[转发]两点法测定代谢物浓度的参数设置

张 韬

河南大学淮河医院检验科 邮政编码 475000

一般认为两点法测定代谢物浓度存在最佳反应时间段，但在
实际工作中发现各个时间段的测定值十分接近，即时间段对实验
的准确性无明显影响，两点法存在最佳反映时间段吗？本文从理
论上探讨了不考虑设置最佳反应时间段的可能性，而从反应速度
和反应敏感度的角度来设置实验参数，摈弃反应时间段对标本量
的限制，从而可以加大标本用量，缩短反应时间，大大提高了工
作效率，下面以两点法测定血糖为例讨论如下。

1 材 料
1.1 仪器 COBAS-EMIRA
1.2 试剂和标本
试剂 GOD-PAP法血糖液体试剂（北京中生生物工程高技术公司）
标本 随机选择几份标本
2 实验步骤
2.1 任取几份标本用终点法（标本量3UL，测定时间0-900
秒）测定并打印原始吸光度数据。
2.2 另取几份标本用终点法和改进两点法（标本量15UL，测
定时间25-75秒）平行测定
3 结果

3.1 用终点法测定的结果和各个时间点测得的原始吸光度值如下

测定值 5.55 11.37 11.19 4.4 5.47 4.78 4.47
时间点1（25秒时） 614 726 720 527 545 546 526
时间点2（50秒时） 880 1273 1258 729 810 771 743
时间点3（75秒时） 1083 1702 1683 890 1021 854 912
时间点4（100秒时） 1241 2040 2021 1016 1184 1095 1052
时间点5（125秒时） 1375 2316 2291 1125 1319 1214 1162
时间点6（150秒时） 1481 2544 2522 1214 1431 1314 1254
时间点7（175秒时） 1577 2734 2702 1288 1526 1395 1334
时间点8（200秒时） 1644 2894 2878 1350 1608 1463 1401
时间点9（225秒时） 1724 3057 3023 1400 1679 1530 1461
时间点12（300秒时）2205 4085 4030 1776 2181 1960 1863

3.2 用相邻两个时间点的吸光度值相减观察反应进程，可明显看到
不是匀速反应，并不存在一个线形的反应时间段，它是一个逐渐减慢
的反应，其数值如下

测定值 5.55 11.37 11.19 4.4 5.47 4.78 4.47
2-1 266 547 538 202 265 225 217
3-2 203 429 425 161 211 183 169
4-3 158 338 338 126 163 141 140
5-4 134 276 270 109 135 119 110
6-5 106 228 231 89 112 100 92
7-6 96 190 180 74 95 81 80
8-7 87 160 176 62 82 68 67
9-8 60 163 145 50 71 67 60

3.3 既然不存在线形反应，它应符合什么规律呢？事实上它完全符
合浓度反应的一般规律 浓度反应公式C=C0*exp（-kt），即瞬时反应浓
度与原始浓度和时间有关。可以设法验证此公式
假设在300秒时反应达到终点，此时所有的底物都转化为了产物，
那么此时的产物量就是原始的底物量。已知原始底物量和瞬时的产物
量则可以求得瞬时的底物量。于是与表一相反用吸光度值表示各个时
间点的底物浓度如下表所示

测定值 5.55 11.37 11.19 4.4 5.47 4.78 4.47
时间点1（25秒时） 1591 3359 3310 1249 1636 1414 1337
时间点2（50秒时） 1325 2812 2772 1047 1371 1189 1120
时间点3（75秒时） 1122 2382 2347 886 1160 1006 951
时间点4（100秒时） 964 2045 2009 760 997 865 811
时间点5（125秒时） 830 1769 1739 651 862 746 701
时间点6（150秒时） 724 1541 1538 562 750 646 609
时间点7（175秒时） 628 1351 1328 488 655 565 529
时间点8（200秒时） 541 1191 1152 426 573 497 462

3.4 现在任取一个时间点的一组数据均可以得到一个因子，该因子与
该时间点的底物浓度相乘可以求得该组数据的原始浓度。

测定值 11.37 11.19 4.4 5.47 4.78 4.47
时间点1（25秒时）
11。37/3359*各组底物浓度 11.21 4.23 5.54 4.81 4.53
时间点2（50秒时）
11.37/2812*各组底物浓度 11.20 4.23 5.53 4.80 4.53
时间点3（75秒时）
11.37/2383* 各组底物浓度 11.17 4.23 5.54 4.81 4.51
时间点4（100秒时）
11.37/2045*各组底物浓度 11.17 4.23 5.54 4.80 4.51
时间点6（150秒时）
11.19/1538*各组底物浓度 11.17 4.19 5.54 4.80 4.51
时间点7（175秒时）
4.78/565*各组底物浓度 11.18 4.11 5.51 4.75 4.45

3.5 从上可知，已知标准物的浓度和某一时间点的底物浓度可得到
一个因子，已知未知物该时间点的底物浓度则可以计算出该未知物的
浓度。任意一个时间点都可以验证此结论。因此说不存在最佳反应时
间段。但是在测定过程中测定得到的是产物浓度，底物浓度不能直接
得到。我们也是反过来先计算出底物浓度然后来验证。这时我们可以
取两点法避开此困难。任意两点之间的底物浓度差值和产物浓度差值
相等，而此差值也和原始浓度存在一固定的因子关系。实际上多点之
间的两两差值之合也同样和原始浓度存在固定的因子关系。下面是几
个计算示例.

测定值 11.37 11.19 4.4 5.47 4.78 4.47
底物浓度差值（100-25秒时） 1314 1301 489 639 549 526
11.37/1314*底物浓度差值 11.26 4.23 5.53 4.75 4.55
底物浓度差值（175-25秒时） 2008 1982 761 981 849 808
11.37/2008*底物浓度差值 11.22 4.30 5.55 4.81 4.57
底物浓度差值之和
（100+75+50-3*25秒时） 2837 2802 1054 1380 1182 1129
11.37/2837*底物浓度差值之和 11.23 4.23 5.53 4.73 4.52

3.6 另取几份标本用终点法和改进两点法（即加大标本量，同时缩短反
应时间）平行测定

终点法的测定值 9.10 5.91 8.86 9.82 7.38 4.53 5.56
两点法的测定值 9.08 5.90 8.76 9.79 7.42 4.39 5.66

4 讨论

4.1 动力法测定代谢物浓度的方法是国际推荐的一种好的方法，它
可以消除各种空白干扰，不需要反应完全，可以迅速抱出结果，且线形范
围更宽，与终点法比有很明显的优越性。
4.2 但是动力法测定代谢物浓度的参数设置在基层实验室还存在很
大的误区。很多人认为它的依据是基于反应速度之上，即在一级反应时，
在一定的时间范围内存在一个线形的反应时间段，这一段内的反应速度保
持不变且与待测物浓度成正比。很多人找这个反应时间段并把这个反应时
间段定为最佳反应时间段。事实上这个反应时间段根本不存在，从表二可
以看出，随着反应的进行，相邻的两个时间点的吸光度值成一种明显的递
减趋势，没有匀速反应。
4.3 动力法测定代谢物浓度与反应速度根本就没有关系从表三，表
四和表五可知，只需要用一个时间点的数据就可以测定未知的浓度。实际
工作中用两个点，其实用四，五或更多的点也可以。多个点更好，这样可
以消除一个点的不稳定性，但无现成的软件使用，较为麻烦。
4.5 动力法测定代谢物浓度只是基于一种最基本的数学道理，任意
一个时间点的底物浓度都和原始浓度存在一个固定的函数关系，找到这个
函数关系，则两者之间可以相互推算。使用标准管时则不必明确函数关系
。总之不必要求两者之间一定是直线关系。
4.6 综上所述，动力法测定代谢物浓度无最佳反应时间段，因此可
以不必要考虑反应时间段的限制，而从反应敏感度的角度来设置实验参数
。从而可以选择较短的反应段，而加大标本用量增加反应敏感度。从表六
可以看出，标本量加大三倍，时间缩短三倍，以此参数测得的数值与终点
法的数值没有差异。

学习了、谢谢分享！