血细胞参数检测的参考方法及其应用 [转帖]

中国医疗2003第4期 　　　□文/彭黎明　成都华西医科大学附属第一医院检验科主任　本刊编委　 　　 　　全血细胞计数是血液学常规检查项目，对血液系统及其相关疾病的诊断和治疗十分重要。由于血细胞分析仪的计数结果重现性好、准确，操作简便、快速，已成为当今临床实验室全血细胞计数的主要检测手段。但目前的自动化血细胞分析仪被认为是非直接计数的仪器，在使用时须对其进行校准，才能保证其分析结果的准确性，而校准血细胞分析仪所测参数需用相应的参考方法。 　　按照国际血液学标准化委员会(ICSH)的定义，参考方法是“已被清楚而确切地描述、用于某一特定检测的方法，它可以按照指定权威机构的判定，提供准确度和精密度足够高的试验数据，以对该检测的其他实验室方法进行评估。参考方法应遵循基本的计量学标准，其准确度必须通过与现有的一种确定方法相比较而确定，并且必须明确指出其不精确度和不准确度”。除用于评价常规方法和校正仪器外，参考方法也可用于质控品定值及鉴定商品试剂盒等。与常规方法相比，参考方法的干扰因素少，系统误差小，相对于常规方法可忽略不计，因其技术要求较高且费用较昂贵，在常规临床实验室应用不多，但对保证常规方法结果的可靠性非常重要。目前，ICSH和美国临床检验标准化委员会(NCCLS)已经建立了红细胞和白细胞计数、血红蛋白测定、红细胞压积测定、网织红细胞计数、血小板计数及白细胞分类计数的参考方法。现对这些参考方法及其应用予以简述。 　　1.红细胞（RBC）和白细胞（WBC）计数 　　红细胞和白细胞计数传统的参考方法是直接计数法，即在计数池内对稀释血液进行的红细胞和白细胞直接计数。由于血液稀释的准确性和充池的一致性不易掌握，结果会产生较大的误差，且当细胞浓度过低时难以得到准确的结果。该法在一般临床实验室中计数红细胞的不精密度（CV）可达5%~10%，而在生理条件下计数白细胞的CV值为6％－9％，已不适于作为参考方法。ICSH推荐使用电阻抗法半自动单通道细胞计数仪计数代替传统的直接计数法，并在1994年对此进行了修订，将其确定为参考方法。 　　现行红细胞和白细胞计数的参考方法，是将血液稀释一定倍数后用ICSH推荐的计数仪计数一定体积内的细胞数，并换算成每升血液内的细胞数。计数白细胞时，用白细胞稀释液溶解红细胞。标本是用EDTAK2抗凝的静脉血，EDTAK2的最终浓度为1.5－2.2mg/ml。测定时不能用溶血或有微凝块的标本。同时，盛血容器体积要合适，以有足够的空间混匀血液。测定前将容器轻轻倒转几次混匀血液，但不能用旋涡混匀器。计数仪通道直径80－100μm，通道长度为直径的70%－100%，仪器信噪比大于100:1。 　　稀释标本时应使用符合国家标准的容量瓶，计数白细胞时要用稀释液将红细胞完全溶解。除标本采集，标本运输及标本稀释可使结果产生误差外，测量时的误差来源主要包括吸入血液的体积不准、通道内细胞再循环、细胞粘附、假信号以及重合计数等。重合计数为主要的误差来源，目前多通过回归分析方法进行校正，假信号则通过设置阈值进行消除。 　　ICSH所制定的参考方法计数红细胞和白细胞的最大允许偏差分别为2.0%和4.0%，计数不精确度小于1%。 　　2．血红蛋白（Hb）测定 　　血红蛋白测定的方法很多，包括比色法、比重法、血铁法、血氧法等，其中以比色法为主。1966年ICSH就已推荐氰化高铁血红蛋白（HiCN）法为血红蛋白测定的首选方法，既作为参考方法，也可常规使用。该法精确度和准确度都很高，最大允许误差为1%，其他方法如十二烷基硫酸钠测定法、叠氮高铁血红蛋白法等都必须通过HiCN法校正其结果。以后ICSH又多次重申了该法]。 HiCN法是用HiCN转化液与血红蛋白反应，除硫化血红蛋白（SHb）外，其他血红蛋白都被高铁氰化钾转化成高铁血红蛋白（Hi），Hi再与氰离子反应生成HiCN，该物质有特征性吸收光谱，540nm处为最大吸收峰，在标准条件下，其吸光系数一定，用标准化的分光光度计测HiCN液的吸光度再换算成血红蛋白浓度（g/L）。 　　HiCN法必须待溶血和转换反应进行完全后才能进行测定，否则所得结果偏低。同时，测定前还要将HiCN溶液过滤，以除去颗粒杂质，并对所使用的分光光度计以HiCN标准液进行校正，这是测定的关键之一。目前所用的国际HiCN标准液按Holtz制定的方法制备，其浓度为550~850mg/L，保持清洁无菌,性质稳定，其吸收光谱特征符合国际HiCN参考品的要求。 　　3．红细胞比积（PCV）测定 红细胞比积的常规测定方法有离心法、稀释法、电阻抗法等，其中以离心法重现性较好(微量离心法测定红细胞比积的CV值为1%－2%)，但因残留血浆及其它因素的影响，特别是在病理情况下，其结果欠准确。ICSH曾于1980年推荐在Wintrobe管离心法的基础上用放射性核素标记的人白蛋白对残留血浆进行校正，并以此作为参考方法。该法是红细胞比积测定最准确的方法，但因其实验要求的特殊性，非普通实验室所能开展。 　　目前，ICSH制定了新的红细胞比积测定的参考方法[8]，即通过测定全血血红蛋白浓度与平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)，间接得到红细胞比积(Hb/MCHC法)。该方法的基本测定步骤是先将EDTAK或EDTAK抗凝的静脉血用硅酸硼制成的红细胞比积测定参考毛细管在一定条件下离心，离心后去血浆和上层压积红细胞，吸取压积红细胞的中央部分。因为残留血浆和白细胞多存在于压积红细胞的上层，且中央层的较下层的红细胞形态损伤小，中央层的压积红细胞血红蛋白浓度可视为MCHC。吸取的压积红细胞和全血都按ICSH所制定的参考方法测定血红蛋白浓度。因为MCHC=Hb/PCV，故PCV=Hb/MCHC，即得到红细胞比积。测定过程中吸取全血和压积红细胞应使用同一支标准化吸管，以避免吸管间差异所引起的误差，且对每一标本应同时作双份测定。Hb/MCHC法测定红细胞比积的CV值小于0.5%。 　　新的红细胞比积测定参考方法降低了实验要求，大多数血液实验室都能开展。但对于一般实验室红细胞比积测定结果的校正，用经过校正的毛细管(二级参考)作微量离心法即可。该参考方法主要在生产血细胞分析仪和微量离心管的过程中使用。 　　4．网织红细胞(RET)计数 目前网织红细胞计数的参考方法依然是目视计数法，即将血液标本作活体染色后制成血涂片，在显微镜下对红细胞逐个区分，计算出网织红细胞与红细胞总数的比值。再根据ICSH参考方法所计数的红细胞数，将网织红细胞相对数换算成每升血液中的绝对数。 网织红细胞计数所用染色液多为新亚甲蓝，染色液配置好后需过滤。并置棕色瓶中2－6℃一个月，用前过滤。为保证计数结果准确性，最好由两名技术员在同一个电视屏幕或双头显微镜下同时计数，对每一个标本计数三张血片。每次计数的红细胞数(n)、网织红细胞相对红细胞比值(p)及结果变异系数(CV)理论上有如下关系：n= (1－p)/p×(100/CV)2。由此可知，每次计数的红细胞越多，结果的变异系数就越小[10]。另外，在计数时，血涂片制作好坏对计数结果影响较大，薄血片至少长2.5cm，片尾长1cm，边缘平整，使用油镜前先用低倍镜寻找细胞分布均匀的区域，若发现有疟原虫，亨氏小体等干扰因素，该血片则不用于参考计数。 　　5．血小板(PLT)计数 血小板计数的干扰因素较多。细胞碎片、颗粒杂质、血小板聚集等都可对计数产生较大干扰。血小板计数传统的参考方法是目视计数法，即将血液用草酸铵溶液稀释后，充入牛鲍计数板，在相差显微镜下计数血小板。这种方法的重现性差，变异系数（CV）可达 10%－25%，已不适于继续作为参考方法，单通道粒子计数仪由于重合计数和干扰信号的影响较大，常使结果偏高（特别是在低血小板时），也不适于作为参考方法。 　　近年来，对血小板计数方法的研究较多，建立准确度及精密度更高的血小板计数的参考方法，不仅可进一步发展血细胞计数仪，还可减少临床上预防性输注血小板的应用。不少学者认为，如果血小板计数结果可靠，进行血小板输注的阈值可由目前的20×109/L降至5×109/L，这可大大减少血小板输注的费用。 　　Dickerrhoff等研究了以乳胶颗粒作为校准物计数血小板的方法，即用单克隆抗体标记血小板，在一定量血液中加入一定量荧光素（FITC）标记的乳胶颗粒，用流式细胞仪计数血小板对乳胶颗粒的比值，再以该比值乘以已知的乳胶颗粒的浓度即为血小板浓度。该法准确度和精确度较高，CV值为5.3%－5.6%，但在吸取和稀释标本、加入乳胶颗粒时，需要准确吸样，否则会带来操作误差。 现行的血小板计数的参考方法是ICSH制定的PLT/RBC比值法，即以红细胞代替乳胶颗粒作为校准物，计数PLT/RBC值，通过ICSH参考方法计数红细胞浓度，再以PLT/RBC比值乘以红细胞浓度即为血小板浓度。PLT/RBC比值法相对较易进行，其主要优点在于，对一个混匀的血标本，吸样和稀释标本不会使结果产生误差。一般认为，标本作1:1000稀释，流式细胞仪测定3000个信号/秒时，为血小板计数的最佳条件，并可不进行重合计数的校正。 目前标记血小板所用的单克隆抗体包括抗CD41a(GPⅡb/Ⅲa) 、抗CD41(GPⅡb)、抗CD42a(GPⅠb/Ⅸ)、抗CD42b(GPⅠb)、抗CD61(GPⅢa)等，由于GPⅠb/Ⅸ在血小板激活时会转入血小板开放管道系统，而导致其在血小板膜上的分布减少，这限制了CD42a和CD42b的应用。而GPⅡb/Ⅲa性质较稳定，很少发生再分布，其两个抗原决定簇也很少同时被封闭，故目前一般同时使用抗CD41和抗CD61对血小板进行标记。在标记的血小板中，较大的血小板团可根据前向和侧向光散射特征加以区分。 计数血小板所用容器应当用聚丙烯或聚苯乙烯材料，以避免血小板粘附，所用流式细胞仪要能同时进行光散射和荧光测量。之所以要通过PLT/RBC比值计数血小板，是因为目前流式细胞仪还只能对细胞进行相对计数，而不能进行绝对计数。 PLT/RBC比值法在较宽范围内显示出了计数的有效性，研究显示血小板计数为280×109/L和40×109/L时，方法的CV值分别为1.7%和3.0%。但潜在的干扰因素仍然较多。 6．白细胞分类(DC)计数 随着高新技术的不断出现，白细胞分类计数已由电阻抗法的三分类发展为同时使用多项技术联合检测白细胞，综合分析各项数据，可得出较准确的分类结果。这些技术包括体积分析、激光分析、高频传导分析、光散射分析和细胞化学等，但目前所用的普通血细胞分析仪仍不能对某些细胞进行准确识别，如白血病细胞、单核细胞、异常不典型淋巴细胞等。各类五分类血细胞分析仪的质量保证有赖于参考方法的建立。目前，白细胞分类计数的参考方法仍然是手工分类法，即将血涂片进行瑞氏染色后，在显微镜下对各种白细胞进行分类。手工分类法的不足之处在于：(1)技术人员进行细胞分类时，存在主观因素的影响；(2)由于单核细胞、嗜碱性粒细胞数量较少，分类时不能保证其结果准确度和精密度；(3)血片细胞分布不均。 Hiibl等研究了使用流式细胞术进行白细胞五分类法，这种方法使用了三种荧光染料标记的单克隆抗体对不同白细胞进行染色：FITC标记的抗CD45,PE/CYS标记的抗CD14，PE标记的抗CD2、抗CD16、抗HLA-DR单克隆抗体混合物。根据各种白细胞表面抗原分布的不同对白细胞进行分类（表1见书42页）。 　　染色前先用细胞稀释液破坏红细胞，白细胞因表达CD45而与细胞碎片区分开。嗜酸性和嗜碱性粒细胞不能被PE标记的单克隆抗体混合物染色或染色较浅，且CD14阴性，而与其他细胞相区分，被框入LSS(侧向光散射)/CD45直方图内。在LSS/CD45直方图内嗜酸性和嗜碱性粒细胞因表达CD45的强度不同及侧向光散射特征存在差异而被分开。单核细胞表达CD14，同时结合其侧向光散射特征而被框入LSS/CD14区。单核细胞以外的细胞根据侧向和前向光散射（FS）特征差异而在LSS/FS直方图中分为两群，一群包括淋巴细胞和嗜碱性粒细胞，另一群包括中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。从淋巴细胞、嗜碱性粒细胞中减去嗜碱性粒细胞即为淋巴细胞，从总数（100％）中减去嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞相对数，即得中性粒细胞相对数。 　　根据CD14区分单核细胞时，有少量CD14阴性单核细胞可被漏检，而在区分嗜酸性粒细胞时，排除中性粒细胞是根据中性粒细胞表达CD16，若存在大量CD16弱表达的成熟中性粒细胞，则这部分中性粒细胞会干扰嗜酸性粒细胞计数，使嗜酸性粒细胞结果偏高，这种情况主要见于炎症反应。研究还发现，选择不同的标本处理方法和流式细胞仪，虽然所得结果相关性较好，但不同细胞亚群计数结果间的差异具有明显的统计学意义，这体现了方法学选择的重要性。流式细胞仪白细胞五分类法综合运用多种细胞表面标志和光散射特征对白细胞进行识别，具有较高的特异性，其计数结果与手工分类法相关性较好，而且重现性远远优于手工分类法，有望成为白细胞分类计数的参考方法。 　　综上所述，由于高新技术的发展和应用，全血细胞计数及其相关指标检测的参考方法也在逐步发展。血红蛋白及红细胞比积测定的参考方法相对较易建立，而全血细胞计数由于影响因素较多，难以建立合适的参考方法。以往手工操作的方法，由于主观因素影响和实际所能达到精度的限制，已越来越不适应于现有的要求，半自动或全自动分析方法可能逐步取代手工操作成为参考方法。流式细胞术及细胞标记技术的发展及应用，极大地促进了细胞计数和分类的发展，将是今后主要的发展方向之一。