合适。有研究表明，使用弱阳性质控物进行定性测定的室内质控在作图时，可以S/CO值表示测定结果，而使用稍强一点阳性质控物则以吸光度或S/CO值表示均可。必须强调的一点是，弱阳性样本必须测定为阳性，因为定性测定有一定的测定下限是对其最基本的要求。在临床实际工作中，常遇到的问题是，使用不同批号的试剂测定相同的弱阳性室内质控物，所得到的S/CO值有较大的差异，因此每换一个批号的试剂，质控图就不得不重新开始绘制，使得质控难以持续进行。这样，就需要对目前的质控做法进行改进，使得质控图能不受试剂更换的影响而持续进行下去。当然，以Grubbs异常统计值取舍为基础的“即刻”质控方法也是可以循用的，尤其是在前二十次的测定中，显得较为实用，但要注意其应用的局限性。总而言之，定性分子诊断的室内质控方法仍是一个值得深入研究的课题。
与临床生化测定相比，临床分子诊断的室内质控在各级临床实验室并不太受重视，一方面可能是我们检验人员对迅猛发展的临床分子诊断这一块质控的意识淡薄；其次可能是由于室内质控品来源有限；再有就是对这一块的室内质控不知从何做起。因此，室内质控的缺乏使得在定性分子诊断，实验室间常有结果不一致的情况出现，尤其是弱阳性标本。而在定量测定，则有不同实验室间结果离散度大的问题。要从根本上解决所存在的这些问题，实验室除了要对上述测定分析前的质量控制问题关注外，最重要的是要使用可靠一致的质控品或校准品进行统计学室内质控，这是解决各实验室结果可比性差同时也是保证检验质量的最为有效的途径。此外，有些临床实验室每次检测时，也都同时检测一份室内质控品，但对质控结果既无分析，也不知如何判断是否失控，或者是失控了，检验结果照样报告，这样的室内质控就完全失去了意义。
EQA的英文直译是外部质量评价，固名思义就是由外来的机构或部门对实验室测定质量的评价。EQA在美国叫做实验室能力验证（Proficiency testing,PT）。其与我们通常所说的EQA有什么不一样？实验技术人员有时会觉得很迷惑。室间质评数据既可用作为对测定不合格实验室教育的目的，也可作为对其采取法律、经济或业务上进行处罚的依据。我们国家的临床免疫检验EQA方法来源于英国的国家室间质量评价计划（National External Quality Assessment Schemes, NEQAs）,质评的目的也与NEQAs一样，主要是让参加者通过对自己实验室与其它实验室的测定结果的比较及组织者的解释而起到自我教育的作用。而美国PT的结果则是作为实验室执业许可或实验室认证的依据。正是因为所用目的不一样，EQA所采用的对参评实验室的评价方法是一种相对比较的方法，如标准差指数（Standard Deviation Index,SDI），而PT则采用绝对的评价方法，即参评实验室测定结果与预期结果符合的样本的多少，80％以上符合为合格，否则为不合格。EQA与PT在形式上，没有根本性区别。但在质评目的上则完全不同，并导致评价方法的不一样。有文献干脆直说，当EQA结果被用作为实验室执业许可或实验室认证的依据时，就可以将这种EQA称作PT。可以预见，我们国家的临床实验室在不久的将来，也将逐步进入规范化和法制化的管理，临床实验室的认证是进行这种管理的必由之路，参加室间质量评价的结果当然就会成为实验室认证的重要依据。全国正在进行的临床基因扩增检验实验室的技术验收，就将参加室间质量评价作为了一个必要条件。
在某些情况下，EQA对参评实验室测定水平的反映存在有局限性：（1）参评实验室没有同等的对待EQA样本和患者样本。如多次重复检测质评样本；实验室间相互比对结果等。（2）当使用单一靶值时，难于评价单个实验室和测定方法。（3）在不同的EQA程序中，对实验室的评价可能不同。
综上所述，要做好质量保证，最重要的是必须要了解影响测定质量的实验室过程的所有步骤，测定过程中最薄弱的环节将反映整个的测定质量。在临床分子诊断中，临床标本的收集，是很容易出现问题并最终影响测定质量的环节，在以前，实验室很少注意这一点，而倾向于关注在实验室内的测定过程。但既使是实验室内的测定，IQC的概念也已覆盖了测定分析前和分析后评价等各个与质量有关的方面。采用统计学方法进行过程质控，是IQC的中心环节，伴随着每一次常规检测的始终，决定了当批测定的有效性，实验室应根据自身的特点选用适当统计质控方法。EQA作为IQC的补充，在临床分子诊断的质量保证中是一个不可或缺的部分，但分子诊断有很多缺乏参考方法，难于校准以及检测技术多种多样，不同方法和/或试剂间的偏差仍然是不同实验室测定结果间缺乏一致的直接原因，因此，EQA的实施，将有力的促进临床分子诊断的标准化。 | 
