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MicroScan® HNID鉴定板程序手册

HNID鉴定板程序手册

预期应用

HNID系统是为快速鉴定和检测萘瑟菌属、嗜血杆菌属、黏膜布兰汉氏球菌属、阴道GARDNERELLA中 –半乳糖产物而设计的。对流感性嗜血杆菌和副流感性嗜血杆菌的生物型也有作用。

原则

改良的传统和染色实验用于鉴定需复杂营养的革兰氏阴性球菌和杆菌。实验生物的3MCFARLAND混悬液是由特别的接种培养基制成的。HNID鉴定板再水化并从培养基上接种后培养4小时。培养后pH变化和某种底物的利用或其他生化反应可以解释鉴定结果。快速酸滴定法用来检测 –半乳糖酶。

预防

HNID鉴定板和试剂只用于体外诊断。不要让肽酶试剂或HNID吲哚试剂接触眼睛、皮肤或衣物。注意无菌技术和预防微生物危害要贯穿整个过程。特别要注意接种板是否含潜在的致病微生物。

储藏

储藏在2-8℃下，用HNID接种培养基再水化后如果有任何底物出现阳性反应则丢弃鉴定板。请参阅阳性颜色反应的生化解释表。

样品的采集和准备

样品应根据临床微生物手册中的实验室程序在原始分离媒质中采集和放置。

过程

提供的材料

HNID鉴定板

操作手册

HNID生物型密码本

工作表单

未提供的材料

HNID接种培养基

肽酶试剂

盖盘

矿物油，60ML

矿物油，250ML只用于WALKAWAY系统的仪器（WALKAWAY仪器有升级的自动化油叠特征）

0．5%N，N-二甲基- -萘胺

HNID吲哚试剂

0．8%磺胺酸

50 L带无菌吸头的吸管

无菌木制药签或无菌接种环

3MCFARLAND硫酸钡标准混悬液

4MCFARLAND硫酸钡标准混悬液

搅拌器

质量控制微生物

黏膜布兰汉氏球菌

阴道GARDNERELLA

流感嗜血杆菌

副流感嗜血杆菌

萘瑟菌内酰胺

黏膜萘瑟菌

STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA

35-37℃无二氧化碳培养箱

操作概要

A鉴定板准备

从冰箱中取出鉴定板立即除去铂纸包装。如果干燥剂缺失、受损或包装的完整性被破坏（未密闭，被刺破或撕裂）则鉴定板不能使用。让鉴定板和HNID接种培养基在使用前达到室温。鉴定板可以堆放在干净的盖盘下。

B微生物准备用无菌药签或无菌接种环从18-24小时原始分离平板（血、巧克力、GV或马丁盘式琼脂）取充足的形态相似的菌落到HNID接种培养液，使其相当于3MCFARLAND硫酸钡标准混悬液。对于萘瑟菌属，最好相当于4MCFARLAND硫酸钡标准混悬液。在接种到鉴定板之前搅拌接种培养液。不要用低于3MCFARLAND标准混悬液的溶液来接种任何HNID鉴定板。

C接种

取50μl（0.05ml）接种培养液到标记过的HNID鉴定板小孔。应用带无菌吸头的50μl吸管。每个鉴定板都接种好后MICROSCAN推荐次配养1滴多出的接种培养液到合适的媒质用于纯度校验。

注意：用自动扫描4号和WALKAWAY系统LOC小孔也必须再水化。

D生化油物覆盖

用一支滴管滴2-3滴矿油以使其覆盖尿素小孔。小孔中的媒质应完全覆盖但不要溢出小孔。

注意：WALKAWAY系统的仪器（WALKAWAY仪器有升级的自动化油叠特征）自动为尿素小孔加油。

E培养

将接种鉴定板在35-37℃的无二氧化碳培养箱中培养4小时，将4-5个鉴定板为一组堆放与盖盘下以避免水分蒸发。

F用VISUAL或TOUCHSCAN来解读鉴定板

1．在35-37℃下培养4小时后不需要加试剂（IDX……BL）的实验应先解读。

2．加试剂如下所述：

A）PRO，NGL，ZAR

加一滴肽酶试剂到PRO，NGL，ZAR小孔中等3-5分钟让颜色反应进行。

B）NO3，NO2

加一滴0.8%磺胺酸和一滴0.5%N，N-二甲基- -萘胺到NO₃，NO₂小孔。让变色反应进行3-5分钟。

C）IND

加1-2滴HNID吲哚试剂到IND小孔颜色会立即变化。

3．根据生化解释表来解释反应，并把结果记录在提供的工作表单上，或者将阳性反应放入VIA/TOUCHSCAN解读机。

G用自动扫描4号来解读鉴定板

1．在35-37℃培养4小时后，在加试剂前先将矿物油覆盖GLU，……BL。

2．加试剂如下所述：

A）PRO，NGL，ZAR

加一滴肽酶试剂到PRO，NGL，ZAR，让颜色反应进行3-5分钟。

B）NO₃，NO₂

加一滴0.8%磺胺酸和一滴0.5%N，N-二甲基-α-萘胺到NO₃，NO₂小孔。让变色反应进行3-5分钟。

C）IND

加1-2滴HNID吲哚试剂到IND小孔颜色会立即变化。

3．每个反应在进行了相应的时间后，将鉴定板插入自动扫描4号解读。

H WALKAWAY系统的鉴定板解读

1．在培养4小时后，那些不需要添加试剂（IND……BL）的先解读。

2．WALKAWAY在以下底物中加入相应的试剂：PRO，……IND。这些反应稍后解读。

注意：WALKAWAY不需要试剂来解读小孔最重要是为，因此避免因为试剂烟雾积聚与盖盘下所造成的错误结果，因此生化反应不能用手工核对。

质量控制

培养的纯度应由接种混悬液到合适的琼脂媒质进行次培养来核对。如果检测出混合培养那结果是有缺陷的。鉴定媒质的可接受性可由下列反应核对。（表2）

反应

吲哚酚磷酸酶-碱性磷酸酶裂解吲哚酚磷酸盐成为游离的吲哚酚，其含氧分子可以形成不可溶的蓝色复合物。

硝酸盐-生物体降解硝酸盐到亚硝酸盐的能力可通过加入磺胺酸和N，N二甲基-α-萘胺使其产生亚硝酸盐而变为红色而检测出。

亚硝酸盐-生物体降解亚硝酸盐到游离氮气的能力可通过加入磺胺酸和N，N二甲基-α-萘胺来检测出。如果是阴性反应由于有亚硝酸盐的存在所以溶液是红色的，如果颜色不变化，那亚硝酸盐已降解，实验是阳性的。

碳水化合物的利用-利用特别的碳水化合物导致了随后pH值的下降形成酸，可由酚红指示剂测出。

-牛乳糖酶- -牛乳糖酶水解O-硝苯基- -D-吡喃半乳糖释放黄色的O-硝苯基。

-葡(萄)糖苷酶- -葡(萄)糖苷酶水解P-硝苯基- -D-葡萄糖释放黄色的O-硝苯基。

尿素-尿素酶分解尿素形成氨造成pH值上升，可由酚红指示剂测出。

ORNOTHINE-它的脱碳作用导致媒质的碱化，可由pH指示剂溴百里酚蓝测出。

吲哚-色氨酸的新陈代谢导致了吲哚的形成，可由加入HNID吲哚试剂检测出。如果存在吲哚，则会形成红色的环。

肽酶-生物体产生特定肽酶的能力是由裂解相应的氨基酸联接形成-萘胺而决定的。游离的 –萘胺通过与P-DIMETHYIAMINOCINNAMALDEHYDE 结合产生红色到洋红色而检测出。

-内酰胺酶-青霉素钾被 -内酰胺酶降解为青霉素酸。PH值下降可由酚红指示剂测出。

生物体的鉴定

MICROSCAN HNID生物型密码本用于鉴定未知实验微生物。这本密码本从MICROSCAN HNID鉴定板实验的信息汇编的实验数据库中形成。

生物型密码本提供的17例实验的电脑分析以鉴定未知微生物。这些实验转化为6字节的生物型数字，来完成密码本的生物鉴定列表和其他相关可能性。请参阅HNID生物型密码本中关于形成生物型数字的过程。当只有一个微生物列入生物型密码本的时候，其他相关可能性是99.9%。如果一种特定的生物型数字可能对应多于一种生物体，所有可能性以降序排列，累积达99.9%。当一种生物型数字在密码本中找不到时，我们建议以新鲜的培养物重新进行实验。如果重新实验得到同样的结果。致电MICROSCAN生物型服务部或技术服务部（美国或加拿大：800-677-7226，北美以外：916-372-1900）

操作限制

1．当一种生物型数字对应多于一种生物体时，为正确鉴定需要做补充实验。以其他标准如X和V因子和耐氧性同样要进行实验。

2．只有嗜血杆菌属、萘瑟菌属、黏膜布兰汉氏球菌属、阴道GARDNERELLA可用于实验，不要把这些产物用于其他球杆菌微生物。

3．实验结果的解释需要经专门训练的临床人员，他要运用判断力，知识和证实的实验来接受微生物鉴定的结果。

4．生物型数字不应用于同一病人不同样本分离株的表型鉴定。

5．NCCLS指南M7-A3，VOL，13，NO，25推荐用ROCEFINBASED -内酰胺酶实验来检测黏膜布兰汉氏球菌属。

6．嗜血杆菌的生物型分组与血清并无相关性如流感嗜血杆菌2并不决定于B型血清型。

期望值

每次实验或每种生物的实验预期值请参阅HNID阳性反应百分率表格。

表1

底物

吲哚酚磷酸盐

硝酸盐

亚硝酸盐

葡萄糖

蔗糖

麦芽糖

果糖

乳糖

O-硝苯基- -D-半乳糖苷

尿素

ORNITHINE

吲哚

L-脯胺酰基- -萘胺

N- -L-谷胺酰- -萘胺

N- -苯酰-DL-精氨酸- -萘胺

P-硝苯基- -D-配糖物

淀粉

- 内酰胺酶（青霉素）

美国典型培养协会

表2

质量控制表

萘瑟菌 流感嗜血杆菌 PARAPHROPHILUS 黏膜布兰汉氏球菌属

1．黏膜萘瑟菌可能得到阳性结果。

2．STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA可能得到阳性结果。

3．阴道GARDNERELLA可能得到阳性结果。

表3

生化解释表

小孔 阳性 阴性 注意

蓝色到灰色沉淀物 澄清

粉色，红色到洋红 澄清到黄色 3-5分钟记录结果

澄清到黄色 粉色，红色到洋红 3-5分钟记录结果

橘色到黄色 红色到红/橘色 任何红色都记为阴性

黄色到黄/橘色 红色到橘色 任何黄色都记为阳性

黄色 红色到黄/橘色

黄色 澄清 淡黄为阳性，在作为阴性控制标本加入试剂前用吲哚孔

红色到洋红 黄色到淡粉色

绿色到蓝色 黄色到黄/绿色 任何黄色应记为阴性

红色环 黄色 任何红色应记为阳性

红色到洋红 黄色到橘色 3-5分钟记录结果，暗色指示ZAR反应较弱

黄色 澄清 任何黄色记为阳性在作为阴性控制标本加入试剂前用吲哚孔

黄色到黄/橘色 红色到橘色 任何黄色应考虑为阳性

用自动扫描4号WALKAWAY系统鉴定板联盟

表4

可能性表格

HNID阳性反应百分率

流感嗜血杆菌1

流感嗜血杆菌2

流感嗜血杆菌3

流感嗜血杆菌4

流感嗜血杆菌5

流感嗜血杆菌V1-1

流感嗜血杆菌V1-2

副流感嗜血杆菌1

副流感嗜血杆菌2

副流感嗜血杆菌3

副流感嗜血杆菌4

APHROPHILUS/PARAAPHROPHILUS

溶血性嗜血杆菌

淋病萘瑟菌

脑膜炎萘瑟菌

LACTAMICA萘瑟菌

黏膜萘瑟菌

萘瑟菌属

黏膜布兰汉氏球菌属

阴道GARDNERELLA

在这张表中的阳性结果解释并不是实际的百分数但代表了公共数据库和MICROSCAN的实验结果。

预期反应已由九种评价表明

评价 意义

1 阳性反应非常少

5 阳性反应少

10 阳性反应不多

25 多数反应阴性

50 阳性或阴性反应

75 多数反应阳性

90 阴性反应不多

95 阴性反应少

99 阴性反应非常少

流感嗜血杆菌V1-1是以BERHOFER分类的生物型，流感嗜血杆菌V1-2是以KILIAN分类的生物型