[转发]PCR 实验室污染的排除

粱志东
(柳州市人民医院，广西柳州545001)
[关键词]PCR；污染；HBV
[中图分类号]R446．6 [文献标识码]B [文章编号]1671-5098《2006)07-1141-02

PCR技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，该技术通过重复高温变性、低温退火、中温延伸等简单的3个温度循环，能将靶DNA扩增数百万倍，获得极高的检测敏感性。但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的结果凹]。如果形成气溶胶污染而扩散，则可引起整个PCR实验室的污染，处理起来非常麻烦，严重的甚至要关闭PCR实验室。我实验室也曾经遭遇过气溶胶的污染，所幸的是经过一段时间的处理，最终将PCR实验室污染排除掉了。现将经过向大家报告如下。

1 实验室情况
1．1 实验室设置 实验室分为试剂准备区、标本制备区、扩增区三个区，试剂存放在试剂准备区，标本是在标本制备区处理，处理完的标本置于扩增区上机扩增。
1．2 使用试剂试剂是由中山大学达安基因股分有限公司提供的乙型肝炎病毒(HBV)荧光定量PCR试剂。
1．3 操作人员 均经过卫生部临检中心或区临检中心理论和操作培切I并通过考试取得合格证。

2 污染的发现
2004年8月12日，我实验室按正常的操作规程检测HBV-DNA标本，同时设立了阴性对照和阳性对照(均为试剂盒中配备)，扩增结束分析结果时，发现HBV DNA所有的标本及阴、阳性对照均为阳性，提示操作过程中出现污染，但具体是什么原因引起的污染还不清楚。

3 污染源的追踪
出现污染后，我们首先考虑可能是试剂的污染，更换新批号的HBV试剂重新检测后，结果仍 为全部标本阳性。
将HBV标本拿到其他正规的PCR实验室检测，结果标本中阴、阳性结果都有，阴性对照是阴性，阳性对照是阳性，说明标本没有被污染将两种批号的HBV试剂拿到其他正规的PCR实验室检测，也显示试剂没有问题。
我实验室用消毒液擦拭工作台面后，打开所有的紫外灯照射一天，将所使用微量进样器、离心管、枪头、手套、记号笔、记录本等都更换掉，再将HBV标本进行检测，结果全部标本仍然为阳性。
用消毒液擦拭工作台面后，打开所有的紫外灯照射一天，将HBV标本重新检测，同时设置了两个阴性对照(A和B)，A 阴性对照为将试剂的反应管从试剂盒中拿 ，打开反应管的盖子，在空气中暴露10 min，盖上盖子，上机检测；B阴性对照为将试剂的反应管从试剂盒中拿 ，不开盖子，直接上机检测。结果是全部标本和A阴性对照为阳性，而B阴性对照为阴性。
至此，虽然还查找不到污染源是什么，但有一点可以肯定，PCR实验室污染是气溶胶扩散而引起的 后来经过调查，发现污染是南于我实验窒新来了一个清洁工人，没有经过培训就直接上岗，在打扫实验室卫生时，用扩增区的扫笤和拖把打扫了标本制备区的卫生引起。

4 污染的排除
在确定了污染的原因后。我们就开始着手排除污染，每天都打开整个PCR 实验室的门窗和排气扇，让整个实验室通风，用消毒液擦拭整个PCR实验室，打开所有的紫外灯照射。
每隔3 d按3．5步骤检测一次，一直这样处理了一个多月，A阴性对照才转为阴性。连续检测三次A和B阴性对照，每次结果都均为阴性，才确定PCR实验室恢复正常。

5 体会
通常我们对PCR实验室污染的预防是采取隔离不同操作区、分装试剂、改进实验操作等规则，对污染的处理是用稀盐酸擦拭或浸泡；紫外线照射法等 ]。而对于实验室的通风方面没有给予足够的重视，为了防止实验区间之间的相互污染，各个实验区间都是尽可能的密闭，从而使得实验室出现PCR产物残留污染的几率增大。从本次PCR实验室污染排除的过程来看．我觉得污染得以排除的一个关键是通风。适当的给予实验室通风，可起到空气稀释的作用，有利于PCR产物残留量的减少，加快实验室污染的排除。现将我们PCR实验室的经验教训报告给大家，是想引起各位同行对实验室通风给予足够的重视，不要再有我们的情况发生。
参考文献：

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[2] KwoK s。Higuchi R．Avoiding false positives with PCR[J]．Na—tare，1989，339(2)t223 238．
[3] 林万明．扬瑞馥。黄尚志。等．PCR技术操作和应用指南[M]．第l版．北京：人民军医出版社，l993：28 3O．

* 作者简介：梁志东(1971一)，男，广西柳州人，1992年毕业于右江民族医学院，主管技师。