[转发]DADE BEHRING干性革兰氏阴性细菌检测程序手册

DADE BEHRING

MicroScan®干性革兰氏阴性细菌检测程序手册

准备使用的用户

为了MicroScan®干性革兰氏阴性菌最低抑菌浓度（MIC）/复合（Combo）接种板和干性革兰氏阴性菌阈值复合接种板的使用。

MicroScan®接种板为检测抗微生物剂的敏感度和（或）鉴别需氧型革兰氏阴性细菌和兼性厌氧型革兰氏阴性细菌的种类而设计的。

概要和原理

抗生素敏感性试验是一个微型化的干性液体培养基稀释敏感性试验。在滴加钙离子和镁离子的Muller-Hinton液体培养基中，多种抗生素稀释到具有临床意义的范围。阈值复合接种板所用的浓度相当于已明确的NCCLs的阈值浓度。甲氧苄氨嘧啶、磺胺甲基异唑和甲氧苄氨嘧啶／磺胺甲基异恶唑培养基含有胸苷磷酸化酶降低溶液中的胸苷浓度。将标准微生物悬浮液接种和复水化后，在35℃下培养至少16小时，通过观察抑制微生物生长的最低抗生素浓度，确定被检测微生物的最低抑菌浓度（MIC）。改良的常规试验和产色试验用于鉴别发酵型和非发酵型革兰氏阴性细菌。鉴别的基础是依靠检测pH的变化、底物的利用和细菌在抗生素存在的条件下经35℃培养16-42小时后的生长状况。含有浓度为1μg/ml的cefpodoxime、头孢噻甲羧肟、噻肟单酰胺霉素、头孢噻肟或头孢三嗪噻肟的接种板可被用于筛选疑有产生广谱β-内酰胺酶（ESBL）的埃希大肠杆菌、产酸克雷伯菌或肺炎克雷伯菌。

注意事项

1． 仅用于体外诊断。

2． 在整个操作过程中，遵守无菌技术和已经建立针对有关微生物危险的注意事项，尤其注意的是接种板含有潜在性的致病微生物。

3． 所有材料在处理之前应高压灭菌。

贮存

MicroScan®干性接种板贮存在2-30℃。

产品损坏

产品存放在非推荐的贮存环境可能导致抗微生物剂失效和生化试剂失色。不要使用过期的产品。

标本收集和准备

按照临床微生物学手册推荐的操作程序，收集、转运标本，并将标本放置于基础分离培养液中。

程序

提供的试剂

参看包装接种板特殊内容物的盒子标签

所需要的但未提供的材料

0.5 McFarland硫酸钡混浊标准液

0.5% N,N-甲基-α-萘氨，30ml（B1010-45A）或250ml（B1015-45）

0.8%对氨基苯磺酸，30ml（B1010-44A）或250ml（B1015-44）

0.85% 高压灭菌生理盐水，3ml

10μl或100μl一次性无菌吸头的吸移管仪或10μl 测量环

10%三氯化铁，30ml（B1010-48A）或250ml（B1015-48）

40%氢氧化钾，30ml（B1010-43A）或250ml（B1015-43）

5%α-萘酚，10ml（B1010-42）或30ml（B1010-42A）

心脑浸液（BHI）培养基，0.5ml（B1010-30A）或4ml

覆盖盘（B1010-56B）

一般实验室设备

Ｄ－接种仪器（B1013-4）

接种水，3ml（B1015-2）

带有PLURONIC®商标的接种水，25ml（B1015-7）

Kovac’s试剂，30ml（B1010-41A）或250ml（B1015-41）

手册报告表，最低抑菌浓度（MIC）（B1014-92）或阈值（B1014-47）

微量稀释观测仪（B1010-6）

MicroScan®革兰氏阴性细菌生物编码手册（B1010-66D）

矿物油，60ml（B1010-40）

矿物油，250ml－仅用于WalkAway®系统／仪器和WalkAway®S覆盖物（B1010-40A）

氧化酶试剂

人工接种板记录表（仅用于人工阅读结果的记录）

Prompt^TM接种系统（B1026-10D）

质量控制微生物（参看本手册目录编号的质量控制部分）

质量控制报告表

Reagent Dropper 试剂盒（B1013-12A）

RENOK®水化器／接种器（B1018-14）或同类仪器

封条（B1010-51）

浊度测量计（B1018-66）

Vortex 震荡器

WalkAway®系统条形码标签（B1011-16）

WalkAway®盘盖（B1011-18）

程序操作概要

A. 接种板的准备

1. 从贮存处取出接种板。如有下列任何一种情况发生，不要使用接种板：

a. 干燥剂缺少或破损

b. 接种孔的颜色消失（如DCB孔或多种抗生素孔）

c. 包装受损（拆封、刺破或撕裂）

2. 打开包装袋，取出接种板。如果贮存在冰箱中，立即从锡箔包装袋中取出。接种板在复水前应平衡到室温。干净的覆盖盘可放在接种板上面。所有打开的接种板应在当天利用，否则丢斥。

B. 接种物品的准备

（注意：参看操作程序局限性的第9和10项）

NCCLs推荐通过菌落计数定期检测接种菌落的浓度。参照NCCLs资料M7-A４。预期结果大约为3-7×10⁵CFU/ml。

1. 标准比浊技术－基本接种方法

推荐使用标准比浊技术直接接种所有的需氧型革兰氏阴性细菌。

a. 在培养18-24小时的非抑制型琼脂接种盘上，利用无菌的木制接种棒或细菌接种环在菌落表面涂抹外形相似的4-5个大的或5-10个小的菌落。

b. 接种在3ml的接种水（高压灭菌的蒸馏水）中。最终的混浊度相当于0.5McFarland硫酸钡标准液的。盖紧塞子。

c. 震荡悬浮液2-3秒。

d. 吸取0.1ml（100μl）标准悬浮液放入25ml PLURONIC®接种水。旋紧盖子，倒置8-10次混合。

２．快速系统（Prompt Systrm）

　　快速系统可用于接种革兰氏阴性菌。为了正确应用快速系统，请参看快速接种操作程序手册。

３．对数期技术

　　对数期技术是指将细菌生长的悬浮液稀释至相当于浊度为0.5McFarland的硫酸钡标准液。本技术推荐用于生长相对缓慢的细菌或延迟到达的标本。

a. 在非抑制型琼脂接种盘上，利用消毒的木制接种棒或细菌接种环从培养18-24小时的的菌落表面涂抹外形相似的4-5个大的或5-10个小的单孔菌落。

b. 接种在4ml的BHI培养基，并在35℃下培养2-4小时。这就是所称谓的细菌悬浮液的对数期。

c. 培养后，在接种前反复震荡悬浮液2-3秒。

d. 利用BHI培养基将对数期悬浮液稀释到混浊度相当于0.5McFarland硫酸钡标准液。

e. 吸取0.1ml（100μl）标准悬浮液放入25ml PLURONIC®接种水。旋紧盖子，倒置8-10次以便混合。

　　　４．静止期技术

　　静止期技术可用于生长快速的革兰氏阴性细菌

a. 在非抑制型琼脂接种盘上，利用消毒的木制接种棒或细菌接种环从培养18-24小时的菌落表面涂抹外形相似的4-5个大的或5-10个小的单孔菌落。

b. 接种在0.5ml的BHI培养基。旋紧塞子。

c. 震荡悬浮液2-3秒。

d. 旋松试管塞子，在35℃下培养4-6小时

e. 培养后，在接种前反复震荡悬浮液2-3秒。

f. 如果培养后培养基混浊，吸取0.1ml（100μl）标准悬浮液放入25ml PLURONIC®接种水。旋紧盖子，倒置8-10次以便混合。

Ｃ.氧化酶试验

在接种接种板之前，作氧化酶试验。在记录表的适当位置或按照说明记录结果。推荐的氧化酶试剂是四甲基－p－次苯基联胺－二氢氯化物。

D.接种板水化／接种

利用带有D－接种器的RENOK®系统进行水化和接种。参照RENOK®操作手册进行。如果采用其它系统，用115±10μl接种水（PLURONIC）水化。接种孔的最终细菌浓度应达到3-7×10⁶CFU/ml。为确保被检测细菌的活度和纯度，准备一个盛放血琼脂的纯净接种皿，将接种物在上面划痕，并培养16-20小时。如果两种或以上类型的菌落生长，则重新分离菌落和测试。

E.生化试剂覆盖

1. 利用滴瓶，用三滴矿物油覆盖葡萄糖、尿素、硫化氢、赖氨酸和DCB。（这些接种孔在接种板中有底画线）。

2. 接种孔中的培养液必须完全被矿物油覆盖，但不要溢出接种孔。

注意：WalkAway®系统／仪器（并且WalkAway®仪器已升级到矿物油自动覆盖的特性）自动将矿物油覆盖到适当的接种孔。

F.封条

仅用于氧化酶阳性的微生物。将封条覆盖在CIT、MAL、ONPG、TAR、ACE、CET、OG/G、OF/B和DCB孔。封条中的四分之一英寸的定位孔应当与DCB孔排成一行。对WalkAway®系统，盖子取代封条。

G.培养

1. 确保在培养过程中温度分布均匀，将接种板迭放成3-5组。

2. 为了防止蒸发，将干净的覆盖盘放在每组接种板的表面。覆盖盘可以反复利用。不要用酒精消毒覆盖盘。可用肥皂去污，用水冲洗，空气风干。

3. 接种板在不含二氧化碳的培养箱中培养至少16小时。

H．阅读接种板

　利用MicroScan®微量观察仪人工阅读接种板，并将结果记录在人工接种板记录表上或MicroScan®观察测量仪器上（touchSCAN®-SR、autoSCAN®-4、WalkAway®-系统）。参照合适的操作手册，运用MicroScan®观察测量仪阅读接种板。

标准的指示板

对照孔清亮；生长孔呈大纽扣状。

列１和列２呈典型的生长纽扣状；

列２表示生长孔中有“跳跃孔”，这应当被忽视。

列３中单独有一孔呈纽扣状，其上、下孔清亮，表明有斑点污染，应当被忽视。

列１中的MIC=2μg/ml（最低浓度的清亮孔）

列２中的MIC=>16μg/ml（所有孔有细菌生长）

列３中的MIC=≤0.12μg/ml（所有孔没有细菌生长）

列４中的MIC=2μg/ml（痕迹效应发生在2-8孔；甲氧苄胺嘧啶／磺胺甲基异恶唑（T/S）典型的痕迹效应）

列５中的MIC=≤0.12μg/ml（所有孔发生痕迹效应，这样MIC是≤。这是典型的抗生素／微生物联合）

列６中的MIC=≤0.12μg/ml

1. 培养16-20小时后，从培养箱中取出接种板。

2. 用祛除棉花的薄纸将接种板底部存在的任何凝露或碎片擦掉。

3. 仅在生长孔发生混浊时，阅读接种板。如果对照孔混浊或者生长孔没有生长，不要阅读抗生素孔。抗生素孔细菌生长时出现浑浊，表现为整孔呈雾状、孔中央呈白色纽扣状或整孔呈细颗粒状生长。细菌生长不足或不生长表现为孔呈轻微白色状或培养液清亮。

4. 如果人工阅读结果，将结果记录在适当的记录表上。

5. 阅读抗生素的敏感性

a. 在黑色（间接灯光）背景下，阅读抗生素孔和十六烷三甲基溴化胺（CET）孔。

b. 如下记录敏感性和断点结果：

1) 最低抑菌浓度（MIC）结果

a) 培养16-20小时后，当最后孔开始在抗生素的最高浓度下表现为细菌生长受到抑制时，记录MIC。

b) 在抗生素的所有浓度下发生细菌生长时， MIC记录为大于（>）最高浓度。

c) 在抗生素的任何一种浓度下不发生细菌生长时， MIC记录为小于或等于最低浓度。

d) 在一系列生长孔中发现某孔清亮，如在1、2和8μg/ml生长但在4μg/ml不生长，将此孔称为跳跃孔，应当被忽略。

2) 阈值结果

a) 培养16-20小时后，在抗生素孔无细菌生长，记录为“Ｓ”（敏感）。

b) 细菌在低浓度孔生长但在高浓度孔不生长，记录为“Ｉ”（中度敏感）。

c) 细菌在抗生素的两种浓度或任何一种稀释浓度的孔上生长，记录为“Ｒ”（耐药）。

d) 细菌如果在高浓度孔生长而在低浓度孔不生长，该孔可能被污染，应当重新试验。

3) 细菌在单一孔发生斑点生长，表明有污染，应当重新试验。

4) “痕迹效应”可发生在某些药物和微生物联合试验中，如变形杆菌与呋肟头孢菌素和lmipenem（lmp）、沙雷氏菌与lmipenem（lmp）、大肠杆菌与磺胺甲基异恶唑（Sx）。痕迹效应也可发生在甲氧苄胺嘧啶／磺胺甲基异恶唑（T/S）、甲氧苄胺嘧啶（T）、磺胺甲基异恶唑（S）被用于RENOK®复水／接种系统，这是由于接种浓度所致。在与生长孔比较时，出现如下状况，端点应当被认为最低浓度：

a) 生长大约减少80%（T/S，T，Sx）

b) 直径小于2mm的白色纽扣状，或

c) 半透明的白色纽扣状。

6. 阅读鉴别底物

a. 除了十六烷三甲基溴化胺和抗生素用于鉴别底物（青霉素、卡那霉素、粘菌素、头孢菌素、呋喃旦啶、妥布霉素）在黑色（间接光照）背景下阅读外，其它所有鉴别底物在白色背景下阅读。

b. 葡萄糖发酵菌－　培养16-24小时后，如果葡萄糖呈强黄色，这种细菌是一种葡萄糖发酵菌，并且应当阅读24种葡萄糖发酵菌试验。如果葡萄糖反应呈橙色或红色，这种微生物葡萄糖非发酵菌。有些非发酵菌种类可产生金黄色，应当视为阴性。有些变形杆菌如在覆盖矿物油后在含有葡萄糖孔中并不生长，但可发酵蔗糖（SUC）和（或）山梨糖醇（SOR）。如果葡萄糖孔不生长并且蔗糖和（或）山梨糖醇反应阳性，应当视为是葡萄糖发酵菌。

c. 葡萄糖非发酵菌－葡萄糖非发酵菌在培养16-24小时后可被阅读，如果下列任何一个联合试验呈阳性：（１）精氨酸与氧化－发酵／葡萄糖（OF/G）或者精氨酸与十六烷三甲基溴化胺，（２）赖氨酸，或（３）鸟氨酸。如果所有这些反应呈阴性并且在生长孔发生生长，记录被用于鉴别底物的最低抑菌浓度（MIC）、十六烷三甲基溴化胺和抗生素。在作最后阅读和鉴别底物时，应再培养24小时。

d. 再培养后，如果微生物仍不发生反应，检查确保微生物在含有酚红的碳水化合物已经生长（尤其是，如果在Mueller-Hinton生长控制培养基生长差或不生长）。如果在含有酚红的碳水化合物中不生长，应当怀疑是生长条件苛刻的微生物如嗜盐弧菌或耶尔森氏鼠疫杆菌，这些细菌在25℃生长最好。或者是变形杆菌／放线杆菌。革兰氏染色应当重复进行，确定是革兰氏阴性菌。

如果怀疑是嗜盐弧菌，将几个菌落接种在3ml 0.85%无菌生理盐水中。最终混浊度应相当于0.5 McFarland硫酸钡浑浊标准液。利用RENOK®系统用25ml未接种过的PLURONIC接种水对接种板复水。用无菌转移管滴加一滴（40-50μl）生理盐水悬浮液到每个鉴别底物孔包括生长孔、黏菌素、头孢菌素孔。接种板在35℃培养16-24小时。

e. 在阅读前，滴加如下试剂：

1) 在福格斯－普罗斯考尔试验（VP）孔滴加一滴40%氢氧化钾，然后再滴加一滴5%萘酚。至少20分钟后，等待VP 反应。

2) 滴加一滴10%三氯化铁到色氨酸脱氨酶（TDA）孔 。立即发生颜色变化。

3) 滴加３滴MicroScan®Kovac’s试剂到吲哚（IND）孔。立即发生颜色变化。

4) 对所有质量控制（QC）和临床非发酵菌孔，滴加一滴0.8%对氨基苯磺酸，然后再滴加一滴0.5% N,N-甲基-α-萘氨到硝酸盐（NIT）孔。至少５分钟后，观察硝酸盐发生反应。

f. 参看结果部分中的生化解释部分。

质量控制

鉴别底物培养液和抗生素的合格性应当用具有普遍公认反应和MIC范围的试验微生物进行检测。推荐的American Type Culture Collection（ATCC）质量控制微生物的结果已在下表列出。

质量控制表是一个综合性表，包括MicroScan®干性接种板的所有稀释浓度的范围。依据接种板的类型，可能需要从QC表中推断出。下面是推断的例子：

质量控制微生物	缩写	质控表的端点	接种板稀释度	推断出的质控范围
大肠杆菌ATCC 25922	Ak	≤2-8	2，8，32	≤2-8
大肠杆菌ATCC 25922	A/S	-1/0.5-4/2	8/4-16/8	≤8/4
铜绿假单胞菌ATCC 27853	Te	8,128	1-8	8->8
铜绿假单胞菌ATCC 27853	Tim	≤8-32	16,64	≤16,64

干性革兰氏阴性菌质量控制表

抗微生物剂	缩写	大肠杆菌 ATCC25922 B1010-20A MIC范围　　　　断点范围		铜绿假单胞菌 ATCC 27853 B1010-21A MIC范围　　　　断点范围
阿米卡星 阿莫西林 氨苄西林 氨苄西林／舒巴坦 Azlocillin	Ak Aug Am A/S Az	≤2-8 2/1-8/4 2-8 ≤1/0,5-4/2 ≤64	≤16 ≤8/4 ≤8 ≤8/4 ---	≤2-8 >32/16 >128 >32/16 ≤64	≤16 >16/8 >16 >16/8 --
氨曲南	Azt	≤1	≤8	2-8	≤8
羧苄西林	Cb	≤16	≤16	≤16-64	≤16->32
羧苄西林-Pseudomonas	Cb-P	--	≤128	--	≤128
头孢克罗	Cfr	≤2-8	--	>16	--
头孢孟多	Cfm	≤4	≤8	>32	>16
头孢唑啉	Cfz	≤2-4	≤8	>16	>16
Cefdinir	Cdn	≤1	≤1	N/A	N/A
头孢吡肟	Cpe	≤2	≤8	≤2-4	≤8
头孢克肟	Cfe	≤0.25-1	--	>2	--
头孢尼西	Cfc	≤2	≤8	>16	>16
头孢呱酮	Cfp	≤4	≤16	≤4-8	≤16
头孢噻肟	Cft	≤2	≤8	8-32	≤8,32
头孢替坦	Ctn	≤4	≤16	>32	>32
头孢西丁	Cfx	≤2-4	≤8	>16	>16
头孢泊肟	Cpd	≤0.5-1	≤2	>4	>4
头孢他啶	Caz	≤1	≤8	≤1-4	≤8
头孢唑肟	Cz	≤2	≤8	16->32	32->32
头孢曲松	Cax	≤2	≤8	8-648	≤8,32->328
头孢呋辛	Crm	≤2-8	≤4-8	>16	>16
头孢噻吩	Cf	4-16	≤8-16	>64	>16
氯霉素	C	≤2-8	≤8	>16	>16
Cinoxacin	Cn	≤16	≤16	>32	>16
环丙沙星	Cp	≤0.25	≤1	≤0.25-1	≤1
Gatiflozacin	Gat	≤0.5	≤2	≤0.5-29	≤29
庆大霉素	Gm	≤0.5-2	≤4	1-4	≤4
亚胺培南	Lmp	≤0.5	≤4	1-4	≤4
左旋氟沙星	Lvx	≤0.5	≤2	≤0.5-4	≤2-4
Lomefloxacin	Lmf	≤1	≤2	≤1-4	≤2-4
Loracarbef	Lor	≤2	≤8	>16	》16
Meropenem	Mer	≤1	≤4	≤1	≤4
美洛西林	Mz	≤8	≤16	≤8-32	≤16，64
莫西氟沙星	Mxf	≤0.5	≤2	1->49	≤2->49
Nalidixic Acid	Na	≤16	≤16	>16	>16
奈替米星	Nt	≤2	≤8	≤2-8	≤8
呋喃妥因	Fd	≤32	≤32	>64	>64
诺氟沙星	Nxn	≤2	≤4	≤2-4	≤4
氧氟沙星	Ofl	≤0.5	≤2	1-4	≤2-4
呱拉西林	Pi	≤8	≤16	≤8	≤16
呱拉西林/Tazobactams	P/T	≤8	≤16	≤8	≤16
Sparfloxacin	Sfx	≤0.25	--	0.5-2	--
磺胺甲恶唑	Sx	≤256	≤256	N/A	N/A
四环素	Te	≤0.5-2	≤4	8,128	8->8
替卡西林	Ti	≤8	≤16	≤8-32	≤16,64
替卡西林/克拉维酸6	Tim	≤8	≤16	≤8-32	≤16,64
甲氧苄啶	T	≤8	≤8	>8	≤8
妥布霉素	To	≤0.5-2	≤4	≤0.5-1	≤4
甲氧苄啶/磺胺甲恶唑	T/s	≤0.5/9.5	≤0.5/9.5	8/152->8/152	8/152->8/152
Trovafloxacin	Tva	≤0.5	≤2	≤0.5-2	≤2

1.范围=预期值（μg/ml）

2.有些抗生素的范围与表３NCCLs资料M7-A4中列出的NCCLs容可的质量控制范围并不一致。

3. 4/2-16/8的附加端点可从大肠杆菌ATCC35218(B1013-65)得到。

4. 8/4-32/16 的附加端点可从大肠杆菌ATCC35218(B1013-65)得到。

5. ≤8的附加端点可从大肠杆菌ATCC35218(B1013-65)得到。

6. ≤8-16的附加端点可从大肠杆菌ATCC35218(B1013-65)得到。

7.程序报告错误NCCLsM100-S9，当筛选疑有ESBL产生者时，肺炎克雷伯菌（ATCC700603）的预期范围>1μg/ml。预期范围的内在证实悬而未决。

＊MicroScan® Kovac’s试剂是专门为MicroScan®仪器设计的。如果人工阅读接种板，仅需一滴试剂。

＊＊American Type Culture Collection,Manassas,

干性革兰氏阴性菌质量控制鉴别底物培养液

	埃希大肠杆菌ATCC25922 B1010-20A	铜绿假单胞菌 ATCC27853 B1010-21A	产酸克雷伯菌 ATCC49131 B1010-24A	普通变形杆菌 ATCC49132 B1010-25A
葡萄糖	+	-	+	+
蔗糖	-	-	+	+
山梨醇糖	V	-	+	-
棉子糖	-	-	+	-
鼠李糖	+	-	+	-
阿拉伯糖	+	-	+	-
肌醇	-	-	+	-
核糖	-	-	+	-
密二糖	V	-	+	-
尿素3	-	V	V	V
硫化氢	-	-	-	+
吲哚	+	-	+	+
赖氨酸	+	-	+	-
精氨酸	-	+	-	-
鸟氨酸	+	-	-	-
色氨酸脱氨酶	-	-	-	+
七叶灵	-	-	+	V
VP	-	-4	+	V
柠檬酸	-	+	+	V
丙二酸	-	+	+	-
半乳糖苷酶	+	-	+	-
酒石酸3.5	-	V	V	V
乙酰胺	-	+2	-	V
十六烷三甲基溴化胺	-	+	-	-
氧化发酵／葡萄糖3	+	V	+	+
氧化发酵／碱	蓝绿-绿	蓝绿	蓝绿-绿	蓝绿-绿
青霉素3	+	+	+	V
硝酸盐3	+	V	+	+
DCB	黄	灰	黄	黄
粘菌素	-	-	-	+
呋喃旦啶	-	+	-	N/A
头孢菌素3	V	+	V	V
卡那霉素3	V	+	V	N/A
妥布霉素3	-	-	-	N/A

1. ONPGAmerican Type Culture Collection,Manassas,VA,USA 2. 需培养48小时 3. 当每种生化试剂需要时，参看关于附加阳性或阴性反应的干性革兰氏阴性菌附加试验表， 4. 铜绿假单孢菌ATCC 27853在培养18小时后，VP反应呈淡粉红色，应当解释为阴性。 5. 如果接种板培养超过18小时，大肠杆菌ATCC25922可出现弱阳性反应。 Ｎ／Ａ代表不适应 注意：质量控制微生物被选作对所有鉴别底物提供阳性／阴性反应。作为结果，微生物的鉴别底物可以不同于质量控制表所规定的底物。产品操作的合格性应当通过试验结果的比较而不是通过底物而确定。

干性革兰氏阴性菌附加试验表

微生物	底物	预期结果
P . stuartii ATCC49809(B1013-67)	尿素	+
P. putida ATCC 49128(B1013-42A)	酒石酸 硝酸盐 卡那霉素	+ - -
S. (P.) purtrefaciens ATCC 49138 (B1013-34A)	氧化－发酵／葡萄糖	-
E .faecalis ATCC 29212 (B1010-22A)	青霉素	-
S aureus ATCC 29213 (B1010-23B)	头孢菌素	-
J.(A) picketin ATCC 49129(B1010-21B)	妥布霉素	+

结果

A. 生化结果

1. 生化解释

孔　　　　　　　　　试剂		阳性　　　　　　　　阴性
葡萄糖		强黄色　　　　　　　橙色到红色 有些非发酵可产生金黄色，应当视为阴性
蔗糖、棉子糖、鼠李糖、阿拉伯糖、肌醇、核糖、蜜二糖		黄色到黄色／橙色	橙色到红色
尿素		紫红色到粉红色　　　黄色、橙色或淡粉红色
硫化氢		黑色沉淀或黑色纽扣状	不变黑
吲哚　滴三滴（或一滴，只要接种板清楚地阅读）MicroScan® Kovac’s试剂。立即发生颜色变化。		粉红色到红色　　　　淡黄色到橙色 Providencia sp可产生淡粉红色环，应当视为阳性。
将赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸与DCB比较。DCB孔必须覆盖矿物油后，下列结果才有效。对非发酵菌而言，阳性结果必须是较基础对照组的紫色强。如果基础对照组是紫色，基础培养液已经碱化，赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸应当记录为阴性。无色菌类和人类有色菌将会发生这种情况。
赖氨酸 精氨酸 鸟氨酸		发酵菌 紫色到灰色　　　　　　　　　黄色 非发酵菌 紫色　　　　　　　　无色到灰色
色氨酸脱氨酶	加一滴10%三氯化铁，立即发生颜色变化	棕黄色	黄色到橙色
七叶灵水解		淡棕黄色到黑色	淡棕色到无色
VP	加一滴40%氢氧化钾，然后再加一滴5%α－萘酚。20分钟后，观察反应结果。	红色　　　　　　　　无色 有些非发酵菌在培养18小时后可能发生淡粉红色，应当视为阴性。
半乳糖苷酶		黄色　　　　　　　　无色 将外观清亮的半乳糖苷酶孔与十六烷三甲基溴化胺孔比较。如果半乳糖苷酶孔呈黄色，应当记录为阳性。
柠檬酸、丙二醇、酒石酸、乙酰胺		兰色到兰绿　　　　　绿色到黄色 任何深浅的兰色应当记录为阳性
十六烷三甲基溴化胺		生长　　　　　　　　不生长
氧化－发酵／葡萄糖	注意：与氧化－发酵／碱（OF base）对照比较。 如果OF base绿色， 如果兰色或兰色－绿色	黄色　　　　　　　　绿色到兰色 黄色到绿色　　　　　兰色
硝酸盐　　滴加一滴0.8%对氨基苯磺酸，然后再滴加一滴0.5% N,N-甲基-α-萘氨		红色	无色到淡粉红色
青霉素、卡那霉素、粘菌素、头孢菌素、呋喃旦啶、妥布霉素		生长（耐药）	不生长（敏感）
LOC　仅用于autoSCAN®－４和WalkAway®系统接种板的识别

２。鉴别反应的原理

葡萄糖发酵（葡萄糖GLU、蔗糖SUC、山梨醇糖SOR、棉子糖RAF、鼠李糖RHA、阿拉伯糖ARA、肌醇INO、核糖ADO、密二糖MEL）：特种碳水化合物发酵后产酸，培养液中pH下降，用酚红指示剂可检测出。

尿素（URE）：尿素酶将尿素分解产生氨，导致培养液中pH上升，用酚红指示剂可检测出。

硫化氢（H₂S）：硫化氢气体来自硫代硫酸钠，与培养液中的三价铁离子反应，产生黑色沉淀。

吲哚（IND）:吲哚来自色氨酸代谢产物，滴加Kovac’s试剂后能够被检测出。如果吲哚存在，颜色变红。

赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸（LYS、ARG、ORN）：这些氨基酸经过脱羧后，碱性胺形成，可被溴甲酚紫红指示剂检测出。

色氨酸脱氨酶（TDA）：细菌能够将色氨酸脱氨基，产生吲哚丙酮酸，与培养液中的柠檬酸铁胺反应。在培养液中，滴加氯化铁后产生棕色。

七叶灵水解（ESC）：七叶灵水解后，培养液中的柠檬酸铁胺与水解产物发生反应，生成黑色沉淀。

VP：3-羟基丁酮从丙酮酸钠产生而来。滴加40%氢氧化钾然后5%α－萘酚后，颜色变红。

半乳糖苷酶（ONPG）：β-半乳糖苷酶水解邻位硝基苯－β-D－吡喃半乳糖苷键，释放黄色的邻位硝基酚。

柠檬酸、丙二醇、酒石酸、乙酰胺（CIT、MAL、ACE、TAR）：利用这些底物作为代谢的唯一碳源，导致pH升高，可被溴百里酚蓝指示剂检测出。

氧化－发酵（OF/G）：葡萄糖氧化后导致酸形成，pH降低，可被溴百里酚蓝指示剂检测出。将OF/G与OF/B（base）比较，确定是否有酸产生。

硝酸盐（NIT）：微生物将硝酸盐还原为亚硝酸盐。滴加对氨基苯黄酸然后滴加N,N-二甲基-α-萘氨，若亚硝酸盐存在，变成红色。

十六烷三甲基溴化胺（CET）：对十六烷三甲基溴化胺耐药表明Mueller-Hinton培养基中滴加十六烷三甲基溴化胺。

青霉素、卡那霉素、粘菌素、头孢菌素、呋喃旦啶、妥布霉素（P₄、K₄、Cl₄、Cf₈、Fd₆₄、To₄）：对这些抗生素的特定浓度耐药通过细菌生长得到阐明。

3.微生物的鉴别

MicroScan®需氧型革兰氏阴性细菌生物编码手册用来鉴别未知的检测细菌。编码手册包括两部分：需氧型革兰氏阴性细菌－葡萄糖发酵菌和需氧型革兰氏阴性细菌－葡萄糖非发酵菌／慢性葡萄糖发酵菌。这些编码手册来自用于包含干性革兰氏阴性菌接种板试验的MicroScan®自己的资料。革兰氏阴性菌编码手册允许计算机分析23-24个检测试验。这些检测试验资料被转换成一个8位数的生物数字。参照编码手册或抗生素手册的记录结果方法。编码手册列出了微生物的鉴别名称和相对概率。所有可能的概率被打印出来，最大概率累积可达99.9%。

如果生物数字在编码手册查找不到，应当首先怀疑程序发生错误。如果重新测试后，产生同样的结果，将电话告知MicroScan®生物服务部。参看最后页查找正确的电话号码。

A. MIC结果的解释

通过比较微生物的MIC与可获得的血或尿中的抗生素水平，确定药物敏感性。下列表列出了如同在NCCLs资料M100-S9所指的解释标准。有些解释结果不同于1997年版的医生书桌参考手册中列出的制药商的解释阈值。

解释的阈值

抗生素	敏感	中度敏感	耐药
阿米卡星	≤16	32	≥64
阿莫西林/克拉维酸-肠杆菌科	≤8/4	16/8	≥32/16
氨苄西林3 肠杆菌科 和 霍乱弧菌	≤8	16	≥32
氨苄西林/ 舒巴坦-肠杆菌科 和 spp 不动杆菌	≤8/4	16/8	≥32/16
Azlocillin-铜绿假单胞菌	≤64	--	≥128
氨曲南4	≤8	16	≥32
羧苄西林4 铜绿假单胞菌	≤128	256	≥512
其它革兰氏阴性菌	≤16	32	≥64
Cetacior- 肠杆菌科	≤8	16	≥32
头孢孟多- 肠杆菌科	≤8	16	≥32
头孢唑啉- 肠杆菌科	≤8	16	≥32
Cefdinir- 肠杆菌科	≤1	2	≥4
头孢吡肟	≤8	16	≥32
头孢克肟- 肠杆菌科	≤1	2	≥4
头孢尼西- 肠杆菌科	≤8	16	≥32
头孢呱酮	≤16	32	≥64
头孢噻肟	≤8	16-32	≥64
Cefptetam- 肠杆菌科	≤16	32	≥64
头孢西丁- 肠杆菌科	≤8	16	≥32
头孢泊肟- 肠杆菌科	≤2	4	≥8
头孢他啶	≤8	16	≥32
头孢唑肟	≤8	16-32	≥64
头孢曲松	≤8	16-32	≥64
头孢呋辛 axetil(oral)- 肠杆菌科	≤4	8-16	≥32
头孢呋辛 sodium(parenteral-) 肠杆菌科	≤8	16	≥32
头孢噻吩- 肠杆菌科	≤8	16	≥32
氯霉素-霍乱弧菌和铜绿假单胞菌以外的其它革兰氏阴性菌	≤8	16	≥32
Cinoxacin- 肠杆菌科	≤16	32	≥64
环丙沙星	≤1	2	≥4
Gatifloxacin- 肠杆菌科	≤2	4	≥8
庆大霉素	≤4	8	≥16
亚胺培南	≤4	8	≥16
左旋氟沙星	≤2	4	≥8
Lomefloxacin	≤2	4	≥8
Loracaarbef- 肠杆菌科	≤8	16	≥32
Meropenem	≤4	8	≥16
美洛西林 铜绿假单胞菌	≤64	--	≥128
其它革兰氏阴性菌	≤16	32-64	≥128
莫西氟沙星- 肠杆菌科	≤2	4	≥8
Nalidixic Acid- 肠杆菌科	≤16	--	≥32
奈替米星	≤8	16	≥32
呋喃妥因- 肠杆菌科	≤32	64	≥128
Norfloxacin	≤4	8	≥16
氧氟沙星	≤2	4	≥8
呱拉西林 铜绿假单胞菌	≤64	--	≥128
其它革兰氏阴性菌	≤16	32-64	≥128
呱拉西林/Tazobactam 铜绿假单胞菌	≤64/4	--	≥128/4
其它革兰氏阴性菌	≤16/4	32/4-64/4	≥128/4
司帕氟沙星2	≤1	2	≥4
磺胺甲恶唑3-霍乱弧菌和铜绿假单胞菌以外的其它革兰氏阴性菌	≤256	--	≥512
四环素3-霍乱弧菌和铜绿假单胞菌以外的其它革兰氏阴性菌	≤4	8	≥16
替卡西林1 铜绿假单胞菌	≤64	--	≥128
其它革兰氏阴性菌	≤16	32-64	≥128
替卡西林/克拉维酸6 铜绿假单胞菌	≤64/2	--	≥128/2
其它革兰氏阴性菌	≤16/2	32/2-64/2	≥128/2
妥布霉素	≤4	8	≥16
甲氧苄啶- 肠杆菌科	≤8	---	≥16
甲氧苄啶/磺胺甲恶唑3-霍乱弧菌和铜绿假单胞菌以外的其它革兰氏阴性菌	≤2/38	---	≥4/76
Trovafloxacin2	≤2	4	≥8

根据NCCLs资料M100-S9指示的解释阈值。包括在本接种板的抗生素在治疗所有被检测的微生物所导致的临床感染并没有被证实安全和有效。已被表明在体外或临床感染具有活跃抗菌的抗生素结果报告参照NCCLs M100的表１和表２或药品包装的说明书。

１．某药物的NCCLs解释阈值不同于制药商的阈值。

２．根据制药商的阈值。

３．霍乱弧菌的解释仅用于根据霍乱弧菌设计的抗生素。

４．产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希≥≥≥8β-（头孢噻肟和头孢三嗪噻肟在此浓度并不是一个敏感的指示剂）菌的临床分离物的头孢噻甲羧肟、噻肟单酰胺菌素、头孢噻肟、头孢三嗪噻肟的MIC增加（≥2μg/ml）或cefpodoxime的MIC增加≥2μg/ml或≥8μg/ml（根据接种板而定），应当怀疑含有广谱β-内酰胺酶（ESBL）。（头孢噻肟和头孢三嗪噻肟在此浓度并不是一个敏感的指示剂）。为了证实试验和报告，建议参照NCCLs标准。

操作程序的局限性

１．条件苛刻的细菌－嗜血杆菌和其它条件苛刻的革兰氏阴性细菌不会生长在没有添加丰富营养的Muller-Hinton培养基。

２．厌氧型细菌－此处所讲的抗生素接种板和操作手册仅适应于兼性厌氧型和需氧型革兰氏阴性细菌。

３．关于头孢羟唑的体外抗大肠杆菌的作用调查研究已经表明在大肠杆菌培养基中有高频率的耐药变异菌株，提示当与其它头孢菌素或其它抗生素比较时，用头孢羟唑化学治疗这些微生物时应当进行仔细评价。

４．对一个特异的生物数字列出的不仅仅是一个细菌，有必要用编码手册列出的附加试验进行最后鉴别。

５．解释试验结果应需要一个临床培训过的人员。这个人员在进行鉴别微生物之前应具有利用判断、知识和附加证实试验的能力。

６．生物数字不要用于来自同一个患者标本分离物的鉴别菌株的表型。

７．通过下表列出的微生物／抗生素联合试验获得的结果与过夜参考方法比较，MIC有偏差。如果此抗生素对患者的病情至关重要，应当应用其它操作程序。

微生物	对患者至关重要的药物，应选择其它方法	将不会报告的药物1
spp普罗维登斯菌　　　　　　　　Cefdinir
spp志贺	氨苄西林
S. maltophillia 和spp不动杆菌	呱拉西林/Tazobactam

打印会被数据管理系统（DMS）终止。

８．MicroScan®干性革兰氏阴性细菌接种板和NCCLs冷冻的过夜参考接种板的检测结果具有可比性，但与某种抗生素的大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌35218、铜绿假单孢菌ATCC27853的NCCLs认可的质量控制范围并不符合。

９．利用利标准浑浊度接种方法，其它操作程序获得的结果与干性接种板人工读取的结果具有可比性。对于下述方法，符合百分比（+/-,每个稀释度）不低于95%：

抗生素　　　　　　　方法

Loracarbef 静止期／对数期

10. 利用对数期和静止期接种方法，关于Cefdinir、Meropenem、莫西氟沙星和Sparfloxacin的操作程序尚未建立。接种物品应当按照浑浊度或Prompt^TM方法进行准备。

令人误解的结果

NCCLs标准M7-A４声明，危险的、令人误解的结果在某种抗生素与其特异性微生物进行试验时可能发生。这些结合试验包括：第一代和第二代头孢菌素和氨基糖苷类抗生素与沙门氏和志贺氏菌。当上述抗生素／细菌结合试验时，MicroScan®数据管理系统（DMS）仅将报告MIC，不作解释。

预期值

对于预期值，请参照MicroScan®需氧型革兰氏阴性细菌生物编码手册或葡萄糖发酵菌和葡萄糖非发酵菌抗生素操作手册中的百分比表。

操作特点

MicroScan®干性接种板的操作已经建立并在几个实验室进行了评价。表１和表２中的抗生素利用混浊度接种方法在MicroScan®干性接种板上进行了试验并进行了人工阅读。这些结果与参考微稀释MIC系统获得的结果具有可比性。1993年12月后，明确用于MicroScan®干性接种板的抗生素，其最初和最终的效能已在表２列出。最后的效能结合反复试验来解决分歧。

表１

与参考方法的符合百分比

抗微生物剂	测试菌株的数目	MIC	明确的	抗微生物剂	测试菌株的数目	MIC	明确的
阿米卡星	404	97	99	氯霉素	404	--	99
阿莫西林	350	92	98	Cinoxacin	324	--	100
氨苄西林	415	99	99	环丙沙星	350	--	100
氨苄西林／舒巴坦	296	99	99	庆大霉素	404	98	100
Azlocillin	72	--	100	亚胺培南	350	90	98
氨曲南	350	--	98	Lomefloxacin	300	99．7	100
羧苄西林	404	--	96	美洛西林	90	--	100
头孢克罗	296	97	98	Nalidixic Acid	354	100	100
头孢孟多	404	100	100	奈替米星	324	99	99
头孢唑啉	324	--	100	呋喃妥因	354	--	99
头孢克肟	296	98	97	诺氟沙星	350	--	99
头孢尼西	350	--	92	氧氟沙星	562	99．8	100
头孢呱酮	404	100	100	呱拉西林	404	--	99
头孢噻肟	404	100	100	磺胺甲恶唑	354	--	99
头孢替坦	350	--	96	四环素	404	99	100
头孢西丁	404	--	99	替卡西林	354	--	100
头孢他啶	300	95	98	替卡西林/克拉维酸6	350	90	100
头孢唑肟	324	99	100	妥布霉素	404	99	100
头孢曲松	300	94	99	甲氧苄啶	354	--	100
头孢呋辛	324	--	100	甲氧苄啶/磺胺甲恶唑	404	--	100
头孢噻吩	404	98	100

表２

与参考方法的符合百分比

抗微生物剂	测试数目	最初％			最后％
		MIC		明确	MIC	明确
Cefdinir MIC大小 阈值大小	333 333	96.1 --		98.2 94.0	97.9 --	98.8 94.3
头孢吡肟 MIC大小 阈值大小	730 730	97.4 --		99.2 95.2	98.6 --	99.3 95.2
头孢泊肟 MIC大小 阈值大小	622 622	96.1 --		98.1 93.6	98.6 --	99.2 94.7
Gatifloxacin	415	99		97	--	--
左旋氟沙星 MIC大小 阈值大小	318 318	98.4 --		99.7 95.0	100 --	100 95.0
Loracarbef MIC大小 阈值大小	622 622	95.2 --		98.9 97.7	96.6 --	99.4 98.2
Meropenem MIC大小 阈值大小	318 318	98.7 --		100 99.4	99.1 --	100 99.4
莫西氟沙星	415		99	98	--	--
呱拉西林/Tazobactam MIC大小 阈值大小	572 572		93.5 --	96.7 94.8	93.9 --	97.2 94.9
司帕氟沙星 MIC大小 阈值大小	318 318		97.2 --	99.4 94.3	99.1 --	99.7 94.7
Trovafloxacin MIC大小 阈值大小	333 333	98.8 ---		99.7 95.5	99.7 --	100 95.8

重复性

利用WalkAway®和autoSCAN®-4仪器系统，对Micro®干性接种板上的10种微生物进行了一个仪器重复性研究。所有接种板采用混浊度方法进行接种。对同一个检测接种板，仪器阅读的结果与人工阅读的结果进行了比较。仪器阅读的结果与人工阅读的结果的符合百分比（+/-,每个稀释度）见下表。

抗生素	WalkAway®	autoSCAN®-4
阿莫西林	99.4	100
Cefdinir	10	100
Cefepime	99.4	100
Cefpodoxime	96.	98.9
Levofloxacin	100	100
Lomefloxacin	98.9	99.4
Loracarbef	100	98.9
Meropenem	98.3	100
Ofloxacin	1000	98.9
Piperacillin/Tazobactam	100	100
Sparfloxacin	100	100
Trovalfloxacin	98.9	99.4

ESBL筛选

MicroScan®干性革兰氏阴性细菌接种板已被评价用于筛选产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌和埃希大肠杆菌临床分离物的ESBL产物。通过比较MicroScan®干性接种板的MICs和分子特征化的结果，对接种板的敏感性和特异性进行了评价。细菌群包括128种具有遗传特征的菌株。利用74种ESBL阳性的菌株对敏感性进行了检测，而特异度则利用54种ESBL阴性菌株包括20种ampcβ-内酰胺酶菌株进行了评价。对5 种指示药物，ampcβ-内酰胺酶菌株可表现为MIC升高，并且如果没有得到证实利用ESBL筛选抗生素将不能与ESBL菌株区分开来。通过其它方法可以确定产生β-内酰胺酶菌株的表型。推荐的确定试验和报告，参照目前的NCCLs标准。鼓励每个实验室建立关于筛选阳性分离物的附加试验和（或）报告的方法。在MicroScanβ-内酰胺酶手册，可发现附加的临床和软件信息。

下列表列出有关不同类型接种板的敏感度和特异度的结果。不同接种板的操作程序不同，根据接种板的抗生素及其浓度而定。由于缺乏抗生素浓度为1μg/ml的接种板，具有相对不敏感，因此，推荐不用于筛选，但是可用于指明高水平的β-内酰胺酶产生的存在。

接种板类型	敏感度 74种ESBL阳性菌株 （95%可信限区间）	敏感度 34种ESBL阴性菌株+20种ampc菌株 （95%可信限区间）
阴性阈值联合-11,12,13 阴性联合-21,22,25,26,27 阴性/尿MIC-7,10,11 阴性/尿联合-2,3,4,5	74/74=100%(100-100%)	33/54=61.1%(48.1-74.1%)
阴性阈值联合-14,16	74/74=100%(100-100%)	32/54=59.3%(46.2-72.4%)
MIC +3	74/74=100%(100-100%)	31/54=57.4%(44.2-70.6%)
MIC +2	73/74=98.6%(95.9-100%)	32/54=59.3%(46.2-72.4%)

参考文献：略

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