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[转发]人类免疫缺陷病毒核酸扩增荧光定量检测标准操作规程

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郑振寰 发表于 2007-1-30 15:41 | 显示全部楼层 |阅读模式

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四、人类免疫缺陷病毒核酸扩增荧光定量检测标准操作规程

利用一对人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的特异性引物、一个特异性荧光探针,采用逆转录酶、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTPs)等成分,并应用RT-PCR技术实现对HIV-1 RNA gag基因区域的扩增。选取的靶区域是gag基因区域中部的一段保守区,长度102bp。gag基因位于HIV-1基因组的5’端约790—2292nt处,编码核衣壳蛋白等结构蛋白。同时利用荧光探针(Taqman探针和杂交双探针)检测技术,该探针能与引物扩增区域中间的一段模板发生特异性结合,随着PCR过程的进行,荧光信号发生相应的变化,使用在线监测的荧光PCR检测仪,即可同时实现对靶核苷酸序列的扩增及自动检测。还对引物和探针进行了优化,使得对HIV-1 B,B’,C,E等中国主要流行亚型有相似的扩增效率。

用于人血浆样本中的HIV-1 RNA的定量测定,适用于HIV感染的辅助诊断,抗HIV-1药物治疗的效果的检测。

抗病毒药物的疗效评价主要直接依赖两个指标:血浆中HIV RNA滴度和CD4+细胞数。在抗病毒药物治疗的跟踪中,本试剂盒可定量测定血浆中HIV RNA滴度,动态地反映治疗中HIV RNA滴度的变化,为疗效评价提供指标。

当前对HIV/AIDS的诊断主要依靠实验室检测,即HIV抗体检测。抗体检测很大程度上降低了HIV经血传播的危险性,但由于窗口期的存在,仍然不能完全避免。P24抗原检测可将“窗口期”缩短5-6天,但其在外周血中的存在时间非常短。而核酸检测方法可将“窗口期”缩短10-15天,更进一步降低了HIV经血传播的危险性。HIV核酸检测的对象还包括HIV阳性母体所生的婴儿、阳性患者的性伴侣、静脉吸毒者和可疑的血清反应者。

1、 储存条件

1.1 裂解液置4℃保存。

1.2 其他试剂均应目测为透明液体,-20℃保存,不宜反复冻融。

1.3 使用前应在室温下完全融化,并充分振荡混匀后稍事离心。

1.4 所有试剂避光保存。

2、 有效期

所有试剂有效期为12个月(请于有效期内使用)。

3、自备物品

自备试剂(分析纯) 氯仿、异丙醇(-20℃预冷)、75%乙醇(用DNase、RNase Free水配制,-20℃预冷)

4、自备仪器

4.1 PCR前准备区:

标准台式高速离心机

移液器(1-20ul,20-200ul,100-1000ul)

一次性耗材(吸头、离心管、手套、帽子等)

专用工作服、工作鞋、办公用品

4.2 样本处理区:

高速冷冻离心机

移液器(1-20ul,20-200ul,100-1000ul)

一次性耗材(吸头、离心管、手套、帽子等)

专用工作服、工作鞋、办公用品

4.3 检测区:

小型离心机

移液器(1-20ul,20-200ul)

荧光PCR检测仪

一次性耗材(吸头、离心管、手套、帽子等)

专用工作服、工作鞋、办公用品

建议使用离心管和吸头一览表

名称

规格

生产厂家

Cat.No.

吸头

10ul

美国AXYGEN公司

TF-300

200ul

TF-200

1000ul

TF-1000

离心管

0.5ml

MCT-060-C

1.5ml

美国QSP公司

509-GRD-SC

2.0ml

508-GRD

5、样本采集、存放及运输

5.1 用无菌注射针头采2ml静脉血于含有EDTA作为抗凝剂的无菌离心管中【不可用肝素抗凝】,室温放置不应超过4小时,室温1600g离心20分钟,分离血浆【切勿吸入红细胞】,转入无菌离心管中备用。

5.2 待测样本在2-8℃保存不应超过24小时;-20℃保存不超过三个月; -70℃以下长期保 存。应避免反复冻融。(最多冻融3次)。

5.3 采用冰壶或泡沫箱加冰密封进行运输。

6、适用仪器

Roche LightCycler,Roter-Gene 2000/3000,PE Gene Amp 5700,PE Gene Amp 7700,ABI-7000,ABI-7300,BIO-RAD iCycler,Line-GeneⅠ,Line-GeneⅡ,MJ OpticonⅠ,MJ Opticon Ⅱ等国内市场主流荧光PCR仪

7、扩增试剂准备(PCR前准备区)

7.1 从试剂盒中取出HIV RT-PCR反应液、RT-PCR酶、PCR Enhancer,在室温下融化并振荡混匀后,2,000rpm离心10sec。

7.2 设所需要的PCR反应管数为n(n=样本数+1管阴性对照+1管强阳性对照+1管临界阳性对照),每个测试反应体系配制如下表:

7.21 Roche LightCycler ,Roter-Gene2000/3000仪器,准备相应数量的毛细管

试 剂

RT-PCR反应液

RT-PCR酶

PCR Enhancer

用 量

9.55 ul

0.25 ul

0.2 ul

计算好各试剂的使用量,加入一适当体积离心管中,充分混合均匀,2000rpm离心10sec,向设定的n个Roche毛细管(LightCycler)中或普通PCR反应管(Roter-Gene2000/3000)中分别加入10ul,转移至样本处理区。

7.22 PE Gene Amp 5700,PE Gene Amp 7700,ABI-7000,ABI-7300,BIO-RAD iCycler,Line-GeneⅠ,Line-GeneⅡ,MJ OpticonⅠ,MJ Opticon Ⅱ等仪器,准备好相应的反应管

试 剂

RT-PCR反应液

RT-PCR酶

PCR Enhancer

用 量

34.1 ul

0.5 ul

0.4 ul

计算好各试剂的使用量,加入一适当体积离心管中,充分混合均匀,2000rpm离心10sec,向设定的n个PCR 反应管中分别加入35ul,转移至样本处理区。

8、样本处理(样本处理区)

所有试剂、样本使用前置室温解冻。

8.1 取n个0.5ml灭菌离心管(n = 样本数+1管强阳性对照+1管临界阳性对照+1管阴性对照),作好标记。

8.2 在上述每一个管中加入150ul裂解液,然后加入待测样本和阴性对照50ul,强阳性对照管和临界阳性对照管中先加入强阳性对照和临界阳性对照25ul,然后加入阴性对照管中的血浆25ul(切不可将二者混合后加入),用吸头反复吸打混匀(一份样本换用一个吸头);再加入50ul氯仿,混匀器上振荡混匀5sec或颠倒混匀15次(不宜过于强烈,以免产生乳化层)。

8.3 13,000rpm离心15min(如有条件,于4℃进行离心)。

8.4. 取与步骤2.1.中相同数量的0.5ml灭菌离心管,各加入100ul异丙醇和2ul RNasin,作好标记。吸取步骤2.3.各管中的上层液相转移至相应的管中(注意不要吸出中间层,该层富含DNA和蛋白质),颠倒混匀。

8.5. 13,000rpm离心15min,(注意固定离心管方向)。轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,沾干液体;加入300ul 75%乙醇,颠倒洗涤。

8.6 13,000rpm离心10min(注意固定离心管方向)。轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,尽量沾干液体。

8.7 4,000rpm离心5sec(注意固定离心管方向),将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量加样器尽量将其吸干(一份样本换用一个吸头,注意吸头不要碰到有沉淀一面),室温干燥1-5min(不宜过于干燥,以免RNA不溶)。

8.8 加入15ul DEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2,000rpm离心5sec,冰上保存备用(注意:此时的RNA最易受RNase降解,请在2小时内用于PCR扩增)。

9、 加样(样本处理区)

9.1 Roche仪器:在各设定的Roche毛细管中分别加入上述样本处理步骤2.8.中制备的RNA 溶液各15ul,盖紧管盖,连同Roche专用金属反应管套放入离心机中,于2,000rpm离心10sec。将毛细管排好放入Roche PCR荧光检测仪内,记录样本摆放顺序。

9.2 非Roche仪器:在各设定的PCR反应管中分别加入上述样本处理步骤1.9.中制备的 RNA溶液各15 ul,盖紧管盖,转移到检测区。将反应管排好放入荧光PCR检测仪内,记录样本摆放顺序。

10、 PCR扩增(检测区)

10.1 循环扩增条件

10.11 Roche Lightcycler

a) 42℃:30 min; 92℃:3 min;

b) 92℃:10 sec,52℃:20 sec(Temperature Transition Rate设为2℃/sec),72℃:30sec 5个循环;

c) 92℃:5 sec, 60℃:30 sec(Acquisition Mode为Single)40个循环,Analysis Mode为Quantification。

10.12 Roter-Gene2000/3000

a) 42℃:30 min;95℃:3 min;

b) 95℃:10 sec,55℃:30 sec,72℃:60sec 5个循环;

c) 95℃:5 sec,60℃:30 sec,40个循环;反应体系设为25ul。荧光信号收集设在60℃

10.13 PE Gene Amp5700,7700,ABI-7000,7300,Line-GeneⅠ,Ⅱ

a) 42℃:30 min;95℃:3 min;

b) 95℃:10 sec,55℃:30 sec,72℃:60sec 5个循环;

c) 95℃:5 sec,60℃:30 sec, 40个循环;反应体系设为50ul。

10.14 BIO-RAD iCycler

a) 42℃:30 min;95℃:3 min;

b) 95℃:10 sec,55℃:30 sec,72℃:60sec 5个循环;

c) 95℃:5 sec,60℃:30 sec, 42个循环;反应体系设为50ul

10.15 MJ OpticonⅠ,Ⅱ

a) 42℃:30 min;95℃:3 min;

b) 95℃:10 sec,55℃:30 sec,72℃:60sec 5个循环;

c) 95℃:5 sec,60℃:30 sec, 40个循环;反应体系设为50ul,荧光信号收集设在60℃

10.2 仪器检测通道选择

10.21 Roche Lightcycler

选择F1通道。

10.22 Roter-Gene2000/3000

Acquisiton选择Fam。

10.23 E Gene Amp 5700,7700,ABI-7000,7300

a) PE Gene Amp 5700是单通道荧光PCR检测仪,无需选择检测通道。

b) PE Gene Amp 7700, ABI-7000,7300 Reporter设为FAM,Quencher设为TAMRA。Passive Reference设为None(ABI-7000,7300)。

10.24 BIO-RAD iCycler

荧光素选择FAM-490。

10.25 Line-GeneⅠ,Ⅱ

选择F1通道,增益值批间有所不同,应按每批试剂建议值设定。(每一批试剂的增益值详见试剂盒中给定值)

10.26 J OpticonⅠ,Ⅱ

a) OpticonⅠ是单通道荧光PCR检测仪,无需选择荧光通道。

b) Opticon Ⅱ是双通道荧光检测仪,由于实验只需要单荧光,选择Single Color Experiment

11、结果分析条件设定

11.1 Roche Lightcycler

11.11 选择F1或F1/F2通道(建议选择F1通道),点击Quantification进入定量分析窗口。

11.12 在Quantification窗口中,设定Analysis 方式为Fit points,Adjustment 方式为 proportional.

11.13 选定Noise band项, 阈值(Noise band cursor)设定以刚好超过正常阴性对照品扩 增曲线(无规则的噪音线)的最高点,且Ct值不出现任何数值为准.

11.14 也可根据仪器的实际情况进行调整。

11.2 Roter-Gene2000/3000

阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,且Ct值无数值为准。

11.3 PE Gene Amp 5700,7700,ABI-7000,7300

11.31 PE Gene Amp 5700 结果分析时基线(baseline)的确定:取6—10或6—15个循环的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,且Ct值=40.0为准。

11.32 PE Gene Amp 7700,ABI-7000,7300结果分析时基线(baseline)的确定:取3—10或3—15个循环的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,且Ct值=40.0为准。

11.4 BIO-RAD iCycler

11.41 结果分析时基线(baseline)的确定,基线(baseline)取为2—10或2—15个循环的荧光信号,阈值(threshold) 设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,且Ct值=0.0为准。

11.42 也可根据仪器噪音情况在15.0—40.0之间调整。

11.5 Line-GeneⅠ,Ⅱ

11.51 点击数据分析进入结果分析界面。

11.52 选择样点拟合法进行结果分析:零点调整取1-10或1-15个循环的荧光信号;在噪声容限界面下调整基线位置,其设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增线(无规则的噪音线)的最高点为准。

11.53 选择定量分析,对样本进行结果分析。

11.6 MJ OpticonⅠ,Ⅱ

11.61 点击Quantitation进入结果分析窗口

11.62 在Option选项区域进行基线以及阈值线的调整。

11.63 取为2—10或2—15个循环的荧光信号,阈值(threshold) 设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,且Ct值显示为none为准。

11.64 也可根据仪器噪音情况在15.0—40.0之间调整。

11.65(在用PE5700/7700,ABI-7000,7300/BIO-RAD, OpticonⅠ,Ⅱ/ Line-GeneⅠ,Ⅱ iCycler荧光定量PCR检测仪进行分析的过程中,为避免漏检强阳性样本,应首先将基线定为6—10/3—10/2—10/1-10个循环的荧光信号观察分析Ct值,如果没有Ct值<16.0的样本,则将基线改定为6—15/3—15/2—15个循环的荧光信号进行结果分析;如有Ct值<16.0的样本,则应将该样本剔除此次结果分析,同时仍将基线改定为6—15/3—15/2—15/1-15个循环的荧光信号进行结果分析。)

12、质控标准

12.1 将校准品1—4的拷贝浓度输入,仪器将自动以校准品拷贝浓度的对数值为横坐标,以其实际测得的Ct值为纵坐标给出标准曲线。

12.2 标准曲线的拟和度应≤-0.980,否则视为定量结果无效。

12.3 阴性对照HIV RNA应为0.0copies/ml(Ct值一栏无数值显示);

12.4 强阳性对照Ct值≤25.0;

12.5 强阳性对照Ct值≤临界阳性对照Ct值≤30.0;

12.6 否则实验视为无效。所有实验从样本处理开始重做。

13、结果判断

13.1 检测样本中HIV RNA≥5.0×103copies/ml,报告相应的拷贝数。

13.2 检测样本中HIV RNA≥1.0×108copies/ml,可按实际测得值报告相应的拷贝数,亦可将该样本用正常人血浆按稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测定。

13.3 检测样本中5.0×102copies/ml<HIV RNA<5.0×103copies/ml,表明病毒载量较低,该拷贝数仅供参考,可报告相应的拷贝数,并应对此份标本谨慎跟踪。

13.4 检测样本中HIV RNA<5.0×102copies/ml,表明病毒载量较低,该拷贝数仅供参考,应一律报告为小于5.0×102copies/ml,并应对此份标本谨慎跟踪。

13.5 检测样本中HIV RNA为0.0copies/ml,报告为小于最低检出极限。

14、试剂盒性能

14.1检测限度

经采用CLB(荷兰血液传输中心实验室)HIV RNA monitor(Cat.No. S2039,标定HIV RNA载量为25,000 copies/ml)测试,灵敏度达到5.0×102copies/ml。

14.2 特异性

该试剂盒对HAV、HBV、HCV、HDV、TTV、CT、NG、HSV、HCMV、HPV、UU、TB标本以及献血员血浆标本均无非特异性扩增。

14.3 定量检测线性范围

本品的定量检测线性范围为5.0×103—1.0×108copies/ml

14.4 与国外同类试剂的相关性

14.41 在102—108copies/ml范围内,本品与COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test(Roche公司产品)检测的相关系数r=0.80,相关方程为log(PGcopies/ml)=1.01×log(ROCHEcopies/ml)-0.39。

14.42 与Nucli Sens HIV-1 QT assay(Organon公司产品,简称为NASBA方法)检测的相关系数r=0.92,相关方程为log(PGcopies/ml)=1.19×log(NASBAcopies/ml)-1.32。

15、试剂盒使用注意事项

15.1有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管理规范执行。

15.2实验室应按试剂配制区、样本处理区、扩增检测区分隔使用。工作流程:各区物品均为专用,不得交叉使用,避免污染。操作过程应工作服、帽、鞋、手套等穿戴齐全,避免各种试剂或样品与皮肤接触。一旦发生液体的泄漏,应立即用大量的水进行冲洗,如果与皮肤伤口发生接触,应及时通知当地卫生防疫部门。

15.3 本试剂盒不适用于肝素抗凝的血浆,因为肝素是公认的对PCR反应有抑制作用的物质。

15.4 反应液分装时应尽量避免产生气泡,并注意防止泄漏,以免荧光物质污染仪器。

15.5 实验中用过的吸头请直接打入盛有1%次氯酸钠的废物缸内,并与其他废弃物品一同在 指定的地点以指定的方式进行焚烧或毁弃。

15.6 实验结束后应立即清洁工作台,工作台及各种实验用品应定期用1%次氯酸钠、75%酒精 或紫外灯进行消毒。

15.7 所有的待检测样本均应视为传染性物质并严格按实验室生物安全要求进行操作和处 理。

15.8 试剂盒的阴性对照是采用合格试剂确认抗HIV-1/2,抗HCV,HBsAg均为阴性结果的人源血浆制备而成,强阳性对照和临界阳性对照以及内标等均为非感染性体外转录RNA,但使用过程中均应视为潜在的传染源并严格按实验室生物安全要求进行操作。

15.9 由于HIV为RNA病毒,操作过程中应特别注意防止RNase对RNA的降解作用,所有使用的 器皿、加样器等均为专用,离心管、吸头等一次性耗材在实验前应全部高压灭菌。

15.10 样本中血脂、胆红素、血红蛋白对本品无显著干扰。

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