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摘要： 本文介绍一种新型化学发光分析技术，隶属均相免疫分析，其特点是采用“双标记”和“双球”为特征，以抗原-抗体结合为基础，为发光微球和感光微球之间的活性氧传递创造条件，实现全程无需分离洗涤的免疫分析过程。本文介绍光激化学发光和均相免疫分析原理，光激化学发光分析的主要类型和技术优势等内容。 关键词：光激化学发光分析；感光微球；发光微球；均相免疫分析；激光诱导 引言
光激化学发光分析（light initiated chemiluminescent assay，LICA）为一种新型化学发光分析方法，已逐渐被临床实验室接受并得到一定程度的应用。此项技术与电化学发光、直接化学发光、酶促化学发光不同，采用发光物质（luminescent material）和感光物质（photoactive substance）两种标记，发光物质分布于发光微球表面，感光物质分布于感光微球表面，体现出“双标”和“双球”特征。两种微球之间借助抗原-抗体间结合，实现高能活性氧的传递，诱导光激发化学发光过程，从而实现“免分离”的均相免疫分析，精密度高，检测速度快。同时，在操作模式方面，分析仪器采用微孔八联条，自由选择标本优先或项目优先模式，在考虑常规标本最大检测速度的同时，可实现急诊标本优先测定。基于LICA检测平台，已研发感染免疫血清标志物（含ToRCH）、血清肿瘤标志物、甲状腺功能相关激素、性腺相关激素等数十种常规检测项目。因其操作简便、分析效率高、仪器低故障等优秀性能，此种分析方法深受临床实验室的欢迎。 一 光激化学发光原理 与其它发光免疫分析类似，光激化学发光免疫分析同样包括光激发化学发光过程和免疫分析过程，前者赋予此系统高敏感性，后者保证此系统高特异性。但不同的是LICA免疫分析借助“双球”和“双标”，无需分离未参加免疫反应的标记微球，避免复杂的洗涤过程，完美实现均相免疫分析（homogeneous immunoassay）。 1.1 化学发光过程 光激化学发光的发光过程是一种由激光激发的化学发光过程。由酞氰、二甲基噻吩衍生物和镧系元素铕（Eu）组成。酞氰作为感光物质分布于感光微球（GG），酞氰接受激光照射（680 nm）发生化学反应释放能量，促使周围氧分子活化变成“活性单线氧”。GG微球表面的活性氧携带能量向周围扩散，但因其半衰期短（4 ms），只能迁移 200 nm的距离。二甲基噻吩衍生物和铕（Eu）分布于发光微球（FG）；二甲基噻吩衍生物可以接受活性氧的能量，诱导其发生连续化学反应产生紫外光（370-390 nm）。紫外光可以作为荧光物质铕（Eu）的激发光，Eu发生能级跃迁至激发态，激发态不稳定回到基态并以荧光形式释放能量（612 nm）。此外，电化学发光过程于阳极表面诱导进行，而光激发化学发光过程是由激光激发的，同样具有可控性和较好的测量效率。从本质讲，上述最终光信号是荧光物质铕（Eu）释放的荧光信号，但与常规荧光信号产生不同，在光激化学发光过程中，铕（Eu）产生的荧光信号不是外源光而是内源光。 1.2 均相免疫分析 光激化学发光分析为一种新型的均相免疫分析系统，全程无需分离游离标记微球或未参加抗原抗体结合的标记物质。在光激化学发光分析中，发光物质和感光物质均分布于粒径约200 nm的微球表面，并不结合生物分子（抗原或抗体），且其分布和微球使用浓度相关。同时，发光微球或感光微球均为胶乳基质，比重轻（1 g/cm3），且粒径远小于普通化学发光微球（1000 nm）的粒径，微球密度接近水溶液，于水溶液中呈悬浮状态。基于上述特性，通过控制两种微球的工作浓度，使得感光微球和发光微球之间的距离大于活性氧最远扩散距离，即使在激光激发情况下，发光微球不能接受活性氧的能量，不能启动化学发光反应即不产生光信号。但是，由于微球表面包被生物分子（抗原或抗体），抗原-抗体结合导致感光微球和发光微球靠近（小于200 nm），在激光激发情况下，发光微球能够接受周围感光微球释放的活性氧，从而启动发光微球表面的化学发光反应过程并产生光信号（610 nm）。LICA均相发光原理如图1所示。  图1 LICA均相发光原理示意图
图中显示，如将感光物质和发光物质两种物质混匀，光激发会产生光信号。但是，如将上述两种物质分别涂布于感光微球（GG）和发光微球（FG），两种微球于液相中分散，当光激发时不满足能量传递条件，无光信号产生；但是如果微球之间存在抗原-抗体结合（以双抗体夹心为例），之间距离小于200 nm，满足能量转移要求，用激光激发时，发光微球便产生光信号。 1.3 分析过程 整个LICA检测过程分为两个阶段：抗原-抗体结合和化学发光过程。以双抗体夹心检测抗原为例说明：首先，一对特异性抗体分别包被发光微球（FG-Ab）和标记生物素（Bio-Ab），分别为R1和R2；感光微球溶液（通用溶液）包被链霉亲和素（GG-SA）。GG-SA方式与罗氏电化学发光类似，便于工业化。其次，于微孔内分别加入R1+R2，以及待检样本或校准品，启动第一阶段温浴后，于发光微球表面形成双抗体夹心复合物（FG-Ab-Ag-Ab-Bio）；无需洗涤再加入通用溶液（GG-SA），启动第二阶段温浴，FG微球通过表面生物素结合GG微球表面的链霉亲和素，两种微球相互靠近；此时，用激光束激发，诱导上述化学发光过程产生光信号。信号强度与抗原-抗体结合强度相关，通过校准品获得数学函数模型，未知标本浓度通过数学函数获得。双抗体夹心检测抗原原理如图2所示。  图2 基于LICA平台的双抗体夹心检测抗原原理示意图
二 光激化学发光分析的方法学 标记免疫分析基于抗原-抗体结合，主要应用于抗原和抗体检测，具体讲应用于感染免疫血清学诊断（抗原和抗体），血清肿瘤标志物的定量分析，体内激素水平的定量分析，以及自身抗体的定性或定量分析，也包括心肌损伤血清标志物的快速分析。本部分主要介绍上述物质分析方法学问题。 2.1 抗体检测方法 本文主要介绍感染免疫血清学诊断标志物，分别以HCV-Ab和CMV-IgM为例，介绍双抗原夹心检测HCV抗体（IgM+IgG），间接法检测CMV-IgM抗体。 （1）双抗原夹心法检测抗体 丙型肝炎病毒（HCV）感染，诱导人体产生特异性抗体，早期产生HCV-IgM，随后产生HCV-IgG。因此，HCV-Ab作为丙肝感染的重要证据具有诊断价值。基于LICA平台的HCV-Ab检测原理如图3所示，采用双抗原夹心模式，含两种试剂分别为：FG-HCV-Ag（R1），Bio-HCV-Ag（R2）。在HCV-Ab存在的情况下，形成双抗原夹心复合物。此时，加入通用溶液（GG-SA），亲和素与生物素结合，感光微球和发光微球靠近，激光诱导化学发光反应产生光信号。双抗原夹心法具备双重特异性，标本无需稀释，敏感度高，且同时检测IgG和IgM两类抗体。  图3 基于LICA平台的双抗原夹心检测抗体原理示意图
（2）间接法检测IgM类抗体 孕妇感染巨细胞病毒会启动体液免疫应答，早期产生CMV-IgM抗体，故CMV-IgM可作为孕妇CMV感染的血清学指标。基于LICA平台采用间接模式检测CMV-IgM抗体，检测原理如图4所示。采用CMV-Ag包被发光微球（FG-CMV-Ag，R1），生物素标记抗人IgM抗体（Bio-Anti-hIgM抗体，R2），结合通用溶液（GG-SA）使用。标本需充分稀释（400 X），如标本中存在CMV-IgM抗体，FG微球表面形成已知抗原-待检抗体-抗人IgM抗体复合物。此时，加入通用溶液（GG-SA），亲和素与生物素结合，感光微球和发光微球靠近，激光诱导化学发光反应产生光信号。由于检测过程没有分离洗涤，不同于一般间接法，标本中非特异性IgM会产生干扰，中和R2中的Bio-Anti-hIgM抗体。本方法充分利用LICA高敏感度的优势，将血清标本稀释400倍，同时提高Bio-Anti-hIgM抗体用量，获得满意效果。  图4 基于LICA平台间接法检测IgM抗体原理示意图
需要说明，因血清中IgG含量约占免疫球蛋白总量的80%，虽然使用阻断剂，仍无法消除血清非特异性IgG抗体的干扰。因此，基于LICA平台并采用间接法检测IgG类的抗体尚有许多问题需要克服。 2.2 抗原检测方法 此处“抗原”指大分子蛋白质抗原，往往具有多种抗原表位，适合采用双抗体夹心模式检测。关于双抗体夹心检测抗原已在上文1.3中叙述，此处不再赘述。 2.3 半抗原检测方法 此处“半抗原”指小分子甾体类激素，此类物质只存在单一抗原表位，不能形成双抗体夹心复合物，只能采用竞争免疫分析模式检测。在竞争性免疫分析中，需满足两个条件：其一，抗体限量原则；其二，在结合抗体能力方面，标记抗原与待检抗原具备相同或相似的能力。本文以睾酮定量分析为例说明。基于LICA平台，选择睾酮包被发光微球（FG-T，R1），生物素标记睾酮抗体（Bio-Ab，R2），结合通用溶液（GG-SA）使用。竞争免疫分析原理如图5所示。标本睾酮，与感光微球表面睾酮分子，竞争限量睾酮抗体（平衡竞争模式），分别形成复合物（FG-T-Ab-Bio，T-Ab-Bio）。加入通用溶液，链霉亲和素结合生物素，但是，只有“FG-T-Ab-Bio-SA-GG”两种微球相互靠近，才能受到激光诱导产生光信号。与其它化学发光的竞争法相同，竞争性-LICA方法同样获得反比例函数。  图5 基于LICA平台竞争法检测半抗原的原理示意图
此外，LICA竞争法也可用生物素标记半抗原（Bio-Hapten），抗体包被发光微球（FG-Ab），同样可以构成竞争性免疫分析。 三 光激化学发光分析技术优势 光激化学发光分析优势表现为均相免分离且具有非常高的敏感性和精密度，分析过程简单快速，仪器元件设计精细且故障率低，深受临床实验室的欢迎。 3.1 均相免分离 均相免疫分析是LICA技术最突出的优势。按照是否需要分离结合标记物（B）和游离标记物（F），免疫分析可分为均相免疫分析和非均相免疫分析。目前，无论是电化学发光，还是酶促化学发光，它们均属于非均相免疫分析。非均相免疫分析需要分离去除未参加反应的游离标记物，测定结合标记物的信号强度。非均相免疫分析采用固相吸附分离模式，即采用磁性微球作为固相材料，让结合状态标记物吸附在微球表面，而游离状态标记物分布于液相中，再通过微球洗涤去除游离标记物。而LICA体系中游离发光微球不能获得活性氧能量，不会产生光信号，因此，无需分离洗涤，可实现均相免疫分析。 3.2 精密度高 研究表明，标记免疫分析随机误差的主要来源是分离洗涤过程。洗板机应用于酶联免疫吸附试验，使洗涤过程标准化，显著提升分析可重复性。磁性微球采用磁场吸引微球，负压抽吸液体溶液实现单次洗涤过程。再加入洗涤缓冲液，混匀磁性微球，静置，再加磁场吸引微球，负压抽吸液体溶液实现第二次洗涤。如此反复多次，才能达到去除游离标记物的目的。此过程不仅复杂耗时，而且磁性微球相互作用成团，不易散开同样影响洗涤效率。相反，由于LICA无洗涤过程，减少了因洗涤带来的误差，赋予LICA显示较好的分析精密度。 3.3 分析灵敏度高 LICA高精密度有助于获得高灵敏度。更重要的是发光信号（cps）的产生是级联反应过程，感光微球表面高浓度感光物质在680nm激发下，每个微球、每秒释放多达60,000个活性氧分子，从而产生非常强的信号放大。同时，发光微球的化学发光过程同样是级联放大的，铕（Eu）的荧光信号具有较长寿命（微秒），通过延时方式可以滤除干扰信号，实现特异性信号的检测。此外，从整体化学发光过程看，激发光波长为680 nm，而发射光波长为 612 nm，属于长波长激发，短波长发射，自然界中无此种诱导发光方式，给予非常低的背景信号（500 cps），对LICA系统灵敏度的提高同样产生积极影响。但是，需要说明的是，LICA系统的高灵敏度，同样需要抗原-抗体的高亲合力，高质量抗原或抗体仍然是诊断试剂高灵敏度的必要条件。 3.4 分析仪器简单 由LICA系统无复杂的分离洗涤过程，且试剂组成及信号检测简单，LICA全自动分析仪设计制造并不复杂。如采用Tip头方式加标本和试剂，无需冲洗，且没有液路系统，不会产生额外废液。如采用钢针加样或试剂方式，只需对加样针进行洗涤，且负压洗涤，洗涤液不会进入管路，不腐蚀管路等。简单仪器设备，简单机械操作，带来极少的仪器故障，保养方便，使临床标本的检测更为顺畅。此外，无洗涤的检测过程，节省时间，带来更高的检测速度，使患者受益，方便于单日复诊。
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