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红细胞抗体测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号：
200 年 月 日起实施
第1版
(共2页)
本规程每2年复审一次
复审日期： 年 月 日
复审人：
规程编写者：
审 批 者：
批准日期： 年 月 日
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
检验科 主任：
检验科 实验室：
红细胞膜蛋白结构测定
（红细胞抗体）
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方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特) |
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原理：
直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到全血中，与红细胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤(和固定)等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。 |
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标本采集与处理
受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。
采集部位 静脉采血
抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血
要求 1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3．溶血样本不能用。
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试剂
品牌 剂型 规格 贮存
联科
成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃
2：全血溶血试剂 液体
A：甲酸 液体 70ML 室温
B：碳酸钠等 液体 32ML 室温
C：多聚甲醛 液体 14ML 室温
3：鞘液 液体 20L 室温
4：清洗液 液体 5L 室温
5：荧光微球 液体 10ML 2-8℃
质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。 |
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仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra |
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操作：
1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)
2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血（1：200稀释后）。
3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟
4)上机测样 |
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报告结果
报告百分数 |
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操作性能
精密度 批内五次重复CV<2％
灵敏度 500—1000个荧光素分子 |
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参考值
IgA<2.78% IgG<2.98%
IgM<2.52% IgD<2.88% |
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临床意义
自身溶血性贫血的分型诊断 |
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方案（Protocol）
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粒细胞抗体测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号：
200 年 月 日起实施
第1版
(共2页)
本规程每2年复审一次
复审日期： 年 月 日
复审人：
规程编写者：
审 批 者：
批准日期： 年 月 日
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
检验科 主任：
检验科 实验室：
粒细胞抗体测定
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方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特) |
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原理：
直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经溶血处理后的样本中，与粒系胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析 |
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标本采集与处理
受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。
采集部位 静脉采血
抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血
要求 1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3． 样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。
4．溶血样本不能用。
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试剂
品牌 剂型 规格 贮存
联科
成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃
2：全血溶血试剂 液体
A：甲酸 液体 70ML 室温
B：碳酸钠等 液体 32ML 室温
C：多聚甲醛 液体 14ML 室温
3：鞘液 液体 20L 室温
4：清洗液 液体 5L 室温
5：荧光微球 液体 10ML 2-8℃
质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。 |
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仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra |
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操作：
1) 溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)
b. 使用COULTER Q—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）
2)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)
2)分别向试管中加入经溶血处理得样本100u1。
3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟，洗涤离心
4)上机测样 |
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报告结果
报告百分数 |
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操作性能
精密度 批内五次重复CV<2％
灵敏度 500—1000个荧光素分子 |
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参考值
IgA<2.68% IgG<2.66%
IgM<2.49% IgD<3.4% |
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临床意义
白细胞减少症的分型诊断，大多数白细胞减少症患者抗体为阳性 |
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方案（Protocol）
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白血病免疫分型测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号：
200 年 月 日起实施
第1版
(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期： 年 月 日
复审人：
规程编写者：
审 批 者：
批准日期： 年 月 日
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
检验科 主任：
检验科 实验室：
白血病免疫分型测定
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方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特) |
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原理：
三色直接免疫荧光法。正常血细胞的分化成熟过程中，细胞膜、细胞浆有抗原的表达与血细胞的分化发育阶段密切相关，因此这些抗原的表达与否可作为鉴别细胞和其分化阶段的基础。利用荧光素标记的单克隆抗体对血液或骨髓进行染色，通过FCM对白血病细胞细胞膜和细胞浆抗原进行分析，由此了解所测白血病细胞的系列属性及其分化程度。三色染色在白血病免疫分型中较为常用。根据分型需要，选择相应抗原的标记抗体，一般FITC标记抗体和PE标记抗体搭配为一组，再加PC5标记抗原CD45单克隆抗体，共三种抗体加入一管 |
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标本采集与处理
受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，腰穿采骨髓。
采集部位 腰穿采骨髓
抗凝剂 肝素抗凝
要求 1．样本量至少3ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本或已固定的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。
4．溶血样本不能用。 |
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试剂
品牌 剂型 规格 贮存
贝克曼库尔特
成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃
2：全血溶血试剂 液体
A：甲酸 液体 70ML 室温
B：碳酸钠等 液体 32ML 室温
C：多聚甲醛 液体 14ML 室温
3：IntraPrep Permeabilization Reagent
成分1（固定剂） 液体 5ml 室温
成分2（透膜剂） 液体 5ml 室温
4：鞘液 液体 20L 室温
5：清洗液 液体 5L 室温
6：荧光微球 液体 10ML 2-8℃
质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。 |
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仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra |
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操作-样本制备：
细胞膜表面抗原
1．首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。
2．首先每管中加入5ul CD45-PC5抗体。
3．然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul(注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配)
4．各管中加入标本(骨髓或外周血)30～100u1(根据细胞的多少决定)，振荡混匀，室温避光20～30分钟。
5．溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)
b. 使用COULTER Q—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）
细胞浆和核抗原
1．准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。
2．首先每管中加入标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定)，5ulCD45-PC5抗体。室温避光20分钟。
3．每管中加入固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。
4．各管中加入PBS4ml。
5．300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。(1500r/min*5min)
6．各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。
7．加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。
8．各管中加入4mlPBS，振荡混匀。
9．300g离心5分钟后，弃去上清液。
10．各管中加入PBS500ul，振荡混匀。
11．上机测样 |
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报告结果
报告百分数 |
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操作性能
精密度 批内五次重复CV<2％
灵敏度 500—1000个荧光素分子 |
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参考值
CD34+<5% MPO+<5%
粒系<20% 淋系<30% |
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临床意义
用于血液病的诊断和分型诊断 |
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方案（Protocol）
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T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号：
200 年 月 日起实施
第1版
(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期： 年 月 日
复审人：
规程编写者：
审 批 者：
批准日期： 年 月 日
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
检验科 主任：
检验科 实验室：
T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测
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方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特) |
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原理：
直接免疫荧光法。肝素钠抗凝全血在PMA，Ionomycin和Monensin存在下短期培养(辅助性T细胞通过细胞因子IFN-γ、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子，且迅速分泌到细胞外。因此，利用刺激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞，然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外，使细胞因子在细胞内滞留到一定的量)，然后进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色，使用流式细胞仪对CD4+细胞内的IFN-γ和IL-4进行测定。 |
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标本采集与处理
受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。
采集部位 静脉采血
抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血
要求 1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。
4．溶血样本不能用。 |
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试剂
淋巴细胞培养体系(自配)
成分：刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。
选白美国SIGMA公司。
单克隆抗体
CD4—PC5、IL-4-PE、IFN-γ-FITC选自美国BeckmanCoulter公司。
质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。 |
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仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra |
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操作：
细胞培养与染色
取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMIl640洗涤一次，将细胞加入培养体系中，5％C02 37℃孵育18小时，取出后以PBS洗一次。用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。将细胞分成两管，其一为测定管加入抗人IL-4-PE和IFN-γ-FITC，另一管加入同型对照，室温避光20分钟，PBS洗涤一次，待测。
流式细胞仪测定
打开流式细胞仪及氩激光光源(488nm)预热20min，同时仪器自动初始化；用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测50000以上细胞，在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-γ-FITC的表达。
●淋巴细胞在FS／SSC散点图中位置，即A门内细胞；
●A门内CD4阳性细胞，即B门内细胞；
●B门内TH细胞亚群分布：
1区数值---Th 1细胞 (%)
4区数值---Th 2细胞 (%)
2区数值---Th 0细胞 (%) |
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报告结果
报告百分数 |
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操作性能
精密度 批内五次重复CV<2％
灵敏度 500—1000个荧光素分子 |
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正常参考值
Thl(IFN-γ)：17.39±5.52% Th2(IL-4)：1.50±0.44%
ThO ：0.51±0.26% |
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临床意义
淋巴细胞均分泌多种细胞因子：Thl细胞主要分泌IL-2，IL-12，IFN-γ和TNF-b／a等，Th2细胞主要分泌IL-4．IL-5．IL-6，IFN-γ为Thl最特异分泌的细胞因子，IL-4为Th2最特异分泌的细胞因子，所以可根据分泌的细胞因子来区分Thl与Th2。Thl为IFN-γ+，Th2为IL-4+。静息状态(人的正常生理状态、即未受到任何刺激下Th0分化为Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中仅含有极少量的Thl和Th2细胞，这时我们所能检测的胞内的IFN-γ和IL-4也微乎其微。当Th细胞受到外界因素，如刺激素、病原体等刺激，其中Th0即会向Thl或Th2大量分化，此时我们检测到的IFN-γ和IL-4也较多。本实验的检测实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。 |
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方案（Protocol）
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细胞周期检测
1.细胞制备和染色:
--收获细胞并PBS洗涤,10*4-6个,染色过程之前要经过100-300目滤网过滤,离心弃上清待用;
--使用BECKMAN COULTER DNA-PREP 试剂盒(LPR:打孔\固定\溶血; DNA STAIN: PI,RNAase):上述细胞内加入LPR 100 ul,室温避光20 MIN,再加入DNA STAIN 1000 ul,室温避光20 MIN,上机检测.
--使用酒精固定和PI: 上述细胞内加入70%预冷酒精,4 C过夜; 离心弃上清后加入PI工作液室温避光30MIN.
2.从PROTOCOL中找出DNA CONTENTS | 
