[转发]DADE BEHRING 干性革兰阳性菌实验操作指南

MicroScan®干性革兰阳性菌实验操作指南

注意：阴影表明操作步骤的变化

应用范围

用于MicroScan干性革兰阳性菌MIC/综合板,干性革兰阳性菌定性MIC/综合板和干性革兰阳性菌ID 2型板。MicroScan Pos板应用于：测定抗微生物剂的敏感性和(或)鉴别快速生长的需氧和兼性需氧的革兰阳性球菌，一些需特殊营养的需氧革兰阳性球菌以及单核细胞增多性李司特氏菌属的种类水平。另请参阅用于需特殊营养链球菌的操作限制部分。

简要原则

抗微生物剂敏感性实验是小型化的稀释液培养基脱水后的敏感性实验。不同的抗微生物剂与钙和镁或与融合了有临床意义的补充物一起在Mueller-Hinton液体培养基中被稀释。苯唑西林液体培养基加入了氯化钠。协同筛检需利用葡萄糖磷酸盐液体培养基。磺胺甲基异恶唑和甲氧苄胺嘧啶/磺胺甲基异恶唑液体培养基中含胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶可减少在培养基中的胸腺嘧啶脱氧核苷水平。在接种和用标准化的生物体混悬液再水化以及在35℃中温育16小时后，实验生物体的最小抑制浓度或敏感性（敏感的，中间的，耐受的）可由观察抑制生长的最低抗微生物剂浓度测定的。

改良的传统和染色实验用于鉴别微球菌科、链球菌科及单核细胞增多性李司特氏菌属。这都依据检测pH值的变化、底物的利用情况和在有抗微生物剂的环境中于35℃下温育16-44小时后的生长情况而定。

*β-内酰胺酶产物可由碘定量法检测出。

以下微生物/抗微生物剂需延长培养时间才能准确的检测出其耐受性。

24小时 肠球菌 万古霉素

24-48小时 葡萄球菌 苯唑西林

肠球菌 链霉素

协同筛检

注意事项

1． 只用于体外诊断中。

2． 无菌操作和预防微生物的危害要贯穿整个过程。

3． 所有材料必须先用高压锅消毒后再处理。

储存

MicroScan 干板应在2-30℃的环境中储存。

物品变质

如果暴露在以上推荐储存环境之外会导致抗微生物剂丧失抗菌力和生化污染，使用不要超出产品有效期。

样品的采集和准备

合适的样品应根据临床微生物学指南的介绍采集,运输并放置在原始分离媒介中。

操作

材料的提供

参见测试板的盒子上标贴上有关内容。

需要但未提供的材料

0.5McFarland硫酸钡标准混悬液。

0.5%N,N-α-1 甲基萘基胺30ml(B1010-45A)或250ml(B1015-45)。

0.8%磺胺酸,对氨基苯磺酸30ml(B1010-44A)或250ml(b1015-44)。

10 μ l或100μl带一次性无菌吸头的吸管或10 μl校准环。

5%α-萘酚10ml(B1010-42) 或30ml(B1010-42A)。

40%氢氧化钾30ml(B1010-43A) 或250 ml(B1015-43)。

盖盘(B1010-56B)

一般的实验室仪器

一套D型接种器(B1013-4)

接种液3ml(B1015-2)

碘试剂30ml(B1010-94)

操作报告表格,最小抑制浓度(B1014-92)或转效点(B1014-47)

微稀释观察器(B1010-6)

Microscan革兰阳性生物型密码本(B1014-46B)

矿油60ml(B1010-6)

矿油250ml——只适用于WalkAway系统的仪器,其仪器也具有升级的自动化油叠特征

人工测试板工作窗体(用来记录操作结果)

提升的接种系统(B1026-10D)

生物体质量控制(请参阅本手册质量控制的分类数字)

质量控制报告表格

青霉素溶液(3万单位/ml)(B1010-93)

肽酶试剂30ml(B1012-30B)或250ml(B1015-30)

Pos接种培养基0.5ml(B1013-12A)

Todd-Hewitt培养基4-5ml

试剂滴管成套工具(B1013-12A)

RENOK再水化器/接种器(B1018-14)或相应的计量器

搅拌器

WalkAway系统密码标签纸条(B1011-16)

WalkAway盖盘(B1018-18)

步骤概要

A 测试板的准备

1. 从储存库中取出测试板,如果包装不完整 (没封口、被刺破或被撕裂)就不能应用。

2. 打开包装袋取出测试板,如果是储存在冰箱里的,立即从箔袋中取出测试板。.

3. 一旦出现以下情况测试板就不能使用:

a 干燥剂缺失或损坏。

b 测试板被污染(例如:有磷酸酶、不同的抗微生物剂)。

4.于再水化之前应让测试板与室温相适应,测试板可堆放于盖盘下,所有打开的测试板应在当天使用，否则就应丢弃。

B 接种物的准备

(注意:参阅操作指南上的限制)

NCCLS推荐定期通过计算生物群体数来检查接种体密度.。请参阅NCCLS M7-A4文件。期望值应在3-7×10⁵CFU/ml。

1. 标准比浊技术——基本的接种方法

标准比浊技术用于需氧革兰阳性球菌的直接接种和检测耐甲氧苯青霉素的葡萄球菌。

a. 用无菌的木制涂药棒或细菌接种环从18-24小时无抑制的琼脂平板表面取得菌落，它们必须是形态相近且完全孤立的4-5个大的或5-10个小的成簇。

b. 使之在3ml接种液(高压灭菌后除去离子的水)中乳化,最后的混悬液应该相当于0.5McFarland硫酸钡标准混悬液,盖紧盖子。

c. 搅拌混悬液2-3秒

d. 吸0.1 ml(100μl)标准混悬剂放入25ml含PLURONIC的接种液,盖紧盖子,翻转8-10次以让其混合。

**PLURONIC是表面活性剂,为BASF公司（Parsippany,NJ,USA）的注册商标。

***3M,St,Paul,MN,USA

2.快速接种系统

快速接种系统可用于生长更快的革兰阳性球菌,为合理运用快速接种系统请参阅快速接种操作指南。

注意:谨慎使用,生物体不符合型号所致的接种失败会造成敏感性和鉴定结果的误差,此外,葡萄球菌的菌落数在提升的方法下会激增甚至超过NCCLS的预期范围。激增的菌落数会反过来影响抗微生物剂的结果，而这些结果又受接种体的影响，请参阅关于受接种体依赖的抗微生物剂的限制部分。

3.对数期技术

对数期技术,当细菌混悬液加入与之相当的0.5McFarland标准混悬液之后稀释到理想浓度，此技术适用于相对生长较慢的细菌及当天较迟到达的样品

a. 用无菌的木制涂药棒或细菌接种环从18-24小时无抑制的琼脂平板表面取得菌落，它们必须是形态相近且完全孤立的4-5个大的或5-10个小的成簇。

b.使之在4-5mlTodd-Hewitt培养基中被乳化并在35℃下培养2-4小时,这被称为 log 相细菌混悬液.。

c.在培养之后,接种到测试板之前重新搅拌此混悬液2-3分钟.

d.用Todd-Hewitt 培养基,稀释log相混悬液到相当于0.5McFarland硫酸钡标准混悬液。

e. 吸0.1ml(100μl)标准混悬液至25ml含PLURONIC的接种液,盖紧盖子翻转8-10次以使其混合。

4.固定相技术

最新鉴定系统尚无法使用固定接种方法。

必须应用标准比浊,快速接种或对数期准备接种物。

固定相技术可用于快速生长的革兰阳性球菌,混悬标准技术适用于检测耐甲氧苯青霉素葡萄球菌。

a. 用无菌的木制涂药棒或细菌接种环从18-24小时无抑制的琼脂平板表面取得菌落，它们必须是形态相近且完全孤立的4-5个大的或5-10个小的成簇。

b.使菌落在0.5ml pos接种培养基(Todd-Hewitt)中被乳化,盖紧盖子

c.搅拌混悬液2-3分钟

d.松开试管盖，在35℃下温育4-6小时

e.在培养之后,接种到测试板之前重新搅拌混悬液2-3分钟.

f.如果培养基在培养后变浑浊，就取0.1ml(100μl)混悬液至25ml含PLURONIC的接种液,盖紧盖子翻转8-10次以使其混合。

g.如果培养基在6小时培养后没有变浑浊,那就在接种到测试板之前再温培养12-18小时,可以交替使用标准混悬技术.

h.如果培养基在另外培养12-18小时后变浑浊,就取25ml 含PLURONIC的接种液，就像上面“f”所述的操作。

C 测试板的水化/接种

测试板的水化和接种是用RENOK系统的D型接种器(B1013-4)来进行的，使用时请参阅RENOK操作手册,如果使用另外的系统,用115+10μl 接种液(PLURONIC)再水化，最后的底物浓度应在3-7×10⁵CFU/ml。 为了确定生物的生存能力和纯度,无污染的培养板由接种物完全暴露在血琼脂平板培养一夜后准备而成。如果无污染的培养板上出现两种或两种以上菌落类,就要重新分离菌落并再次试验。

D 生化覆盖

1．用一个滴瓶，滴至少三滴矿油覆盖精氨酸和尿素底物(这些底物是衬在测试板里的)。

2．矿油必须完全覆盖底物的中层，但不能盖满底物。

注意：WalkAway 系统/仪器具有升级的自动化油叠特征自动，自动为相应标本加油。

E 培养

1保证培养期间热量均衡分布，将3-5个测试板堆放在一起。

2在每组测试板上放上干净的盖盘以防水分蒸发，盖盘可重复使用，但不要用酒精来消毒，可以用水和肥皂清洗，仔细冲洗然后风干。

3将测试板放入35℃无二氧化碳的培养箱中培养16-20小时。

F解读测试板

测试板可用MicroScan的微稀释观察器人工分析，然后将结果记录在测试板操作窗体或MicrpScan仪器记录表上（touchScan-SR,autoScan-4和WalkAway 系统）。使用MicroScan仪器来分析测试板请参阅相应的操作指南。

1．培养16-20小时后，将测试板从培养箱中取出。

2．用纱布擦去测试板底部的结合物和碎片。

3．只有在控制性底物澄清，生长性底物变浑浊时可解读测试板，如果控制性底物变浑浊或生长性底物中无细菌生长则不要解读此抗微生物剂。细菌在底物中的生长表现为变浑浊，会在底物中形成白色絮状物，标本中央出现白色点状物，或在标本中出现颗粒样物质生长。如果底物中有少量的白色或培养基澄清表明生长不足。

4．如果人工分析这些结果，就记录在合适的工作窗体上。

5．分析抗微生物剂敏感性（最小抑制浓度）

a．在黑色底版（有间接光线）上分析所有抗微生物剂，如ＣＶ，ＭＳ，ＮＯＶ，ＯＰＴ，ＮＡＣＬ和ＢＡＣ。

B．进行葡萄球菌β–内酰胺酶试验请参阅步骤的6f部分

c记录敏感性转效点如下：

1）最小抑菌浓度结果。

a)经培养16-20小时后，在底物使细菌刚开始生长的最高浓度记录为最小抑菌浓度。

b)如果在一种抗微生物剂的任何浓度下都生长那最小抑菌浓度大于最高浓度。

c)如果在此抗微生物剂的任何浓度下都无生长那最小抑制浓度小于/等于最低浓度。

d)在一系列底物中只有一个底物不能使细菌生长，如：在1，2，8g/ml下能生长，但在4 g/ml 下不生长，称为“跳跃生长”，可以忽略。

2）转效点结果

a)经16-20小时培养后，在抗微生物剂中无生长称为“S”（敏感）。

b)在低浓度抗微生物剂中生长，但在高浓度中不生长称为“I”（介于敏感与耐受之间）。

c)在两种浓度下或一个稀释的抗微生物剂标本中都生长称为“R”（耐受）。

d)如果在高浓度抗微生物剂下生长，但在低浓度下不生长，那么这个标本可能已受污染，试验应重新进行。

3）在完全隔离的底物中有一点生长表明已受污染，试验应重做。

4）对于苯唑西林与葡萄球菌，任何生长都应视为有意义。

5）以下需延长培养时间才能准确检测其耐受性

培养 生物体 抗微生物剂

24小时 肠球菌 万古霉素

葡萄球菌 苯唑西林

24-48小时 肠球菌 链霉素

协同

6）所有葡萄球菌对氨苄西林和青霉素都耐药，青霉素最小抑制浓度大于0.12 g/ml或β–内酰胺酶阳性。

7）当苯唑西林对葡萄球菌的最小抑制浓度大于2g/ml，葡萄球菌对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/青霉烷砜、替卡西林/克拉维酸、美罗培南、青霉素、氟呱嗪青霉素/tazobactam和头孢菌素（可忽视最小抑制浓度）都有耐药性。

8）细菌对含氨基糖甙类（例如：庆大霉素）和大环内脂类（例如：红霉素）底物的生长优于在生长控制下底物的生长，因为基础媒质不同，解释其结果应慎重。

9）拖曳效应可在一些药物/生物体结合实验中观察到。接种底物的浓度决定了甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异恶唑（t/s）和磺胺甲基异恶唑（sx）的拖曳效应，其实验是用RENOK再水化/接种系统进行的。当与能使细菌生长的底物比较时终点即为最低浓度，它表现为：

a)生长减少约80%（T/S，Sx）。

b)白色点状物直径小于2毫米。

c)白色点状物是半透明的。

10）如用接种和葡萄球菌提升法，包括生物质量控制表中的金黄色葡萄球菌ATCC 29213检测fluoroquinolone类抗微生物剂（如环丙沙星、诺氟沙星、奥氟沙星）可观察到絮状物，这不应解释为生长。

11）如果生物体在胸腺嘧啶自由生长基中不能生长，就不能显示T/S和Sx的最小抑制浓度。

典型说明 控制性底物澄清，而在生长性底物中有较大点状生长。 在第1和第2列是典型的生长； 第2列显示了生长性底物中的“跳跃”生长，其应被忽略； 第3列中的单独一点与上下的控制性底物相联系说明此点已污染，应忽略； 第1列中的MIC=2μg/ml（最低浓度控制底物）。 第2列中的MIC=>16μg/ml（在所有底物中生长）。 第3列中的MIC=≤0.12μg/ml（所有底物中均无生长）。 第4列中的MIC=2μg/ml（在底物2-8中有拖曳效应）。 （典型的t/s拖曳效应）。 第5列中的MIC=≤0.12μg/ml（所有底物中都有拖曳效应，所以MIC应≤0.12μg/ml）。 （一些药物/微生物组合的典型效应） 第6列中的MIC=≤0.12μg/ml。

6．分析鉴定底物

a．在白色底版上分析除CV，MS，NOV，OPT，NACC和BAC（它们应在黑色底版上分析）的所有鉴定底物。

B．IDX,PHO,BL的结果在培养16-20小时后的记录。

C． PGT阴性和碳水化合物小于三个阳性的测试板在最后分析鉴定前应重新培养。

D．只有碳水化合物三个阳性或PGT反应阳性的测试板应在16-20小时内加试剂，如无须考虑其阳性试验数，就在40-44小时内加入试剂。

E．在加试剂之前记录下所有的阳性反应。

F．加试剂步骤如下

1）只对葡萄球菌进行β–内酰胺酶试验，加1滴青霉素溶液（30000单位/ml）至BL底物，用涂药棒混合，在35℃下培养30分钟，之后加入1滴碘试剂，再用涂药棒混合，在5分钟内读出结果。

2）加1滴40%氢氧化钾和1滴5% α-萘酚至VP底物中，至少等20分钟，让VP反应进行后读取。

3）各加一滴0.8%磺胺酸和0.5%N-N–甲基萘基胺至NIT标本中，至少等5分钟，让NIT反应进行后读取。

4）加2滴肽酶试剂至PYR标本中等2分钟再解读。

G．需生化解释请参阅结果部分。

质量控制

用已知反应及最小抑菌浓度范围进行微生物测试以此来确认鉴定媒质和抗微生物剂的可接受性，美国典型培养物集合的微生物结果列表如下：

质量控制表格包括了所有稀释的Microscan干板综合表格，也许需要根据你的稀释测试板类型从质量控制表格中推断，下面是几个范例：

质量控制微生物 简写 QC表终点 测试板稀释度 推断质量控制范围 粪肠球菌ATCC29212 Gm 4 - >8 1 – 4,6 4,6 - >6 粪肠球菌ATCC29212 Ox 4 - >4 0.5 – 2 >2 粪肠球菌ATCC29212 Tim 8 - >8 8 <=8 - >8 金黄色葡萄球菌ATCC29213 P/T <=1 – 2 4 – 8 <=4

1. 干性革兰阳性菌质量控制表：

		粪肠球菌ATCC29212		金黄色葡萄球菌ATCC29213
抗微生物剂	Abbr	MIC	BP	MIC	BP
阿米卡星	Ak	32->32	32->32	<=16	<=16
阿莫西林/克拉维酸钾	Aug	<=2/1	<=4/2	<=2/1	<=4/2
氨苄西林	Am	0.25-1	<=0.25,2	>=0.5	>=0.5
氨苄西林/舒巴坦	A/S	<=4/2	<=8/4	<=4/2	<=8/4
阿齐红霉素	Azi	N/A	N/A	---	<=2
头孢孟多	Cfm	---	N/A	---	<=8
头孢唑林	Cfz	N/A	N/A	<=2	<=8
头孢地尼	Cdn	N/A	N/A	<=1	<=1
头孢吡肟	Cpe	16->16	16->16	<=2-4	<=8
头孢噻肟	Cft	N/A	N/A	<=4	<=8
头孢唑肟	Cz	N/A	N/A	---	<=8
头孢曲松	Cax	N/A	N/A	<=4	<=8
头孢呋辛	Crm	N/A	N/A	<=2	<=4
头孢噻吩	Cf	N/A	N/A	<=2	<=8
氯霉素	C	4-8	<=8	4-16	<=8-16
环丙沙星	Cp	<=1	<=1	<=0.25-0.5	<=1
甲红霉素	Cla	N/A	N/A	<=0.25-0.5	<=0.25-0.5
克林霉素	Cd	>2	>2	<=0.25-0.5	<=0.5
红霉素	E	1->4	4->4	<=0.25-1	<=0.25-0.5
Gatifloxacin	Gat	<=0.5-1	>=2	<=0.5	<=2
庆大霉素	Gm	4->8	<=4->8	<=1	<=4
庆大霉素协同筛网	GmS	<=500	<=500	N/A	N/A
亚胺培南-葡萄球菌	Imp	<=1-2	<=4	<=1	<=4
左氟沙星	Lvx	<=0.5-2	<=2	<=0.5	<=2
Linezolid	Lzd	1-4	<=2-4	1-4	<=2-4
美罗培南	Mer	2-8	<=4-8	<=1	<=4
Moxifloxacin	Mxf	<=0.5	<=2	<=0.5	<=2
硝基呋喃妥英	Fd	<=32	<=32	<=32	<=32
诺氟沙星	Nxn	<=4	<=4	<=4	<=4
氧氟沙星	Ofl	<=2-4	<=2-4	<=2	<=2
苯唑西林	Ox	4->4	>2	<=0.5	<=1
青霉	P	0.5-2	0.5,2	>=0.25	>=0.25
呱拉西林/Tazobactam	P/T	<=1-4	<=8	<=1-2	<=8
利福平	Rif	<=1	<=1	<=1	<=1
司帕沙星	Sfx	---	<=0.5	---	<=0.5
链霉素增效协同	StS	<=1000	<=1000	N/A	N/A
磺胺甲恶唑	Sx	<=256->256	<=256->256	<=256->256	<=256->256
Synercid	Syn	2->2	2->2	<=0.25-1	<=1
四环素	Te	4-8,128	<=4-8	<=1	<=4
替卡西林/克拉维酸钾	Tim	8->8	<=8-8	<=1	<=8
甲氧苄啶/磺胺甲恶唑	T/S	<=0.5/9.5	<=2/38	<=0.5/9.5	<=2/38
万古霉素	Va	<=2-4	<=4	<=2	<=4

1范围=期望值（μg/ml）。

2一些抗微生物剂的范围与NCCLSM7-A4 号文件的表3所列关于可接受的质量控制范围不一致。

3只用于固定、log、混悬接种方法。如果青霉素MIC>0.25（无上限），氨苄西林MIC>0.5(无上限),红霉素MIC<0.25-2,庆大霉素MIC<1-2 那么这些抗微生物剂应慎用于提升接种系统。

4大肠埃希菌会有另外的终点。

5大肠埃希菌会有另外的终点。

6粪链球菌会有另外的终点。

7粪链球菌会有另外的终点。

2. 干性革兰阳性菌鉴定底物质量控制表

	金黄色葡萄球菌 ATCC 29213 B1010-23B	粪肠球菌 ATCC 29212 B1010-22A	牛链球菌 ATCC 49147 B1010-28E	M.Iuteus³ ATCC 49732 B1010-28G
龙胆紫	-	+	N/A	N/A
微球菌筛网	+	+	+	-
硝酸盐	+	-	-	N/A
新生霉素²	-	N/A	-	N/A
糖苷酶PGR	+	-	-	N/A
吲哚酚磷酸酶	+	N/A	N/A4	-4
沃-普反应	+	+	+	-
双乙奎宁²	+	+	+	N/A
磷酸酶	-	N/A	-	N/A
胆汁七叶甙	N/A	+	+	N/A
吡咯烷-β-萘胺	+	+	-	N/A
精氨酸	+	+	-	N/A
糖苷酶PGT	+5	+	+	N/A
尿素	+	-	-	-
甘露糖	+	+	+	N/A
乳糖	N/A	N/A	+	-
海藻糖	N/A	+	+	-
MNS	N/A	+	+	-
6.5%氯化钠	N/A	+	-	N/A
山梨糖	N/A	+	-	N/A
阿拉伯糖²	N/A	-	-	N/A
核糖	N/A	+	-	N/A
菊粉	N/A	-	+	N/A
棉子糖	N/A	-	+	N/A
枯草杆菌肽²	N/A	+	+	N/A
丙酮酸盐	N/A	+	-	N/A
β-内酰胺酶	+	N/A	N/A	-
胸腺嘧啶自由生长基	+	+	+	N/A

1. 美国典型培养物集合，Manassas，VA USA

2. 其它细菌的阳性或阴性生化反应请参阅附加试验表。

3. M.Iuteus ATCC 49732 经MicroScan仪器辨认16-18小时后，在质量控制报告MIC部分显示为N/R。这不影响在任何辨认时间的底物鉴定质量控制结果。

4. 不适用于数据管理系统V23.05以下版本。

N/A=不适用

注意：质量控制表中的微生物是为所有鉴定底物提供阳性或阴性反应而选出的。因此，这些微生物的鉴定结果随质量控制表指定的底物改变而改变。产物结果的可接受性是非确定性的，应通过试验结果的比较来决定。

附加试验表

微生物 底物 预期结果

腐生葡萄球菌ATCC49907 新生霉素 +

木糖葡萄球菌 ATCC49148 糖苷酶 +

肺炎链球菌 ATCC49136 双乙奎宁 -

枯草杆菌肽 +

E．avium 阿拉伯糖 +

大肠埃希菌¹ ATCC51755 胸腺嘧啶自由生长基 -

1. 该种菌的胸腺嘧啶自由生长基结果应该人工辨认，如果观察到稍模糊的半透明环或半透明点状物则考虑为阴性。

结果

A. 生化结果

1. 生化分析

底物 试剂 阳性 阴性

龙胆紫

微球菌筛网

新生霉素 生长 不生长

双乙奎宁

5%氯化钠

枯草杆菌肽

硝酸盐 加入1滴对氨基苯磺酸和1滴 黄色 澄清（无色）

0.5%N，N-二甲基-α-萘胺， 可能为极淡的粉红色

等5分钟以使反应进行。

PGR 任何深浅的黄色出现即为 黄色 澄清（无色）

磷酸酶 阳性。以新生霉素作为阴性

PGT 对照

吲哚酚 任何深浅的蓝色 澄清（无色）或

磷酸酶 可能为沈淀 白色沉淀

沃-普 加入1滴40%KOH和 由粉红变为红色 由澄清（无色）变

反应 1滴5% α-萘酚，等20分钟 为棕色。可能为混

以使反应进行。 浊的或极淡粉红色

胆汁七叶甙 由深棕色变为黑色 由澄清（无色）变为淡棕色

底物 试剂 阳性 阴性

吡咯烷- 加入2滴肽酶试剂。等反应 红色或由橙色 由黄色变为橙色

β-萘胺 发生需2分钟 变为红色 或红色

精氨酸 粉红或由橙变红 由黄变橙

.尿素 粉红 由黄变橙

棉子糖

乳糖

海藻糖

MNS

山梨糖 出现任何橙色即 黄色 橙色或红色

阿拉伯糖 为阴性

核糖

菊粉

甘露糖

丙酮酸盐

β-内酰 加入1滴青霉素溶液。培养 无色 黑色

胺酶 30分钟。加入1滴碘试剂。

5分钟后记录

溶血反应 α β

LOC 只用于4型自动扫描和WalkAway系统模板的识别

2. 鉴定反应的原理

龙胆紫（CV）：利用能够在低浓度龙胆紫中生长以区分链球菌（阳性）和葡萄球菌（阴性）。

微球菌筛查（MS）：能够在低浓度枯草杆菌肽（0.05μg/ml）中生长以区分葡萄球菌（阳性）和微球菌（阴性）。

硝酸盐（NIT）：硝酸盐还原为亚硝酸盐的过程可通过加入0.8%Sulfanilic Acid和0.5%N，N二甲基-α-萘酚后形成一种红色物质而检测出。链球菌表现为阴性而大多数葡萄球菌为阳性。

新生霉素（NOV）：对低浓度（1.6μg/ml）的新生霉素耐受是一些葡萄球菌的特点。

糖苷酶（PGR，PGT）：有的微生物能够产生一种特殊的糖苷酶，它能分解磷酸-硝基苯碳水复合物释放颜色为黄色的磷酸-硝基酚。

吲哚酚磷酸酶（IDX）：在吲哚酚磷酸酶的作用下吲哚酚磷酸盐水解，产生一种不溶解的蓝色化合物。大多数凝固酶和脱氧核糖核酸酶阳性的葡萄球菌IDX阳性。

沃-普反应（VP）：由葡萄糖产生的acetylmenthylcarbinol与40%KOH和5%α-萘酚发生反应形成红色物质。

双乙奎宁（OPT）：对双乙奎宁敏感是肺炎链球菌的特性。其它链球菌和葡萄球菌不会受双乙奎宁的抑制。

磷酸酶（PHO）：碱性磷酸酶分解磷酸硝基苯成为无机磷酸盐和磷酸硝基苯酚结果显示为黄色。

胆汁七叶甙（BE）： 一些微生物能够在40%的胆汁中生长并水解七叶甙，其水解产物七叶甙原与枸橼酸铁反应可产生黑色沉淀物。以此来检测这些微生物。 D群链球菌，一些草绿色链球菌和一些葡萄球菌为BE阳性。

吡咯烷-β-萘胺（PYR）：能产生吡咯烷酶的微生物分解L-吡咯烷-β-萘胺为L-吡咯烷和β-萘胺，产物与肽酶试剂（磷酸二甲基氨基肉桂醛）结合产生一种红色物质。

精氨酸（ARG）：精氨酸的去水化导致培养基的碱性化，在酚红指示剂中表现为由黄色变为红色。

尿素（URE）：尿素酶分解尿素形成氨。结果使PH升高通过酚红指示剂可检测出。

碳水化合物（RAF，LAC，TRE，MNS，SOR，ARA，RBS，INU，MAN）：一种特殊碳水化合物发酵后形成酸，结果使pH值下降，酚红指示剂变为黄色。

5%氯化钠（NACL）：在6.5%氯化钠中可生长说明有耐受能力。利用耐盐性以区分肠球菌和非肠球菌。

丙酮酸盐（PRV）：丙酮酸盐可形成酸，结果使pH值下降，酚红指示剂变为黄色。

β-内酰胺酶（BL）：在内酰胺酶底物中加入青霉素和碘至可说明是否存在β-内酰胺酶。β-内酰胺环分解后形成比淀粉分子更能竞争碘的结合位点。如果存在β-内酰胺酶，碘与β-内酰胺环结合后产生无色的反应。如果不存在β-内酰胺酶，碘将和淀粉分子结合显示蓝黑色。

溶血反应（HEM）：由链球菌产生的链球菌溶血素S和O在有羊血的琼脂上可发生完全或部分溶血反应。

3. 微生物鉴定

Microscan 干性革兰阳性生物编码册是用于鉴定未知实验微生物的。这本编码册来自于MicroScan自建的数据库。革兰阳性生物编码册为27种链球菌科实验和18种微球菌科实验的计算机分析而提供信息。这些实验结果分别被翻译成一种9位或6位的生物型数字。记录结果的方法请参考编码册。其中列出了微生物的鉴定方式和有关的可能性。所有的都是以最大可能性的顺序排列，累积总共达99.9%。该编码册分为两个部分：微球菌科和链球菌科。

如果出现一种不在编码册中的其它生物型数字，应首先考虑可能是程序的错误。如果重试后仍旧是同样的结果，请致电MicroScan生物型服务部门。

B．最小抑菌浓度（MIC）的结果分析

敏感性是通过将一种微生物的MIC与抗微生物剂在血或尿中可达的水平相比较来决定的。以下表格列出NCCLS介绍的衡量标准。其中一些与1997版的内科医生工作手册中出版者列出的转效点有所不同。

转效点说明*

抗微生物剂 敏感 中间 耐药

阿米卡星-葡萄球菌

阿莫西林/克拉维酸-葡萄球菌

氨苄西林

葡萄球菌

单核细胞增多性李司特菌

肠球菌

链球菌（除肺炎链球菌）

氨苄西林/舒巴坦-葡萄球菌

阿齐红霉素

葡萄球菌

链球菌

头孢孟多-葡萄球菌

头孢唑林-葡萄球菌

头孢地尼-葡萄球菌

头孢吡肟-葡萄球菌

头孢噻肟

葡萄球菌

链球菌

头孢唑肟-葡萄球菌

头孢曲松

葡萄球菌

链球菌

头孢呋辛axetil（口服）-葡萄球菌

头孢呋辛钠（胃肠外用）-葡萄球菌

头孢噻吩-葡萄球菌

氯霉素

所有链球菌以外的革兰阳性微生物

链球菌

环丙沙星-葡萄球菌和肠球菌

甲红霉素

葡萄球菌

链球菌

克林霉素

葡萄球菌

链球菌

红霉素

所有链球菌以外的革兰阳性微生物

链球菌

庆大霉素-葡萄球菌

Grepafloxin

葡萄球菌

β-溶血性链球菌

亚胺培南-葡萄球菌

左氟沙星

美罗培南-葡萄球菌

硝基呋喃妥英-葡萄球菌和肠球菌

诺氟沙星-葡萄球菌和肠球菌

氧氟沙星

凝固酶阴性的葡萄球菌

β-溶血性链球菌

苯唑西林

葡萄球菌

金黄色葡萄球菌

青霉素G

葡萄球菌

单核细胞增多性李司特菌

肠球菌

链球菌（除肺炎链球菌）

呱拉西林/Tazobactam-葡萄球菌

利福平-葡萄球菌和肠球菌

司帕沙星

肠球菌

葡萄球菌

磺胺甲恶唑-葡萄球菌

Synercid

四环素

所有链球菌以外的革兰阳性微生物

链球菌

替卡西林/克拉维酸-葡萄球菌

甲氧苄啶/磺胺甲恶唑-葡萄球菌

Trovaflacin-所有链球菌以外的革兰阳性微生物

链球菌

万古霉素

所有链球菌以外的革兰阳性微生物

链球菌

*依据NCCLS中M100-S9文件提出的转效点说明。对于所有实验的微生物，尚不能充分证明这种测试板上的抗微生物剂在治疗临床感染上是安全而有效的。关于抗微生物剂结果即对抗体外或临床感染中微生物的有效性的报告，请参考NCCLS M100文件中表1和表2或内附的药物包装说明。

1. 不同于生产者提出的转效点。

2. NCCLS转效点只在说明中出现。用Microscan干性革兰阳性板得出的肺炎链球菌和草绿色链球菌的结果不予报道。

3. 依据生产者提出的转效点。

4. 由于缺乏耐药链球菌种，NCCLS除了敏感的细菌外无法确定其它的分类结果。那些结果提示为“非敏感性”的种类需进行进一步试验。

5. NCCLS及生产者提出的关于链球菌的转效点。

6. 所指的实验微生物包括对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌，对万古霉素耐药的屎球菌及化脓性链球菌。

链霉素及庆大霉素协同筛检

单用青霉素或氨苄西林常无法治疗肠球菌引起的心内膜炎。当肠球菌在体外对高浓度的链霉素或庆大霉素敏感时，与青霉素或氨苄西林一起使用能协同作用并相应地提高临床治愈率。依照NCCLS M7-A4文件，由培养基微稀释检测对高浓度氨基糖甙类耐药（HLAR）情况方法如下：

抗微生物剂 媒介 培养时间 浓度

庆大霉素 BHI* 24小时 500μg/ml

链霉素 BHI* 24-48小时 1000μg/ml

*以葡萄糖磷酸为培养基的限制性实验可得出类似的结果。

Microscan测试板中链霉素和庆大霉素协同筛检法与NCCLS介绍的微稀释培养法有异曲同工之处。出现任何浑浊的迹象即认为细菌能够生长，或者再次培养以确定结果。将用庆大霉素筛检法培养18小时与用微稀释法培养24小时所获得的结果进行比较，两者是相当的。为了达到检测对链霉素协同筛检耐药性的最佳效果，Microscan测试板应该培养24-48小时。

胸腺嘧啶自由生长基（TFG）底物

一些细菌的生长需要胸腺嘧啶。由于Mueller-Hinton培养基中存在胸腺嘧啶磷酸化酶，这些细菌可能表现出对磺胺类的假性易感。如果某种微生物不能在TFG底物中生长，不应以T/S和Sx报道最小抑菌浓度。

操作过程限定

1. Microscan革兰阳性板不用于鉴定肺炎球菌分离种及绿色链球菌。这些分离种需用一种可行的方法试验，如Microscan MICroSTREP 板。

2. NCCLS M7-A4文件补充介绍了试验需特殊营养的链球菌时使用的含有溶化马血的Mueller-Hilton培养基。与Microscan干性革兰阳性板程序指南有所不同。如果细菌在生长底物中没有充分生长，最小抑菌浓度和（或）生化结果是无效的，需使用另一种替代方法。

3. POS COMBO 或POS MIC 板不适用于试验厌氧革兰阳性球菌。

4. 当鉴定结果的可能性较低（〈85% 〉时，必须进行附加实验以确定最后鉴定结果。（请参阅Microscan 生物型编码册关于需氧革兰阳性微生物或微生物手册）

5. 青霉素对于凝固酶阴性葡萄球菌最小抑菌浓度由于存在β-内酰胺酶，可能无法用以预测其耐药性。因此，必须进行β-内酰胺酶试验以确定最小抑菌浓度。青霉素最小抑菌浓度为2μg/ml的腐生葡萄球菌株以被表明不产β-内酰胺酶，所以氨苄西林、阿莫西林或青霉素是治疗该细菌引起的尿路感染的可选药物。

6. 由于一些培养基的组成物未完全溶解，一些抗微生物剂底物可能会偶尔出现轻微浑浊。这不能认为是细菌生长。

7. 解释实验结果需要由受过训练的临床工作者来进行，他们会利用判断力、知识及附加的确定试验对一种微生物鉴定结果进行解释。

8. 生物型数字不能用于从同一个患者的各种标本中分离出的菌株的表型鉴定。

9. 以下所列的抗微生物剂组合物的结果与过夜的微稀释法相比表明了不同的最小抑菌浓度。如果一种抗微生物剂在治疗患者中是关键性的，必须用另一种替代方法或由于低相关性将不予报道。

微生物	若对于治疗患者是重要的，需用另一种替代法	不报道的药物
绿色链球菌		所有
肺炎链球菌		所有
链球菌		阿齐霉素、甲红霉素、红霉素
肠球菌	美罗培南	阿齐霉素、甲红霉素
屎球菌		亚安培南
耐甲氧西林凝固酶阴性的葡萄球菌		头孢地尼
耐甲氧西林葡萄球菌		氧呱嗪青霉素/Tazobactam
葡萄球菌	Travofloxacin
需氧绿色球菌	氧呱嗪青霉素/Tazobactam
单核细胞增多性李司特菌	氧呱嗪青霉素/Tazobactam	阿齐霉素、甲红霉素 Sparfloxacin
1. 仅用于稀释法的转效点 2. 若数据管理系统（DMS）禁止刊登，务必遵守。请查询DMS简介中的指示说明。 3. 数据管理系统低于V23.05版本禁止翻印。

10. 用Log和固定接种物培养法不能进行阿齐霉素、头孢地尼、头孢吡肟、甲红霉素，Grepafloxacin、左氧沙星、美罗培南、Sparfloxacin、Synercid、Trovafloxacin、链霉素筛网和庆大霉素筛网的实验。必须用混悬或提升法准备接种物。

11. 最新鉴定系统尚无法使用固定接种物法。必须用混悬法，提升法或Log相准备接种物。

12. 检测细菌动力和色素产物可区分耐万古霉素的屎球菌和E.gallinarum，更多信息，请参阅微生物手册或需氧革兰阳性微生物编码册的附加实验表。

13. 一些抗微生物剂的质量控制范围与NCCLS M7-A4文件中表3列出的NCCLS允许的质量控制范围不一致。特殊信息请参阅质量控制表。

14. 从喹啉类（如环丙沙星），林可酰胺类（如克林霉素）和大环内酯类（如红霉素）获得某些葡萄球菌的最小抑菌浓度是依赖培养基的。用提升系统获得的最小抑菌浓度可能比以标准混悬培养基法获得的高。如果是用提升系统得到的中间化结果，必须用混悬法确定。

15. 培养基和琼脂稀释实验可能无法检测产β-内酰氨酶的肠球菌株对青霉素和氨苄西林的耐药性。这些菌株的耐药性最好用直接依据nitrocefin的β-内酰氨酶试验来检测。

16. 对于Microscan干性革兰阳性板是否能检测L单核细胞增多性李司特菌对万古霉素的耐药性尚不清楚。因为耐药菌株在对比实验中检测不到。

17. 对于Microscan干性革兰阳性板是否能检测β溶血性链球菌对Trovafloxacin和Grepafloxacin的耐药性尚不清楚。因为耐药菌株在对比实验中检测不到。

18. 与参考微稀释法比较，提升系统提高了葡萄球菌的Trovafloxacin最小抑菌浓度。培养物浓度对于该抗微生物剂-微生物组合物及其它有关喹啉类的抗微生物剂组合物都是关键的。如果得到中间或耐药的结果，必须用另一种方法获得易感性结果（如用一种非转效点格式的混悬法）

19. 提升系统用于生长更快的革兰阳性球菌。请参阅提升接种操作程序指南以合理使用该系统。

20. 由于Synercid对粪肠球菌无活性，对肠球菌株务必特殊处理。

错误结果

NCCLS 标准M7-A4指出：如果某种抗微生物剂用于特殊微生物实验，就可能出现危险的错误结果。对于肠球菌，这些抗微生物剂，包括头孢菌素、氨基糖甙类（除测耐药性的高浓度实验）、克林霉素和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑。对于李司特菌属，这些抗微生物剂包括头孢噻吩。若出现以上抗微生物剂-微生物组合，Microscan数据管理系统将只报道最小抑菌浓度，而不进行解释。

期望值

若需了解生化底物的期望值，请参阅需氧革兰阳性微生物的Microscan生物型编码册中或微生物指南中的百分表。

特点

1. 鉴定

操作过程要求Microscacn干性革兰阳性2型板用于多中心研究。临床分离株及储存株在2型ID板上及用传统试管方法的实验，用于代替除常规临床实验室以外的细菌类型。详细内容请参阅Microscan系统微生物信息手册（第四部分：干性革兰阳性菌2型ID板），其完整列出了数据库中的生物。

干性革兰阳性菌2型ID板微球菌科的结果与75%的分离株的种类水平相一致。仅5.6%的分离株需要附加实验以确定种类水平鉴定的低可能性。

干性革兰阳性菌2型ID板链球菌科的结果与91.3%的分离株的种类水平相一致。仅14.3%的分离株需要附加实验以确定种属水平鉴定的可能性及4.4%的分离株需要附加实验以确定类别水平鉴定的可能性。

2. 抗微生物剂

Microscacn干性革兰阳性2型板在几个临床实验室中的到了升级。表1和表2中的抗微生物剂Microscacn干性革兰阳性2型板上实验的，并且用混悬培养基法及手工辨认。这些结果与微稀释MIC系统法比较是相当的。

为了确定1993年12月以后可用于Microscacn干性革兰阳性2型板的抗微生物剂，表2列出了它们的最初和最终效果。

表1

参考方法的一致率

抗微生物剂	试验数	MIC	分类
阿米卡星	101	99
阿莫西林/克拉维酸	350		98
氨苄青霉素/舒巴坦	302	98	100
头孢孟多	404		96
头孢唑林	324		100
头孢噻肟	313		100
头孢唑肟	324	99	100
头孢曲松	300		99
头孢呋辛	324		100
头孢噻吩	170	93	94
氯霉素	170		97
环丙沙星	350		100
克林霉素	170	100	100
红霉素	170	99	98
庆大霉素	170	100	100
亚胺培南	350		98
硝基呋喃妥英	170		100
诺氟沙星	170		100
氧氟沙星	376	99	99
苯唑西林	217	97	98
青霉素	170	91	95
利福平	350		99
磺胺甲异恶唑	354		99
四环素	170	90	97
替卡西林/克拉维酸	300		99
甲氧苄啶/磺胺甲恶唑	170		100
万古霉素	170		99

表2

参考方法的一致率

抗微生物剂	测试数目	最初％			最后％
		MIC		明确	MIC	明确
氨苄西林	338	94.7		98.8	97.6	98.5
阿齐霉素 MIC大小 阈值大小	356 356	97.5 --		98.6 98.6	98.9 --	99.7 99.7
头孢吡圬 MIC大小 阈值大小	613 613	90.7 --		94.6 91.4	93.6 --	95.5 92.0
甲红霉素 MIC大小 阈值大小	535 535	94.6 --		97.0 92.0	95.9 --	97.6 92.1
Gatifloxacin	462	96		97	--	--
庆大霉素协同	342	--		98.0	--	99.1
美罗培南 MIC大小 阈值大小	320 320	95.9 --		97.5 89.4	97.2 --	98.1 89.4
Moxifloxacin	500	99		98
呱拉西林/Tazobactam MIC大小 阈值大小	385 385	95.6 --		99.0 98.7	97.7 --	99.5 99.2
司帕沙星 MIC大小 阈值大小	320 320	98.1 --		99.7 94.1	98.4 --	99.7 94.1
链霉素协同增效实验	342		--	97.7	--	98.8
Synercid MIC大小 阈值大小	255 255		98.0 --	99.8 99.8	98.4 --	99.8 99.8

参考文献：略

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