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流式细胞技术的基本原理和临床应用
浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所 徐陈槐
流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理、化及生物学特性进行分析的方法。它集中了单克隆抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。利用流式细胞仪可以对细胞等生物粒子的理化及生物学特性(细胞大小、DNA 含量、细胞表面抗原表达等)进行定量、快速、客观、多参数相关的检测。流式细胞仪的基本原理是采用流体动力学聚焦以保证细胞按同一方式逐一通过激光束(检测区)。当样本流中的细胞经过流动室中的检测区时，椭圆形的激光束即可检测到细胞信号。包括细胞的散射光以及细胞上标有的荧光染料发出的激光。
一、流式细胞仪的基本结构：
流式细胞仪的流动室中有一长方形通道，加压的鞘液从通道底部进入流动室向上流动，检测区位于通道的中央。当鞘液在通道中流动时，样本流被射入鞘液中，鞘液包裹着样本，但并不与其混合。鞘液的压力将样本流聚焦，使其在流动室中逐一通过激光检测区。
根据激光束检查到的信号不同，将其分为前向散射光、侧向散射光及荧光。激光束上的低角度散射光被称为前向散射光(FS)，主要反映细胞的大小；与激光束成90度角收集的散射光信号称侧向散射光(SS)，主要反映细胞的颗粒特性。如SS可以区分淋巴细胞，单核细胞及粒细胞。除FS和SS外，细胞亦可发出荧光(FL)。根据所应用的试剂不同，这些荧光可以使仪器得到细胞的一些特征，如：FL可以用于确认分子，像表面抗原等。
二、光的收集：
前向检测器用来收集前向散射光，当有散射光到达前向检测器，即会产生电压信号。根据检测器收集到的光信号的不同，电压信号亦不相同。侧向散射光波长488nm，较荧光强。它是第一个从收集镜/空滤片装置中被分离出来的。应用488nm的二向色性长通滤片(488DL)在45度角时，使前向散射光偏转至SS检测器，同时又使波长较长的荧光通透过去。
一般流式细胞仪有两种荧光探测配置，三色为标准配置，第四色为可选配置。通过488nmDL的光在经过488nm的阻断滤片，阻断所有激光并通过荧光进行下一步分光。45度角放置的550DL，折射波长小于550nm的光至525BP(带通滤片)，于FL1探测器收集505~545nm的光谱，并使555~725nm的光通透。以此类推，第二个荧光采用600DL及575BP(收集560~590nm的光谱)。第三色荧光采用645DL及620BP(收集605~635nm的光谱)。645DL将650~725nm的光通透过去，于第四色荧光探测器(FL4)收集660~700nm的光谱。
三、信号产生：
经过PMT 将光学信号转变为电脉冲信号，并增加PMT 的电压及增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式有两种：线性放大(Lin)和对数放大(Log)，通常散射光信号用线性放大，荧光信号用对数放大。
流式细胞仪最多有6个检测器，每一细胞通过激光检测区时都会产生电压脉冲信号。电压脉冲信号反映相应的光强度，并被接收。流式细胞仪对这些脉冲信号进行放大、调节、整和及分析。
峰值信号是一个细胞通过激光检测区所产生的信号，脉冲的高度反映散射光及荧光的强度，脉冲的宽度反映荧光的分布。所以，总的荧光(强度及分布)实际是测量脉冲的面积。如下图显示三种总荧光相同但有不同荧光强度分布的细胞所产生的不同峰值信号脉冲。因为总荧光强度相同的三种细胞有不同的荧光分布，积分信号的高度表示总荧光强度，当细胞出现在检测区时即可测到。
四、颜色补偿(Color Compensation)：
颜色补偿是用电子的方法校正荧光染料光谱之间叠加所造成的误差，在完成双色以上的免疫荧光分析时都需要作颜色补偿。一种荧光染料不只发出一个波长，而是一定范围的波长。只是其中一部分较其他染料“亮”。带通滤片接收的
是一定带宽波长的荧光，故会有干扰光同时被接收，然后一同进入PMT 进行光电转换并放大。比如FL2(575BP)在接收RD1 的同时，亦接收了一部分FITC(干扰)，这部分干扰占FITC 总量的X%。故真正的FL2=实测RD1(FL2)-干扰的FITC(FL1)，即通常所说的：FL2-X%FL1。
五、免疫荧光分析：
细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体进行定量检测，成为临床检验的一项重要指标。流式免疫荧光技术不仅能将表达不同抗原位点的细胞群区分开来，而且还能进一步区分各细胞亚群。对于造血系统疾病、免疫功能障碍及恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评估都起了重要作用。
六、流式细胞术在免疫学中的应用：
1、淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞是正常机体免疫系统功能最重要的一大细胞群,在免疫应答过程中,末梢血淋巴细胞发育成为功能不同的亚群，各亚群的数量和功能发生异常时,就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化。FCM可以同时检测一种或几种淋巴细胞细胞表面抗原,将不同的淋巴细胞亚群数量的测定来监控病人的免疫状态,指导治疗。
2、感染及其治疗效果观察
由于T淋巴细胞在人体免疫系统中承担着重要的功能,因此当感染发生时,T淋巴细胞各亚群的变化往往能很敏感地反映感染的状态与程度。例如,细胞膜外CD4分子有HIV识别部位,因此CD4细胞是HIV病毒受体,AIDS病人CD4+T细胞明显减少,该指标是诊断AIDS的重要标志。当发生病毒感染时(如乙型肝炎,EB病毒和巨细胞病毒),CD8+T细胞增多,对CD8细胞的测定有助于对感染的诊断、治疗效果的动态观察。
利用流式细胞仪可对器官或骨髓移植术后病人进行监控，当病人CD3+、CD25+持续增加提示已经开始发生排异；CD4/CD8持续下降表明有感染发生,当其比值小于0.2时必须停用免疫抑制剂。
由于流式细胞仪是将静态的、显微镜下肉眼观察的细胞改为动态的、可计算机处理信号,因此在流式细胞仪上T细胞亚群统计方式已从传统的荧光显微镜下计数200个细胞成为几秒钟内计数上万个,因此结果更真实,更具有统计意义。
3、其他功能性疾病分析
流式细胞仪便捷、准确的特点可以用来对自身免疫性疾病进行检测与疗效观察，SLE病人的淋巴细胞变化可以反映该病的活动情况和器官侵犯程度，活动或非活动性SLE伴有多系统疾病，但无肾脏损害的病人可出现CD4/CD8比值升高,伴有严重肾脏损害的SLE病人可出现低CD4+,高CD8+的现象。
有证据表明外周血HLAB27的表达及其表达程度与强直性脊髓炎的发生有很大程度的相关性,利用流式细胞仪可以进行HLA-B27/HLA-B7双标记来检测HLA-B27阳性细胞,同时排除交叉反应。另外,CD23表达的增加与变态反应性疾病,自身免疫性疾病,肾病综合症有关,而且阳性率与病情严重程度呈正相关,治疗有效后CD23+细胞减少。
利用流式细胞仪检测PNH血细胞的细胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂(GPI)锚连接的蛋白如DAF(CD55)与MIRI(CD59)来确诊阵发性睡眠性血红蛋白尿传统的血清溶血试验具有更高的特异性与灵敏度。
七、流式细胞术在血小板功能评价方面的应用：
血小板膜糖蛋白(GP)是参与止血、血栓形成的重要分子基础,这些膜糖蛋白是一类重要的黏附分子。利用针对GP的单克隆抗体对血小板进行免疫荧光标记,并用FCM分析单个血小板或血小板亚群的GP是血小板膜糖蛋白检测分析方法的重大发展。方法简便、快速、标本用量少、灵敏度高、结果准确。与血小板有关的抗原的临床意义有:
1、诊断遗传性血小板功能缺陷疾病
巨血小板综合症(BSS)患者血小板CD42A/CD42B复合物先天缺陷，FCM中表现CD42A与CD42B不仅严重缺乏,而且其平均荧光强度显著低于阴性对照，CD61代偿性增加。
血小板无力症(GT)患者FCM表现血小板GPIIB、IIIA(CD41、CD61)明显缺乏，CD42A和CD42B基本正常或稍高，并可出现异常血小板亚群。
2、血栓性疾病和血栓前状态
由于活化血小板是血栓的主要成分之一，也是引起血栓形成的主要原因，所以血小板活化程度增高与疾病发生发展有关。CD62P和CD63是活化血小板最特异和灵敏的分子标志物，正常人血小板只有低水平活化，外周血CD62P只有3-5%。
有文献报导糖尿病伴有微血管病变，冠心病、高血压病、高血脂病、脑血栓形成、脑动脉硬化患者活化血小板百分率和绝对数显著高于正常人。而糖尿病无微血管病变，周围血管病以及深静脉血栓形成患者活化血小板水平与正常人无显著差异。PTCA后24小时发展成急性血管闭塞或高度再狭窄的患者CD62P和CD63增多，FCM可用于测PTCA后急性缺血再发作的危险性。
八、流式细胞术在白血病中的应用：
血液病多种为肿瘤性、免疫性和遗传性疾病，但恶性血液病约占一半以上。FCM在血液病的发病机制、诊断、分类、治疗和预后判断方面都有广阔的应用前景。
1、血病的分类研究
白血病分类是选择化疗方案和判断预后的重要依据，由于血细胞在其分化的不同阶段，承担不同功能时有不同的特征抗原表达，因此FCM结合单克隆抗体可以提高白血病分类诊断的附合率，根据白血病细胞所表达相关细胞的种系抗原，可将其分为B细胞系、T细胞系、髓细胞系、红细胞系和巨核细胞系，并可确诊白细胞的分类和分期，探明慢粒急变时的细胞来源。
2、残留病变检出(MRD)
MRD是白血病复发的主要根源，FCM其高特异性与敏感性可以在患者缓解期检测是否有残存病变细胞，早期探测MRD，以避免复发。
九、FCM在肿瘤学上的应用：
1、DNA含量测定及细胞周期分析
FCM在肿瘤学上的应用主要是利用DNA含量的测定进行包括癌前病变及早期癌变的检出，指导化疗以及预后评估等工作。
大量工作表明，癌前病变的癌变率与病变的增生程度相一致，而增生程度与DNA含量的异常改变又呈平行关系。FCM通过精确定量DNA含量，能对癌前病变的性质和趋势作出判断，有助于癌变的早期诊断。
DNA非整倍体的出现可能是恶变细胞的重要标志,目前病理学尚无法从癌前病变中发现癌变和即将癌变的细胞，而FCM检测DNA非整倍体细胞的出现可作为一个有价值的参数。
DNA倍体分析有助于临界性肿瘤的诊断，如卵巢的交界性肿瘤，异倍体的出现与病变的恶性发展有关。
细胞异常增殖和分化障碍是肿瘤细胞的特性，DNA含量不仅能非常敏感地反映细胞代谢的异常，而且能通过DNA倍体分析，细胞周期各时相的细胞比例分析并结合细胞抗原的表达多参数分析,全面了解细胞的生物学行为，从而帮助肿瘤的诊断、选择治疗方案和预后判断。
DNA异倍体，高S_PHASE细胞比值和高增殖细胞核抗原(PCNA)表达与细胞增殖能力，恶性程度和不良预后呈正相关。
2、为治疗方案和药理学研究提供依据
不同类型的肿瘤对化疗药物的敏感程度是不同的，可以利用FCM进行细胞周期分析，适当选用周期特异性药物或非周期特异性药物。
MDR是由多药耐药基因编的P糖蛋白(PGP)是亲脂化合物，包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性排出泵。从人淋巴细胞排出荧光染料与细胞内P-GP的含量直接相关，当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时，病人对化疗药物开始出现耐药性，需要考虑其他治疗方式。
十、活细胞内活性酶的检测：
据资料显示活细胞内活性酶的分析可以应用于许多医学领域，根据酶的活性可以鉴别不正常细胞。酶的活性也会因为受到药物的作用而会有所改变，因为酶的活动牵涉到细胞的新陈代谢，所以测量细胞内酶的活性能够提供许多细胞进展的讯息，包括活化、分化、凋亡、成熟、增殖等。传统上应用的测定细胞中酶活性的方法(如FLUOROMETRIC及COLORIMDTRIC_ASSAYS)，都是测定总体细胞的总酶活性而非测定单一细胞的酶活性。若要测定单一细胞的酶活性，通常都是涉及固定后的死细胞。近来COULTER公司推出最新的技术及试剂CELLPROBE_REAGENT，由于每一个特定的酶都有其专一的受质，而受质本身是由特别的化学品与荧光染料FLOURENSCEIN或RHODAMINENO共价结合的，能迅速进入活细胞，当其遇到特异性酶时，会被酶破坏其共价结构而释放其荧光染料，从而能够被FCM检测到。因此,活细胞酶探针能够用来测量单一活体细胞内酶的活性。
十一、凋亡细胞检测：
凋亡最初是作为形态学概念被提出来的，细胞有两种不同的死亡方式：即坏死(NECROSIS)和凋亡(APOPTOISI)。凋亡典型的形态特征是核染色质固缩并分离，细胞质浓缩，细胞膜和核膜皱曲，核断裂形成片断，最后形成数量不等的凋亡小体。利用FCM可以进行DNA断裂点标记检测，DNA片断可以从细胞内漏出，导致DNA含量减少，利用FCM进行DNA含量分析，通过二倍体细胞G0/G1期峰前的亚二倍体峰来确定。
在凋亡早期,一些与膜通透性改变及凋亡有关的蛋白在细胞膜表面有特定表达，例如FAS基因蛋白(CD95)，线粒体膜蛋白(AP027)，磷脂酰丝氨酸(ANNEXIN_V)。FCM结合单克隆抗体可以检测表达这些蛋白的细胞，从而确定细胞的凋亡情况。
十二、其它：
1、树突状细胞分析（Dendritic Cells,DC)
DC是一群抗原递呈细胞，同时又是重要的先天免疫细胞，还是具有免疫调控功能的一个细胞群，目前没有发现特异性的抗原标记。DC研究的主要内容包括直接分析计数和体外诱导检测,当前DC的检测需要一组抗体：包括CD80，CD83，CD86，CD40，CD11c，，CD123，HLA-DR等。
2、MHC-四聚体染色技术（TETRAMER）
抗原递呈细胞（APC）携带抗原片段通过与TCR复合物结合，在APC和T细胞的MHC相容和其它共刺激分子的相互作用下激活T细胞并产生细胞免疫效应。MHC-四聚体染色技术用于抗原特异性T细胞分析的原理在于体外模仿上述抗原递呈的过程来实现对特异性T细胞的鉴定，通过流式细胞仪这种高通量分析仪器对标本中这群细胞进行分析 。
四聚体技术可以对特异性免疫细胞进行定量；用流式细胞仪检测可以快速测定大量细胞，可以同时进行其它表面染色，可以直接用外周血测定而不需要培养；四聚体染色不会杀伤细胞，因此染色后的细胞可以进行分选或其它功能分析；四聚体对所有的特异性T细胞都能够结合，而不仅仅是对有功能的细胞进行检测。
自70年代流式细胞仪成型以来，历经30多年的发展，流式细胞仪应用意义越来越得以体现。尤其是1982年以后，随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，给流式细胞仪的应用发展提供了强大的推动力。在我国许多科研单位早在80年代就开始使用流式细胞仪作为其科研工具，进入90年代后，以库尔特原理及其相关血细胞分析产品闻名的美国库尔特公司以其在流式领域的研究，应用近二十年的积累，在其五代流式细胞仪的基础上推出了以单激光同时激发四色荧光的新一代临床型流式细胞仪，并为其配套了临床标本制备仪，使临床标本制备标准化、简单化，开创了流式应用的新领域。从而不少大中型医院也逐步引进流式细胞仪作为临床诊断的辅助工具。随着单抗技术、计算机技术及其它相关技术的不断发展，流式细胞仪将会在应用领域得到不断的开拓，成为科研与临床不可或缺的重要手段。
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