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[转发]基因扩增分析项目操作规程

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郑振寰 发表于 2007-1-30 15:25 | 显示全部楼层 |阅读模式

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一、乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测标准操作规程

采用PCR方法结合荧光探针的体外扩增和检测技术,适用于检测人临床血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒DNA,用于乙型肝炎的辅助诊断,并应用于抗病毒药物治疗中辅助疗效的判断。

1、储存条件及有效期

本试剂盒贮存于-20℃的条件下有效期为12个月(请于有效期内使用)。

2、 样本采集

2.1 本试剂盒适用于血清或血浆样本。

2.2 采集血清样本时,取被检者静脉血。

2.3 用无菌注射针头抽取2ml,收集于无菌离心管中。

2.4 室温放置不超过4小时。

2.5 1600g离心20分钟,吸取血清【切勿吸入红细胞】转入另一无菌离心管中备用。

2.6 采集血浆样本时,无菌注射针头采2ml静脉血于含有EDTA作为抗凝剂的无菌离心管中【不可用肝素抗凝】。

2.7 室温放置不应超过4小时,室温1600g离心20分钟。

2.8 分离血浆【切勿吸入红细胞】,转入无菌离心管中备用。

3、 样本存放

3.1 待测样本在2-8℃保存不应超过24小时。

3.2 -20℃保存不超过三个月。

3.3 -70℃以下长期保存。

3.4 应避免反复冻融。

4、 试用仪器

Roche LightCycler,Roter-Gene 2000/3000,PE Gene Amp 5700,PE Gene Amp 7700,ABI-7000,ABI-7300,BIO-RAD iCycler,Line-GeneⅠ,Line-GeneⅡ,MJ OpticonⅠ,MJ Opticon Ⅱ等国内市场主流荧光PCR仪

5、扩增试剂准备(PCR前准备区)

5.1 从试剂盒中取出HBV PCR反应液、Taq酶及UNG,室温融化并混合均匀后,2000rpm离心10sec

5.2 设所需要的PCR反应管管数为n(n = 样本数 + 2管阴性对照 + 1管强阳性对照 + 1管临界阳性对照 + 4管阳性工作标准品),每个测试反应体系配制如下表:

5.21 Roche LightCycler ,Roter-Gene2000/3000仪器,准备相应数量的毛细管

试 剂

HBV PCR反应液

Taq酶

UNG

用 量

17.8 ul

0.2 ul

0.03 ul

计算好各试剂的使用量,加入一适当体积离心管中,充分混合均匀,2000rpm离心10sec,向设定的n个Roche毛细管(LightCycler)中或普通PCR反应管(Roter-Gene2000/3000)中分别加入18ul,转移至样本处理区。

5.22 PE Gene Amp 5700,PE Gene Amp 7700,ABI-7000,ABI-7300,BIO-RAD iCycler,Line-GeneⅠ,Line-GeneⅡ,MJ OpticonⅠ,MJ Opticon Ⅱ等仪器,准备好相应的反应管

试 剂

HBV PCR反应液

Taq酶

UNG

用 量

37.6 ul

0.4 ul

0.06 ul

计算好各试剂的使用量,加入一适当体积离心管中,充分混合均匀,2000rpm离心10sec,向设定的n个PCR 反应管中分别加入38ul,转移至样本处理区。

6、 样本处理(样本处理区)

6.1 取待测血清或血浆样本以及试剂盒中的对照品各100ul,分别加到0.5ml离心管中。

6.2 加入100ul DNA提取液1,振荡混匀。

6.3 13,000rpm离心10min。

6.4 吸弃上清【离心时注意固定离心管方向、尽可能吸弃上清且不碰沉淀】。

6.5 再加入25ul DNA提取液2,振荡混匀,。

6.6 2,000rpm离心10sec。

6.7 100℃干浴或沸水浴 10min。

6.8 13,000rpm离心10min,保留上清备用。

6.9 如果样本裂解产物当天不使用,则要保存在-20℃

7、 加样(样本处理区)

7.1 若样本及对照品裂解产物保存在-20℃,使用前置室温解冻,以13,000rpm离心5min。

7.2 阳性工作标准品使用前置室温解冻,振荡混匀。

7.3 2000rpm离心10sec。

7.4 Roche仪器

7.41 在所设定的n个Roche毛细管中分别加入步骤2中处理过的样本、阴性对照、临界阳性对照和强阳性对照上清液以及阳性工作标准品各2ul(其中阴性对照做2管)。

7.42 盖紧管盖,连同Roche专用金属反应管套放在离心机中,于2,000rpm离心10sec。

7.43 将毛细管排好放入Roche PCR仪内,记录样本摆放顺序。

7.5 非Roche仪器

7.51 向所设定的n个PCR反应管中分别加入步骤1中处理过的样本、阴性对照、临界阳性对照和强阳性对照上清液以及阳性工作标准品各2ul(其中阴性对照做2管)。

7.52 盖紧管盖,将PCR 反应管转移至检测区,置于PCR仪上,记录样本摆放顺序。

8、PCR扩增(检测区)

8.1 循环扩增条件

8.11 Roche Lightcycler

a) 37℃:3 min; 92℃:1 min;

b) 92℃:5 sec, 60℃:30 sec(Acquisition Mode为Single)40个循环,Analysis Mode为Quantification。

8.12 Roter-Gene2000/3000

a) 37℃:5 min; 94℃:1 min;

b) 95℃:5 sec, 60℃:30 sec,40个循环。

c) 反应体系设为20ul。荧光信号收集设在60℃

8.13 PE Gene Amp5700,7700,ABI-7000,7300,Line-GeneⅠ,Ⅱ

a) 37℃:5 min; 94℃:1 min;

b) 95℃:5 sec, 60℃:30 sec,40个循环。

c) 反应体系设为40ul。

8.14 BIO-RAD iCycler

a) 37℃:5 min; 94℃:1 min;

b) 95℃:5 sec, 60℃:30 sec,42个循环。

c) 反应体系设为40ul。

8.15 MJ OpticonⅠ,

a) 375 min 941 min

b) 95℃:5 sec, 60℃:30 sec,40个循环。反应体系设为40ul。

c) 荧光信号收集设在60℃

8.2 仪器检测通道选择

8.21 Roche Lightcycler

选择F1通道。

8.22 Roter-Gene2000/3000

Acquisiton选择Fam。

8.23 PE Gene Amp 5700,7700,ABI-7000,7300

a) PE Gene Amp 5700是单通道荧光PCR检测仪,无需选择检测通道。

b) PE Gene Amp 7700, ABI-7000,7300 Reporter设为FAM,Quencher设为TAMRA。Passive Reference设为None(ABI-7000,7300)。

8.24 BIO-RAD iCycler

荧光素选择FAM-490。

8.25 Line-GeneⅠ,Ⅱ

选择F1通道,增益值批间有所不同,应按每批试剂建议值设定。(每一批试剂的增益值详见试剂盒中给定值)

8.26 MJ OpticonⅠ,Ⅱ

a) OpticonⅠ是单通道荧光PCR检测仪,无需选择荧光通道。

b) Opticon Ⅱ是双通道荧光检测仪,由于实验只需要单荧光,选择Single Color Experiment

9、 结果分析条件设定

9.1 Roche Lightcycler

9.11 选择F1或F1/F2通道(建议选择F1通道),点击Quantification进入定量分析窗口。

9.12 在Quantification窗口中,设定Analysis 方式为Fit points,Adjustment 方式为 proportional。

9.13 选定Noise band项,, 阈值(Noise band cursor)设定以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,且Ct值不出现任何数值为准。

9.14 也可根据仪器的实际情况进行调整。

9.2 Roter-Gene2000/3000

阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,且Ct值无数值为准。

9.3 PE Gene Amp 5700,7700,ABI-7000,7300

9.31 PE Gene Amp 5700 结果分析时基线(baseline)的确定

a) 取6—10或6—15个循环的荧光信号。

b) 阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,且Ct值=40.0为准。

9.32 PE Gene Amp 7700,ABI-7000,7300结果分析时基线(baseline)的确定

a) 取3—10或3—15个循环的荧光信号。

b) 阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,且Ct值=40.0为准。

9.4 BIO-RAD iCycler

9.41 结果分析时基线(baseline)的确定,基线(baseline)取为2—10或2—15个循环的荧光信号。

9.42 阈值(threshold) 设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,且Ct值=0.0为准。

9.43 也可根据仪器噪音情况在15.0—40.0之间调整。

9.5 Line-GeneⅠ,Ⅱ

9.51 点击数据分析进入结果分析界面。

9.52 选择样点拟合法进行结果分析:零点调整取1-10或1-15个循环的荧光信号。

9.53 在噪声容限界面下调整基线位置,其设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增线(无规则的噪音线)的最高点为准。

9.54 选择定量分析,对样本进行结果分析。

9.6 MJ OpticonⅠ,Ⅱ

9.61 点击Quantitation进入结果分析窗口

9.62 在Option选项区域进行基线以及阈值线的调整。

9.63 取为2—10或2—15个循环的荧光信号,阈值(threshold) 设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,且Ct值显示为none为准。

9.64 也可根据仪器噪音情况在15.0—40.0之间调整。

9.65 在用PE5700/7700,ABI-7000,7300/BIO-RAD, OpticonⅠ,Ⅱ/ Line-GeneⅠ,Ⅱ iCycler荧光定量PCR检测仪进行分析的过程中,为避免漏检强阳性样本

a) 应首先将基线定为6—10/3—10/2—10/1-10个循环的荧光信号观察分析Ct值。

b) 如果没有Ct值<16.0的样本,则将基线改定为6—15/3—15/2—15个循环的荧光信号进行结果分析。

c) 如有Ct值<16.0的样本,则应将该样本剔除此次结果分析。

d) 同时仍将基线改定为6—15/3—15/2—15个循环的荧光信号进行结果分析。

10、质控标准

10.1 本试剂盒的灵敏度即最低检出限为:5.0×102 copies /ml。

10.2 四个阳性工作标准品Ct值都应小于38.0。

10.3 将阳性工作标准品1—4的拷贝浓度输入,仪器将自动以阳性工作标准品拷贝浓度的对数值为横坐标,以其实际测得的Ct值为纵坐标给出标准曲线。

10.4 标准曲线的拟和度应小于等于-0.980,否则视为定量结果无效。

10.5 两个阴性对照的Ct值应无数值,拷贝数应为0.0 copies/ml。

10.6 强阳性对照的Ct值应小于等于30.0, HBV DNA拷贝数应为1.0×105-1.0×107copies/ml。

10.7 临界阳性对照的Ct值应大于强阳性对照的Ct值,并小于等于38.0。

10.8 HBV DNA拷贝数应为1.0×103-9.0×104copies/ml。

10.9 否则实验视为无效。

11、判断结果

11.1 检测样本中5.0×102copies/ml≤HBV DNA≤5.0×107copies/ml,测定结果有效,可直接报告相应的拷贝数。

11.2 检测样本中HBV DNA>5.0×107 copies/ml,既可直接报告为>5.0×107copies/ml,也可用正常人血清按10倍梯度做相应稀释,使其拷贝数落在1.0×105—5.0×107copies/ml范围内再重新测定,测定结果应以稀释倍数进行校正。

11.3 检测样本HBV DNA<5.0×102 copies/ml时,拷贝数仅供参考,报告为小于5×102 copies/ml。

11.4 检测样本HBV DNA为 0.0 copies/ml时,报告为小于最低检出限。

12、 试剂盒使用注意事项

12.1 有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管 理规范执行。

12.2 本试剂盒仅用于体外检测。

12.3 阳性工作标准品具体拷贝数请参照试剂盒内给定值。

12.4 实验请严格分区操作:

12.41 第一区:PCR前准备区 — 准备扩增所需试剂;

12.42 第二区:样本处理区 — 待测样本和对照品处理;

12.43 第三区:检测区 — PCR扩增检测。

12.5 各区物品均为专用,不得交叉使用,避免污染,实验后即请清洁工作台。

12.6 试剂盒内各试剂使用前,充分融化并振荡混匀后请稍事离心。

12.7 在-20℃保存的样本裂解产物,应在加样前置室温解冻,作短暂离心后使用。

12.8 分装有反应液的反应管应扣盖或装入密实袋内再转移至样本区。

12.9 加样时应使样品完全落入反应液中,不应有样品粘附于管壁上,加样后应尽快盖紧管盖。

12.10 扩增完毕立即取出反应管,密封在专用塑料袋内,丢弃于指定地点。

12.11 反应液分装时应尽量避免产生气泡,上机前注意检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质 泄露污染仪器。

12.12 实验中用过的吸头请直接打入盛有1%次氯酸钠的废物缸内,并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。

工作台及各物品定期用1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消毒。
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