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MicroScan®快速酵母菌鉴定检测板程序手册

快速酵母菌鉴定模板操作指南

预期用途：

快速酵母菌鉴定板用于临床样本中分离酵母菌或酵母菌类物质。

概述与原理：

我们传统使用产色与修饰实验从临床样本中分离酵母菌。快速酵母菌鉴定板是一种采用了27个脱水底物，由96个用于微稀释的小格组成的板。（表1-1）酵母菌溶于蒸馏水中形成浓混悬液，为底物再水化之用。模板在35-37摄氏度温度下孵育4小时，就能得到鉴定结果。

注意点：

1． 快速酵母菌鉴定板仅用于体外诊断。

2． 肽酶、氢氧化钠试剂或任何鉴定底物都不能接触眼睛，皮肤或衣物。

3． 务必遵守无菌技术，须意识到经孵育过的板含有潜在的致病微生物，整个操作过程中有预防受到微生物伤害的措施。

4． 所有材料再丢弃前须经高压灭菌。

储藏：

板与肽酶试剂需存放于2-8摄氏度环境中。

样本采集与准备：

参照美国临床微生物学协会微生物操作指南或其他推荐的真菌学参考操作指南来运输和隔离酵母菌。快速产色试验有赖于未知生物体中存在相关的反应酶。因此，采用不同平板培养基不同的酶上会产生不同的试验结果。快速酵母菌鉴定板使用萨布罗葡萄糖琼脂（ ）。培养基上存在的抗生素不是关键的变数，不会影响实验结果。然而，含血的培养基，从琼脂提取麦蚜得到的提取物培养基和抑制霉菌的培养基不应采用。

提供的材料：

快速酵母菌鉴定板，工作表，操作指南，质控图表

未提供的材料：

接种物液体，0.05当量的氢氧化钠，肽酶，酵母浓度标准，有盖托盘，MICROSCAN酵母生物类型编码册，接种环，萨布罗葡萄糖琼脂，搅拌混合器，50微升带头的移液管，孵育器（35-37摄氏度）不含CO₂

操作过程：

A：模板准备：

1． 从储藏处拿出所需测试板，如果测试板中没有干燥剂或干燥包有破损，外包装袋完整性受损（未密封，刺破了，已撕破）则不能使用。

2． 打开包装，取出测试板，马上除去包在测试板上的箔囊，打开测试板之后,对测试板水合之前，必须使测试板温度达到室温，且测试板应盖上干净的托盘。

B接种物准备：

1． 把一种有生长活性的生物体接种至快速酵母菌鉴定板，(如果该生物体能生长充分，可以使用经隔离的萨布罗葡萄糖琼脂平板孵育出的克隆物)，如果有必要，可以把酵母菌次代培养物隔离至移至萨布罗葡萄糖琼脂平板孵育，直至生物体充分生长，以备用。推荐使用30摄氏度孵育48小时或25摄氏度（室温）孵育48-72小时。注意：培养物在30摄氏度孵育超过48小时只有当需要额外孵育以获得充分生长时才采用。

2． 用无菌拭子或接种环，从琼脂平板上移取生长物，在30毫升的接种物液体（一个放置于13*84毫米或13*100毫米的试管中的经高压灭菌，消除电离作用的液体）中乳化，形成悬浊液。每一种悬浮液必须同MICR0SCAN酵母浊度标准相比较。作比较时应在充分的光线下，把接种物悬浮液同酵母浊度标准比较，把两个试管用带有黑线的白色卡片比较。注意：一定要保证移取生物体时不混有培养基。

3． 混合或搅拌悬浮液直至液体均质。一些酵母菌属在水中不易分散。如果搅拌不能形成均一悬浮液，那么静置悬浮液10-15分钟后再搅拌。如果悬浮液仍含有团块，那么让团块沉入试管底部后取上清液接种至酵母菌测试板，上清液的浊度必须与MICROSCAN酵母菌浊度标准匹配。如果仍不成功，移取更多接种物液体，重复上述过程。

C模板接种：

1． 将样本模板编号

2． 每个含底物的小格加50微升酵母菌悬液，包括调节小格BNAC和NPC，不推荐使用巴氏移液管接种。注意：如果测试板在WALKAWAY或AUTOSCAN下读取，则LOC小格也应接种.

D孵育：

1． 把测试板3-5个为一组盖上托盘，防止液体蒸发。

2． 接种好的测试板在35-37摄氏度不含CO₂的孵育器中孵育4小时。

E读取测试板：

1． 在读取测试板前至少等待30分钟，从冰箱中取出肽酶试剂，肽酶试剂在4摄氏度时为结晶状态，但在室温时会溶解。不要把肽酶试剂暴露于过高的温度下溶解，因为高温会使试剂降解。

2． 使用白色背景下的反射光读取测试板。

3． 4小时的孵育后在合适的小格内加入肽酶与NAOH。

a加1滴肽酶试剂至BNAR，HPR，ILE，PRO，TYR，GLY，GGLY，GLAR，GAPR，AARG，LYAL，ALA，STY，和HIS小格，留出30秒使反应物充分显色，再记录结果。但必须在3分钟以内。ANY整个小格的溶液或小格任何一部分的溶液呈现粉红色和红色较暗的色彩，应定性为阳性。颜色须同BNAC小格相对比得出，一些小格呈现比BNAC小格更暗的橘黄色，这些应定性为阴性。只有当溶液中出现粉红色或红色时，才定性为阳性。小格内的颜色会随着时间延长而加深，暗黄色会变成暗橘黄色，这些定性为阴性。注意：如果把肽酶加入BNAC小格应该出现黄色，如果出现粉红色或红色，这种肽酶不能使用。

b加1滴0.05当量MAOH至AGL2，BDF，AGAL，NPC，NAG，CELL和NGAL小格，记录结果前至少等5秒钟，但不能超过5分钟。把含底物的小格同NPC小格比较，任何淡黄色的部分应定性为阳性。注意：小格内会出现比NPC小格更淡的色彩，定性为阴性。但黄色必须出现这是阳性反应。

4． 提供两个调节小格辅助判断反应。A BNAC=B-奈基胺调节。在加入肽酶试剂后，这些小格会变成黄色。B NPC=硝基苯调节。这些小格应无色。

5． 参照结果有助于解释生化问题。注意：WALKAWAY并不主张使用试剂读取小格，首先是防止由于托盘盖下试剂生成烟雾造成视觉差异引起结果改变，因此生化反应不能手工检验。

质量控制：

鉴定底物的合格性应该通过测试生物体的已知反应得出。推荐的MICROSCAN的调节生物体的每一个相应反应结果可以在测试板的包装盒中的质量控制图表中找到。

鉴定反应的原理：

氨基酸B-奈基胺底物（HPR，ILE，PRO，TYR，GLY，GGLY，GLAR，AARG，LYAL，ALA，ATY，HIS）当底物通过适当的酶水解（通常是氨基酸芳基胺酶），奈基胺就被释放出来。B-奈基胺通过加入二甲胂氨基桂皮醛（存在于肽酶试剂中），两者形成一种复合物，使颜色由粉红变为紫色。注意：粘着氨基酸B-奈基胺的酶是一种氨基酸氨基酸芳基胺酶。氨基酸肽酶经常用作芳基胺酶的同义词，但实际上两者表现出不同的特征。（氨基酸肽酶粘着与肽的氨基酸的N氨基端）。芳基胺酶与氨基酸肽酶可以水解相同的氨基酸B-奈基胺底物。因此，测试板不能检测不同的反应酶。一个简单的芳基胺酶可以水解数个氨基酸B-奈基胺。碳水化合物（SUC1，SUC2，TRE）-蔗糖和海藻糖的使用导致PH值下降，引起氯苯基红从紫色变为红色。这些碳水化合物反应是可选择的，可以不符合传统的反应方式。硝基苯底物（AGL1，BGL，BGAL，AGL2，BDF，AGAL，NAG，CELL，NGAL）-如果存在合适的酶，底物就能粘着被释放出来的正位或邻位硝基苯。在碱性pH环境中，这些化合物呈现黄色，如果在酸性环境中反应，必须在孵育后读取结果之前加入NAOH。加入NAOH之前，小格内既可能呈现无色现象，也可能为灰黄色。吲哚酚磷酸盐（IDX）吲哚酚磷酸盐通过磷酸盐酶释放吲哚酚，吲哚酚与氧结合形成靛蓝，这是一种不溶的兰色或灰兰色沉淀物。尿素（URE）：