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全自动血液分析仪 SYSMEX XE2100-->yeec转移

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郑振寰 发表于 2002-9-12 09:22 | 显示全部楼层 |阅读模式

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红血球生成功能评价:方法学的进展——全自动血液分析仪 SYSMEX XE2100 G. d'Onofrio  G. Mistretta  G. Giordano  G. Zini 血液学自动分析方法临床评价和发展研究中心(ReCAMH) ---罗马Cattolia del Sacro Cuore大学血液学系 关键词:     红细胞,网织红细胞,有核红细胞,成红血球细胞,血细胞自动计数 摘要     近年来血细胞自动计数技术发展在很大程度上提高了红细胞测定的精确性和准确性。同时,创新的自动检测装置和测量新参数,如未成熟网织红细胞指数(IRF)和有核红细胞数(NRBC),也提高了全血细胞计数的临床诊断价值。目前已有许多文献报道有关此新测量技术在诊断和血液病随访以及在确定诊断标准化和一致性方面的运用。新型血液细胞分析仪XE-2100就是一个将创新技术应用到常规红细胞分析中的范例。血红蛋白浓度应用于红细胞增生情况的定量评估,同时结合平均红细胞体积(MCV)和红细胞体积分布宽度(RDW)用于贫血分类。带有未成熟网织红细胞指数的流式网织红细胞仪计数在新的领域有了非常出色的应用,诸如监测造血前体细胞移植中前体细胞的增殖;监测因贫血而接受人重组促红细胞生成素治疗后红系增生的情况或体育运动方面滥用人重组促红细胞生成素的监控等。运用XE-2100进行NRBC计数具有如下特点:精确,准确,灵敏度和特异度高。它在实验室检测中的应用将降低涂片复检次数,也将为新生儿学和血液病学提供有价值的诊断信息。 介绍     从1934年Moldavan和1953年Crosland Taylor初步实验后,人红细胞(RBCs)自动分析开始有了很大的发展:表现为脉冲高度分析和平均红细胞体积(MCV)自动检测的Coulter方法。红细胞分析技术的持续发展也促进了持续流式光学系统,多通道血液学分析仪,激光血液学分析仪,以及多参数血液学自动计数的发展。此类新技术不仅提供了更快,更可靠及更准确的检测手段,而且也为RBC在诊断血液病(包括红血球生成)的运用方面引入了新参数。本文意在回顾一些与红细胞生成功能和贫血诊断相关的现代红细胞分析特点,以最新的综合性的分析装置之一,血液细胞分析仪为例。 传统的红细胞定性定量分析---基本用途     所有的现代血细胞计数仪对红细胞计数都是和血小板计数一起在一精密分析通道中完成。除小部分例外,多数自动测量方法与其他仪器一致,XE-2100对红细胞计数采用电阻抗原理。这些检测方法的精确度高,所有RBC参数的变异系数小于0.5%。在颗粒计数上的技术问题,例如非轴性的流动,流动中的形状改变,颗粒回流入计数敏感区,以及由于重叠造成的计数减少等已经被新的方法大大的克服了,例如小鞘液聚焦技术的引入。小型化仪器提供可靠的分布曲线和计数结果。但是,RBC计数不能很好反映贫血或红细胞增多症,比如由于珠蛋白合成障碍性贫血或巨幼红细胞症所至的细胞大小改变。血红蛋白(HGB)浓度是评估血液运输氧气最有效的量化指标并能有效的,虽然是间接的,反映实际红细胞循环数目。传统的HGB浓度测定运用了氰化高铁血红蛋白法(540nm)。随着新技术发展出现了无氰化物血红蛋白分析法例如在Sysmex血液分析仪运用的十二烷基磺酸钠法(SLS)。HGB是最可靠的,准确度高,标准化且统一的血液指标, 因为它是唯一一项有血红蛋白氰化物参考品以及基于HICN-HGB的参考方法的血液学参数。另一方面,红细胞压积(HCT)或压紧的红细胞体积(PCV)则是细胞通过自动血液分析仪敏感装置时产生的电脉冲而获得。最简单情况是通过RBC与MCV乘积计算得来,而Sysmex系统则是通过脉冲大小的累加换算得来。任何情况下,通过电子测定HCT似乎是多余的参数,很容易被忽略。手工测定的HCT由于血浆丢失和细胞皱缩等情况而与自动测定的HCT有明显的差异。与手工测定相比,自动测定(通过脉冲平均值或大小总和及RBC计数)系统性低估了HCT(和MCV),而平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)则被高估,并且灵敏度降低。但是,自动测定明显提高了最有用Wintrobe指标的精确性和准确性,如MCV,并且为临床医生提供诊断红血球大小不等症的新定量指标,如红细胞分布宽度(RDW),根据分布图计算红细胞大小标准误差或变异系数。这些反映RBC特性的定性指标在许多临床方面非常有用。例如,平均红细胞体积(MCV)高范围及RDW增加可早期反映酒精中毒,肝病,B12/叶酸亚缺乏,工业污染(有机溶剂),骨髓细胞发育异常(化疗后),以及AZT和羟基脲治疗依赖性。而平均红细胞体积(MCV)低范围及RBC大小变异系数增加(RDW)则是典型的缺铁指标。不同研究中RDW对缺铁有很高的敏感性,虽然它的特异性较低。另外,在珠蛋白合成障碍性贫血患者中,RDW值正常或仅有轻度增加。 红细胞增生的动态评价:网织红细胞计数----进一步运用     过去二十年网织红细胞自动检测技术的发展从根本上改变了过去其在临床应用方面的限制性,这归根于其准确度和灵敏度的提高甚至是在正常与低水平范围方面。这些进步开拓了其在新医学领域的更广泛应用,加快了综合性仪器和方法学的发展。由此,标准化和一致性成为当今流式细胞仪网织红细胞计数的主要议题。最新的网织红细胞计数进展是新一代多参数血液分析仪应用全自动分析方法的发展结果(图1)。其中一些系统运用RNA荧光染色和激光测定网织红细胞和相关参数;另一些则利用体外活体染色导致网状物质沉积和着色而被光吸收或分散测定。
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 楼主| 郑振寰 发表于 2002-9-12 09:52 | 显示全部楼层
[此贴子已经被作者于2005-3-24 21:50:03编辑过]
 楼主| 郑振寰 发表于 2002-9-12 09:53 | 显示全部楼层
图1. 网织红细胞计数进展:a 新亚甲基蓝染色;b 网织红细胞的Heilmeyer显微镜分类,根据网状结构量;c Sysmex R-1000细胞图,第一台流式网织红细胞计数仪;d XE-2100网织红细胞计数方法细胞图 许多研究证实流式细胞仪网织红细胞计数在线性,精确性,携带污染率,时间稳定性,准确性和可比性方面较显微镜方法有了很大改进。就精确性而言,流式细胞仪方法平均总体变异系数一般低于5-10%,而显微镜方法为20-40%。实际上,流式细胞仪对每份样本计数和分类细胞数在10,000-30,000多个,减小了统计误差。通过分析悬浮液中细胞,可避免由于细胞在血涂片中分布不均所致误差;自动测定标准的客观性和统一性代替了试验者主观性和可变性。但是流式细胞仪网织红细胞计数在不同实验室间的差异仍不令人满意。最近美国病理学家学会开展的网织红细胞检测有效性项目量化了流式细胞仪方法在不同实验室和使用不同方法的差异。这项研究包括了2,000个以上实验室,运用当时能得到的所有方法,并采用来源于人体血液但商品化后稳定的替代物。结果肯定了自动流式细胞仪方法计数网织红细胞比显微镜方法更精确,变异系数(CVs)低于20%, 但也表明了不同流式细胞仪方法之间有明显的偏差。 许多作者报道,以显微镜方法作为参考比较,网织红细胞计数的准确性非常好,相关系数接近1.0。一些研究显示噻唑橙方法高估网织红细胞数,是显微镜参考方法所得的1.5-2倍,特别是白细胞增多症血样;而另一些研究则轻微低估网织红细胞数,特别是值高于10%情况下,可能是因为高含量RNA深染细胞超过检测上限而被排除。不论所用的仪器和染色或荧光染料,就各方法之间的一致性来说,流式细胞系统要好于参考的显微镜方法有更高的一致性,相关系数高于0.9。(图2)。
[此贴子已经被作者于2005-3-24 21:51:36编辑过]
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 楼主| 郑振寰 发表于 2002-9-12 09:55 | 显示全部楼层
图2. 不同新生代血液分析仪网织红细胞计数的一致性: a Cell Dyn 4000与XE-2100 , b PENTRA 120与XE-2100 流式细胞仪测定网织红细胞数的一个最大优点是测定RNA含量的可信性,体外活体染色后通过荧光强度,光吸收或散射测定RNA含量。荧光或染色强度反映了RNA含量。因此,它能够定量和客观估计网织红细胞的成熟程度。网织红细胞荧光或染色定量目前被作为一项有诊断价值的网织红细胞计数的辅助检测项目。 XE-2100方法识别网织红细胞不同亚类型,以荧光或染色强度增加为标准。通过自动或手工方法定位的电子界标彼此区分(图1d)。不同的网织红细胞类型如下:1)低荧光或染色强度型,LFR(低荧光强度比率)或LR,在正常的造血中占网织红细胞的70-80%(对应Heilmcyer's IV型),具有正常造血作用;2)较高荧光或染色强度型,可进一步分为MFR(或OR,中荧光强度比率)或 HFR(或HR,高荧光强度比率),对应Heilmcyer's其他类型和包括应激网织红细胞(至少 HFR情况下)。 为使不同实验室,不同方法间测定结果有更好的一致性,Davis和他的同事提议如下一种方法:在参照正常健康成人网织红细胞划分一个有更高的荧光强度或未成熟网织红细胞的部分,获得一正常参考范围(大约0.2-0.45)以便检测在低范围和高范围内的变化。最近,专家在认为未成熟网织红细胞指数(IRF)的概念(例如最幼稚网织红细胞的定量和作为一个整体的表达)是反映有关红细胞生成活性的最好的流式细胞仪参数概念方面达成了共识。许多最新的自动多项目分析装置能获得IRF。在XE-2100,IRF为MFR和HRF的总和。从诊断角度,流式细胞仪方法的引入明显扩大了临床应用范围。灵敏度的提高和以直接检测RNA含量作为网织红细胞成熟标志,使骨髓红系增生活性功能的真正时间估计(仅有较小偏移)成为可能。过去十年内,医学界越来越多的文献报道认为测定网织红细胞参数在临床血液学和内科领域用途愈来愈广。例如,出血后网织红细胞轻度增加;慢性炎症患者网织红细胞数和血清促红细胞生成素水平较贫血低;β-珠蛋白合成障碍性贫血患者其网织红细胞数中等程度增加,与血红蛋白浓度成负相关。 成功地监测骨髓前体细胞(HPC)移植基于连续的外周血细胞计数。近来许多报道证明系列流式细胞仪网织红细胞计数提供早期和可靠的增殖参数,特别是定量最幼稚和RNA最富集的网织红细胞。HPC移植后2周内IRF开始上升。而儿童HLA不匹配的骨髓移植者网织红细胞数目迅速下降是移植失败的有效早期标志,尽管早期免疫抑制提示有较高的成功可能性。伴慢性肾衰和尿毒症的贫血患者,网织红细胞数目和IRF两者中度降低,与血浆促红细胞生成素升高水平有直接联系。肾移植成功后血浆促红细胞生成素升高水平与IRF升高有显著联系,几天后网织红细胞数增加。这些变化是肾移植后促红细胞生成素改善的早期且敏感的指标。 网织红细胞数也可用于监测人合成促红细胞生成素(rhuEPO)治疗疗效。有关IRF能否提供患者接受rhuEPO治疗几天内相关信息方面也有报道。早产儿进行rhuEPO治疗期间可用网织红细胞数和IRF监测。贫血的癌症患者rhuEPO治疗2-4星期后早期网织红细胞数增加。基于网织红细胞数的简单预测运算也已有提议。最后,运用网织红细胞参数检测运动员非法使用rhuEPO也日益受到关注。 自动有核红细胞计数(NRBCs)---高层次运用 外周血循环NRBCs鉴定为下述情况提供重要的临床信息:非正常生理状态(如早产儿),在强烈促红细胞生成素刺激下(如免疫性溶血性贫血,先天性贫血溶血危象,微血管病贫血,严重珠蛋白生成障碍性贫血或镰状细胞贫血,发育不全或骨髓移植康复),造血功能严重不全(如癌细胞浸润,淋巴瘤或白血病,纤维化,和髓外造血),以及组织缺氧状态(严重贫血,心、肺功能不全,新生儿窒息)。自动血细胞计数不易区分NRBCs和白细胞(WBC)。根据不同大小和对溶血素的敏感性差异,包括在淋巴细胞中或噪声成分中NRBCs是多变和难以预测的。NRBCs是造成淋巴细胞假性增多的原因,也能在检测报告中造成淋巴细胞增殖异常假象。大部分血细胞计数由于噪声的增加,消除了淋巴细胞和噪声间的差异,提示NRBCs的出现。据报道对NRBCs提示的特异性为90%以上;但是,灵敏度变化范围较宽(20-90%)。血细胞计数中NRBC计数能通过半自动化方式通过单克隆抗体和多通道流式细胞仪测定。最近出现的血液分析仪如XE-2100能实现基于核荧光的全自动测定NRBC。 XE-2100和NRBC计数 XE-2100血液分析仪实现了NRBC鉴别和计数。用一种荧光染料(Stromatolyser-NR)染色完整的WBCs和NRBCs。在二维图像中,X-轴代表侧荧光强度,而Y-轴代表前向散点荧光强度。WBC左侧为分离完全的NRBCs细胞簇(图3)。NRBC数表示为每100WBC的比例和每单位血的绝对数。若样本NRBC比例为2.0%或更多,则标记为"NRBC阳性" 。最近我们开展了有关这项新方法有效性的评价,用精确性和准确性表示:用线性回归和NCCLS-H20A方法重复测量,比较差异衡量其精确度;通过与参考NCCLS-H20A显微镜方法获得的NRBC数比较衡量其准确度。重复测定间差异的平均值分别为 NRBCs和0.11% NRBCs,相应变异系数(CVs)为12.6%和12.8%(图 4a,b)。309例样本NRBC测定不符合率为2%,更多量NRBC会使这个数字增加,绝对数和相对数的CVs皆为8.8%。XE-2100和显微镜参考方法140例样本(0.1-466.3NRBCs/100白细胞进行检测,相关性很好) (图4c,d)。差异分析显示大部分样本一致性很好,平均差异为-1.55(XE-2100-显微镜参考方法)。NRBC数很高时(大于50-100NRBCs/100白细胞),XE-2100测得的NRBC数略低。300例样本参加一项临床敏感性和特异性研究,其中部分来自于健康对象(80),新生儿和早产儿(61),以及有大量变异的异常细胞类型患者和染色涂片发现有大量NRBC的阳性标本。显微镜方法发现NRBCs的样本有134例(44.7%)。结果如表1所示。两种方法样本一致率为99.3%。假阳性为13(4.3%),所有的均为NRBC数很低的样本。假阴性仅有7例(2.3%)(表2);其外周血涂片测定的NRBCs为0.5-1.5%。自动NRBC计数(结果>0)的敏感度为 94.8%,特异度为92.2%。对于涂片中NRBC存在的样本其NRBC数估计值>0的为90.7%(真阳性率),而对于无NRBC的样本其NRBC估计值=0的为95.6%(真阴性率)。 图3. 外周血标本(NRBC数不同)XE-2100 NRBC荧光染色与大小的细胞图。NRBC如图示为红色部分,位于噪声(深蓝)和右侧白细胞(浅蓝)的中间。
[此贴子已经被作者于2005-3-24 21:53:33编辑过]
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 楼主| 郑振寰 发表于 2002-9-12 09:55 | 显示全部楼层
图4. . XE-2100计数方法评价:以下两指标评价重复性 a 相关性 b 666例样本重复测量差异分析;以下两指标评价准确性(与显微镜方法比较) c 线性回归 d 差异分析
[此贴子已经被作者于2005-3-24 21:55:10编辑过]
 楼主| 郑振寰 发表于 2002-9-12 09:56 | 显示全部楼层
总之,我们的结果显示XE-2100法测定外周血NRBC准确性好,重复性强,与其它方法相关性好,灵敏度、特异度高,适于临床应用。 自动测定方法因其精确,准确和快速NRBC计数,因此在血液学诊断和新生儿学方面将有显著价值。特别对于胎儿血或脐血的NRBC计数,不减少了实验室工作负担和涂片复检率。,而且在对自体或异体移植(与细胞计数的干扰)的脐血冷冻保存前的工作是非常重要的。它可以作为新生儿疾病的预后指标,以及对胎儿血在超生波指引下的诊断。同时也表明NRBC数和Apgar分数及脐血Ph值成负相关,过多的NRBCs与下例情况有关:子宫内缺氧,早产,同种免疫,先天性心脏疾病,延迟分娩,新生儿窒息或损伤,死产,糖尿病,先兆子痫。
[此贴子已经被作者于2005-3-24 22:01:02编辑过]
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