[转发]白血病、淋巴瘤免疫分型标准操作规程

1.检验申请

白血病、淋巴瘤免疫分型

2.标本采集与处理

2．1 受检者准备：一般无需准备。

2.2 容器准备：抗凝试管。最好用含抗凝剂的真空采血管。

2.3 标本采集：骨髓液静脉1～2，如外周血白血病细胞较多，可抽静脉血2～3ml。淋巴瘤病人还可采用淋巴结活检组织一小颗。

2.4 抗凝剂：EDTA二钾或EDTA三钾。

2.5 标本的标记：粘贴检验单联号，最好粘贴条形码。

2.6 标本保存条件：当天完成测定或放置2～8℃冰箱内次日完成测定。

3．标本拒收的标准

3．1严重溶血的标本。

3．2已凝固的标本。

3．3室温放置超过1d的标本。

4、方法原理

白血病细胞本身未发现特殊的白血病抗原。免疫分型的原理是基于白血病细胞病变时分化阻滞学说。白血病细胞与正常髓系和淋巴祖细胞一样，会出现某个细胞发育阶段的抗原表达特征。由于细胞分化级系缺乏绝对的界限，所以免疫分型常采用一组级系相关的单抗来确定其相关抗原的存在。根据欧洲白血免疫学特征研究组和英国血液学标准化委员会方案的建议，如果骨髓和外周血中具有某些分化相关抗原的淋巴细胞超过20%，髓系抗原细胞超过20%可诊断某一类型的白血病。国内也有以淋巴、髓系抗原超过20%为标准，对某具有高度特异性的抗原如MPO、cyCD3 、CD79a等以10%作为判断标准。

5、试剂及其他用品准备

5.1常用免疫分型单克隆抗体：

5．1．1 T淋巴细胞白血病：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD25、CD71。

5．1．2 B淋巴细胞白血病：CD10、CD19、CD21、CD22、CD23、CD24。

5．1．3 NK淋巴细胞白血病：CD16、CD56、CD57。

5．1．4 髓系白血病：CD13、CD14、cd15、CD33、CD64、CD68、MPO（髓过氧化物酶）。

5．1．5 红白血病：GlPA（血型糖蛋白A）、CD36、CD71。

5．1．6巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61。

5．1．7干、祖细胞系：CD34、CD90、CD117、CD35。

5．1．8非系列特异性：CD9、CD38、CD45、HLA-DR

5．2为了方便测定，提高免疫分型的准确性，可采用多色标记的免疫单抗，常用以下系列的组合单抗。使用时可根据需要可选择。

5．2．1同型对照FITC/PE/CD45-ECD，

5．2．2 CD14-FITC/CD13-PE/CD45-ECD

5．2．3 CD15-FITC/CD33-PE/CD45-ECD

5．2．4 CD41-FITC/GPA-PE/CD45-ECD10ml

5．2．5 HLA-DR-FITC/CD34-PE/CD45-ECD

5．2．6 CD5-FITC/CD7-PE/CD3-ECD

5．2．7 CD20-FITC/CD10-PE/CD19-ECD

5．3 Q-Prep仪试剂1，试剂2，试剂3。

5．4磷酸盐缓冲液（PBS），pH7.4.

5.5 试剂盒来源：

5.6 试剂盒保存：2～8℃，避光保存。

5.7 试剂盒准备：根据说明书。

6． 适用仪器

适用Beckman-Counter品牌各个型号的流式细胞仪器。

7．操作

7．1免疫分型三色(2+1)方案

7．1．1对照管加10ml 同型对照FITC/PE/CD45-ECD。

7．1．2测定管各加10ml CD14-FITC/CD13-PE/CD45-ECD、10ml CD15-FITC/CD33-PE/CD45-ECD、10ml CD41-FITC/GPA-PE/CD45-ECD10ml 、HLA-DR-FITC/CD34-PE/CD45-ECD。

7．1．3测定管和对照管各加5～10´10⁵全血、骨髓混匀，室温避光放置15min。

7．1．4 在Q-Prep仪上溶血，固定。

7．1．5 200rpm离心5min,弃上层后用PBS洗涤一次，弃上清。

7．1．6 加500μlPBS，在流式细胞仪上计数10⁴个以上细胞，记录阳性百分率。

7．2免疫分型四色(3+1)方案

7．2．1对照管加10同型对照FITC/PE/CD45-ECD。

7．2．2测定管各加10ml CD5-FITC/CD7-PE/CD3-ECD、10ml CD20-FITC/CD10-PE/CD19-ECD，混匀，室温避光15min

7．2．3测定管和对照管各 加5 ml CD45-PC5和5-10´10⁵全血、骨髓，室温避光放置15min

7．2．4在Q-Prep仪上溶血，固定。

7．2．5 200rpm离心5min,弃上层后用PBS洗涤一次，弃上清。

7．2．6 加500μlPBS，在流式细胞仪上计数10⁴个以上细胞，记录阳性百分率。

7．3 注意事项： 骨髓或外周血细胞有核细胞数较少时，可先采用Ficol分离液分离有核细胞，用PBS洗涤有核细胞后，调整细胞浓度在5-10´10⁵左右。

8．主要分析参数：

采用三色或四色分析方案。

9．白血病免疫分型的诊断标准

9．1 急性淋巴系白血病（ALL）

9．1．1急性B淋巴系白血病（B-ALL）

9．1．1．1MIC 标准:

B 祖细胞ALL: CD19+,TdT+,CD10-,CIg-.sIg-

Common ALL: CD19+,TdT+,CD10+,cIg-,sIg-

Pre-B- ALL: CD19+,TdT+,CD10+,cIg+,sIg-

B-ALL : CD19+,TdT-,CD10-,cIg-,sIg+

9．1．1．2 欧洲白血免疫学特征研究组标准:

Pro-B-ALL: (BⅠ型):CD19+,CD22+

Common ALL:(BⅡ型):CD19+,CD22+,CD10+

Pre-B-ALL: (BⅢ型):CD19+,CD22+,CyIgM+，

成熟B-ALL:(BⅣ型)：CD19+，CD22+，Kappa/Lambda+

9．1． 2急性T淋巴系白血病（T-ALL）

9．1．2．1MIC 标准:

T祖细胞型: CD2-

T成熟细胞型: CD2+

9．1．2．2 Reinheiz 标准:

早期胸腺细胞Ⅰ期:CD2+,CD5+,CD7+,CD38+,CD71+

普通胸腺细胞Ⅱ期:CD2+,CD5+,CD7+,CD38+,CD71-,CD4+,CD8+,CD1+

胸腺髓质细胞Ⅲ期:CD2+,CD5+,CD7+,CD38+,CD3+,CD4+,CD8+,CD1-

9．1．2．3欧洲白血免疫学特征研究组标准:

Pro-ALL:(TⅠ型):CD3+,CD7+

Pre-T-ALL(TⅡ型):CD3+,CD2+,CD5+,CD8+

皮质-T-ALL(TⅢ型):CD3+,CD1a+

成熟-T-ALL(TⅣ型):CD3+,CD1a+,anti-TCRα/β+ 或γ/δ+

9．3．急性髓性白血病(AML)

能亚型 常表 达 抗 原

M0 CD11b,CD13或CD33

M1 CD13 CD15 CD33 CD34 HLA-DR

M2 CD11b CD13 CD15 CD33 CD34 HLA-DR 

CD56 CD19

M3 CD11b CD13 CD15 CD33 CD34

M4 CD4 CD11b CD13 CD14 CD15 CD33 CD34

M5 CD4 CD11b CD13 CD14 CD15 CD33 CD34

M6 血型糖蛋白A CD13 CD33 CD34

M7 CD41 CD61 CD13 CD33 CD34 因子Ⅷ相关抗原

10．各型白血病及淋巴瘤免疫分型特点

10．1 急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）

10．1．1 M0：有低的(Side scatter ,SSC)和Forward scatter（FSC)。在CD45-SSC图上出现在淋巴细胞位置上，至少表达一个特异性标志如CD13或CD11b，但MPO比CD13与CD33更灵敏。一般淋系标志阴性，但可表达CD7或CD4。HLA-DR、CD34常为阳性。CD7与CD34共表达预后差。

10．1．2 M1：流式上M1与M0相似不易区分，M1一般CD13⁺、CD33⁺、HLA-DR^-，但CD34表达少于M0，部分可表达CD15。

10．1．3 M2：与M0和M1的主要区别是成熟度增加，原始细胞减少，CD15较M1显著，CD34弱于M1，CD13有时表达强于CD33，多数病例HLA-DR^-。CD45-SSC图显示从髓系原始细胞区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45-SSC图有助于确定原始细胞比例。

10．1．4 M3：胞浆内有较多的颗粒，故具较高的SSC，多数情况HLA-DR^-或少表达，CD34少于M2、一般CD13弱阳性，可表达CD2。

10．1．5 M4与M5：两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34，较之M0、M1，M4与M5有更大的FSC和SSC。CD45-SSC图上，白血病细胞出现在单核区，重要的表型为CD13、CD33、HLA-DR、CD14和CD15、CD64，CD33表达可强于CD13，CD33⁺、CD13^-、CD34^-很可能为M5，少数病人CD56⁺。

10．1．6 M6：一般HLA-DR，CD34、CD13和CD33阳性，CD45-SSC图显示主要为红系成份。血型糖蛋白A、CD71可阳性。

10．1．7 M7：一般CD61和/或CD41阳性。需要注意是由于血小板粘附在原始细胞上造成的假阳性，可以用流式双色分析CD41、CD61、CD34，减少血小板的粘附。

10．2. 急性淋巴细胞性白血病（Acute lymphoblastic leukemia, ALL）

10．2．1B祖细胞型ALL：在儿童，约90％病例CD10⁺，在幼儿只有少于50％病例CD10⁺，原始细胞一般FSC、SSC很小，系FAB标准的L1或L2，一般TdT⁺、HLA-DR⁺、CD19⁺。此型又分为2个亚型，CD10⁺和CD10^-，前者预后好，多数病例CD24⁺和CD34⁺，CD20表达随成熟度增加而增加，B祖细胞被定义为sIg^-。

10．2．2前B细胞型ALL：一般为CD19⁺，CD24⁺，HLA-DR⁺，胞浆CD22⁺，CD10⁺，TdT随CD20变化，CD34多为阴性。前B亚型被认为比B祖型预后更差，这与t(1；19)及其E2A-PBX1融合蛋白有关，它的表型为CD19⁺、CD10⁺、CD9⁺，不同程度CD20表达，CD34^-，确认此表型有助于诊断基因上不确定的病例。

10．2．3 B细胞型ALL：B细胞型ALL较之B祖细胞型ALL有更大的FSC和SSC，在CD45-SSC图上出现在淋巴和单核细胞区域，即FAB标准的L3，表型为CD19、CD20、CD22、CD24、sIg（多数为IgM）及多数CD10阳性。但成熟抗原及sIg能区别于更早的B系ALL，极少数成熟B细胞ALL无FAB-L3形态。

10．2．4T-ALL：多数病例有大的FSC、SSC，在CD45-SSC图上可能出现在淋系未成熟细胞和髓系未成熟细胞或单核细胞区。多数表现为胸腺亚型，最常见为皮质晚期表达，CD1、CD2、CD5、CD7、CD4/ CD8双阳与极少膜表面CD3、TdT多为阳性。另一常见亚型为皮质早期表达CD2、CD5、CD7、TdT强表达。髓质期亚型表达CD2、CD5、CD7与CD3⁺CD4⁺/CD3⁺CD8⁺,很少表达TdT。前T细胞亚型，表达CD7和cyCD3⁺且无其它T细胞抗原，T细胞肿瘤的特征是丧失T细胞抗原而表现出其它异常抗原组合。

10．3. 慢性粒细胞白血病（Chronic granulocytic leukemia,CGL）

由于慢性期显著的细胞成熟，在CD45-SSC图上除了髓系细胞占主导外，只显示一个正常骨髓像，CGL可确诊。并可用分子流式术检测BCR-ABL癌基因。流式细胞术对急变期亚型的诊断具有极高价值。髓性急变可表现多种形态包括未分化细胞。淋系急变具典型形态特征，为CD10⁺B祖细胞ALL，极少有T细胞型。

10．4. 慢性淋巴细胞白血病（Chronic lymphocytic leukemia，CLL）

免疫分型主要为sIgM、sIgD弱表达，B系抗原为CD19、CD20、CD43、CD79a与CD5共表达，CD23的表达可区别CLL和多毛细胞白血病（Hairy cell leukemia,HCL），前者CD23⁺，后者CD23^-。B型前淋巴细胞白血病较CLL更为严重，流式细胞术在区分B型前淋巴细胞白血病和CLL可发挥很大作用，B型前淋巴细胞白血病多为CD5^-，CD22⁺，表达更强的膜表面免疫球蛋白。HCL平均生存率不超过5年，与CLL在形态上很难区分，有相似的CD5⁺B祖细胞，但膜表面免疫球蛋白表达强于CLL，且CD22^-。

10．5. 淋巴瘤：流式多参数分析对淋巴瘤诊断有重要意义，标本多取自淋巴结或细针穿刺，细针穿刺获得的标本用免疫分型作诊断可免除病人昂贵的手术过程，是细胞形态学诊断重要的辅助手段。此外，许多淋巴瘤和白血病表现出一些特征的抗原密度改变如CLL中CD20减少，HCL中CD20增加。流式定量技术同样具有重要意义，可对单个细胞的DNA含量作定量分析，确定处于不同细胞周期的各群细胞数。由于染色体改变产生的异倍体细胞数亦可被检测到，S期细胞数对分型诊断有参考意义。流式还可通过检测Ki-67确定增殖群体

10．6 毛细胞型白血病（HCL）： HCL少见，但却是较易辩认的B系淋巴细胞增生性疾病。瘤细胞一般表达B系抗原CD19、CD20、CD22、CD79a，且为sIg⁺。重链多为IgM和IgD，sIg中度表达。CD11c和CD22强表达，CD25中度表达。粘膜淋巴细胞抗原CD103是HCL区别于其它B系白血病的可信标志。还可发现骨髓微小残余病变，且灵敏度在1％以下。

10．7.外周T细胞肿瘤：与胸腺型T-ALL和原始淋巴细胞型淋巴瘤不同。这组疾病是以外周T细胞亚型为特征的，主要为CD3与CD4或CD8共表达，且多表达α/β或ν/δ型T细胞受体。尽管肿瘤CD4⁺和CD8⁺两种为主，但CD4与CD8并不能作为系特异性标志，有些变异的亚型，特别是丧失全部T细胞抗原的亚型在这组疾病也很常见。

有人认为最常见胸腺后期亚型是T细胞幼淋巴细胞白血病（T prolymphocytic leukemia, T-PLL），约占此类疾病的1/3，病人表现为白细胞增多症（经常>10⁵）。脾肿大，淋巴结病，免疫表达CD2⁺，CD3⁺，CD5⁺，CD7⁺，多数为CD4⁺，CD8^-（偶可CD4、CD8共表达），CD8单独表达极少。CD4⁺CD8^-表型疗效好。T-PLL较之B细胞型更严重。

大颗粒淋巴细胞白血病（Large granular lymphocytic leukemia, LGLL）较T-PLL更常见，细胞典型形态为大颗粒淋巴细胞，轻至中度淋巴细胞增多常伴以中性粒细胞减少，常见两种亚型，T细胞型（T-LGLL）表达CD3、弱CD8、CD2、T细胞受体（TCR）αβ和一些NK细胞标志（如CD16、 CD57，而CD56^-、CD5^-、CD7^-、CD4^-、CD25^-）， 这些病例TCR基因重排且与类风湿性关节炎显著相关。另一较少见的亚型为NK细胞型（NK-LGLL），表达CD56、CD16，多数无CD3、CD4、TCRαβ，CD8和CD57弱或无表达，这型无TCR基因重排，且临床表现出更明显的贫血、肝脾肿大、血小板减少等症状。所有亚型多进展平稳，但CD3⁺、CD56⁺变异型T-LGLL较为凶险。

成人T细胞淋巴瘤白血病，与HTLVⅠ相关具有激活的T细胞表型，表达TCR、CD3、CD4、CD5、HLA-DR以及强表达CD25， CD7、CD8多为阴性。流式细胞术还可检测到粘附分子L-selectin的异常表达。P53异常与疾病进程有关。

由于形态学及免疫表型上的重叠，外周T细胞肿瘤常难于鉴别诊断。基因学方法有助于区别低级与高级分类。必须在多方法结合的基础上进行诊断。

10．8. 大细胞淋巴瘤（Large cell lymphoma ,LCL）：LCL占成人淋巴瘤的40％，在儿童中占30％。在成人80％是B细胞，而在儿童LCL分为B细胞、T细胞及不确定型。约40％病例CD30⁺。T细胞型较其它两型严重。LCL多见与B细胞表型相关的BCL-2基因重排，且预后好。

10．9 何杰金氏淋巴瘤：何杰金氏淋巴瘤在形态上可确认的肿瘤细胞不足1％，多数为炎症细胞，所以多数病例在流式上只有非特异显示。限制了流式在何杰金氏淋巴瘤中的应用。有报道Reed-Sternberg细胞表达T、B细胞表面标志及TCR，Ig的基因重排。结节性硬化、淋巴细胞缺失、混合细胞型的何杰金氏淋巴瘤表达CD30⁺、CD70⁺、CD15⁺，且多CD45^-。用CD15/CD30双色分析可确定Reed-Sternberg细胞，但灵敏度很低，半数病例表达T细胞标志如CD2、CD3、CD4。结节淋巴细胞为主的何杰金氏淋巴瘤被认为是B细胞型，此型Reed-Sternberg细胞表达CD20， CD45阳性，但不表达CD30、CD70和CD15。

10．10其他

10．10．1急性双系或双表型白血病的诊断

急性混合细胞白血病分为双表型、双系列型、双克隆型。其中双表型、双系列型较常见。区分双表型和双系列型常需进行双标记。多认为无必要区分双表型和双系列型，可统称为双表型急性白血病(Biphenotypic acute leukemia, BAL)。目前诊断BAL常用的标准有多个，其中以欧洲白血免疫学特征研究组(1995)的标准较为常用。

由于BAL是一种起源较早的疾病，预后较差。其诊断率的提高需要流式细胞术较全面的免疫表型(尤其是系列特异性较强的标记)检查。

10．10．2仅表达个别非本系列相关抗原的急性白血病（Ly⁺-AML、My⁺-ALL）

通过免疫分型，可诊断表达个别淋系抗原的急性髓系白血病（Ly⁺-AML）和表达个别髓系抗原的急淋（My⁺-ALL）。由于它们临床特征、预后转归与Ly^--AML、My^--ALL不同，应该采用不同的治疗策略，故免疫表型可为白血病治疗措施的个体化提供了依据。

My⁺-ALL的免疫表型和临床特点：以CD13、CD33表达多见，CD14、CD15表达少见。以相对早期的ALL细胞如前前B细胞型ALL细胞，T-ALLⅠ型细胞表达多见，说明这部分白血病细胞可能从具有分化或表达两系以上特点的造血祖细胞恶变转化而来。临床特点为肝脾淋巴结肿大，细胞形态学与组织化学无特征性标志，ALL的常见化疗对My⁺-ALL不敏感。应采用强化疗或缓解后骨髓移植。Ly⁺-AML是一类与Ly^--AML临床特点有所不同、治疗效果差、预后不良的AML。Ly⁺-AML中以CD7⁺多见。 CD7抗原曾被认为T细胞特异标志，目前认为并非如此，多能干细胞、髓系干细胞与微小分化型急性髓细胞白血病等均可表达CD7抗原。细胞分化程度愈低，CD7抗原表达频率愈高。CD7⁺ AML的免疫表型为多伴CD34和HLA-DR 阳性，与P糖蛋白表达高度相关，在M1、 M5 中表达多见，但M3；尚未见表达。CD7⁺-AML发生率10%~20%，肝脾肿大常见，外周WBC较高，中枢神经系统白血病发生率高 ，常规化疗方案反应差，如改用ALL化疗方案可获得缓解。

10．10．3骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndrome,MDS）免疫表型分析的临床意义

MDS患者髓系抗原表达明显增高。淋巴细胞抗原表达相对减少。而且抗原表达随FAB亚型转化出现规律性变化，RA/RAS向RAEB再向RAEB-t转化，较早期髓系抗原(如CD13、CD33)逐渐增加，较晚期抗原逐渐减少，淋巴细胞抗原表达减少；RA/RAS骨髓CD34细胞大致正常，RAEB和RAEB-t CD34细胞数明显增高；较早期骨髓细胞(即祖细胞)表面抗原CD38、HLA-DR、CD99R和CD9S表达增加。CD34和其它早期抗原表达增高MDS，预后较差，易转化白血病。

11．免疫分型中的几个问题

11.1单克隆抗体的选择：白血病免疫分型时尽量选用系列特异性强的单抗作为一线单抗，目前较为公认系列特异性单抗有T系的cyCD3, B系的cyCD79a、cyCD22和髓系的MPO、cyCD13等。一般说胞浆比胞膜的标志特异性强。用此特异性强的标志作为初筛，基本可确定T、 B或髓系，然后再进一步分析。各系列较特别的标志单抗：AML有MPO、 CD33、 CDl3、 CDl4 、CDl5、 CDllb、 CDllc；T-ALL有c／mCD3、 CD2、 CD5、 CD7、 CD4／CD8；B-ALL有cyCD22、cyCD79、 CDl9、 CDl0、 CD24、 HLA-DR、 CD20、 CD38；造血干／祖细胞有CD34、 CDll7、 HLA-DR、 ACl33。

在AML各亚型的免疫分型中有时仍较难分辨，有以下特点可供参考：①CD41、CD61是巨核细胞的标志，但血小板粘附于某细胞上可造成假阳性。 ②CD71与血型糖蛋白A是红系的标志，见于M6型。③ CDl4、 CD64是单核细胞的标志。 ④M3，t(15；17)者典型的免疫表型是CDl3⁺、 CD33⁺、 CD9⁺、 CD38⁺、 CD34^-、 DR^-。⑤t(8；21)M2的表型为 CDl3⁺、 DR⁺、 CD34⁺、 CD33⁺、 CDl5⁺、 CDl9⁺或CD56⁺。⑥M0与M1较难区分，应有髓系标志而无淋系标志，胞浆MPO应阴性或弱阳性。 CD34及DR在M0较强，并可伴有CD7与CD4阳性。⑦ CDll7⁺多见于AML。⑧ CD7常与CD34共表达， CD4可见于M4、M5。 CD2⁺可见于M4Eo，往往伴有16号染色体异常。 M3亦可有 CD56⁺表达。正常粒细跑可表达 CDl0。由此可见，单抗本身有其多向性，勿轻易判断为杂合型白血病。⑨ T／B-ALL可分为几个亚型，然而对临床价值不大。但若B-ALL伴有CD34表达时，应进一步作遗传学与基因检测，以确定是否有Ph⁺。bcl/abl或bcr／abl mRNA阳性者，预后均较差，应接受大剂量化疗或早期异基因骨髓移植。

11．2用CD45/SSC辅助设门提高免疫分型的准确性： 白血病免疫分型时如何提高设门的准确性至关重要。用流式细胞术单参数测定的准确性不高。现今国际上通用的是 CD45／SSC设门法，其目的是排除正常细胞的干扰，将不正常的细胞群孤立出来便于重点分析。其原理是CD45是所有白细胞的抗原， CD45表达量在成熟淋巴细胞最高，单核细胞、粒细胞、早期造血细胞依次减弱。红细胞(中、晚幼红细胞、成熟红细胞)不表达 。侧向角光散射(SSC)反映细胞的颗粒性，成熟粒细胞 SSC最高，依次为单核细胞、淋巴细胞、 早期造血细胞和红细胞。以 CD45／SSC典型图即可获得初步印象。若同时加上一个或二个以上其它单抗进行二、三色甚至四色分析，则很容易识别非正常细胞群的表型，并排除正常细胞的干扰，当标本中幼稚细胞低于50％或检测残存白细胞时尤为必要。

12。当检验系统（仪器）不能正常工作时应采取的补救措施

12．1立即请示本部门技术主管，在其它的分析仪器上检测。

12．2必要时启用手工方法。

12．3如本实验室无法解决，及时向科主任汇报，请求解决办法。

13．有关引用程序与文件

浙江省医疗机构管理与诊疗技术规范丛书-临床检验管理与技术规范

14． 参考文献