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MicroScan®干性革兰氏阴性细菌鉴别ID 2检测程序手册
准备使用的用户
为了MicroScan®干性革兰氏阴性菌鉴别ID 2 接种板的使用。
MicroScan®接种板为检测鉴别需氧型革兰氏阴性细菌和兼性厌氧型革兰氏阴性细菌的种类而设计的。
概要和原理
改良的常规试验和产色试验用于鉴别发酵型和非发酵型革兰氏阴性细菌。鉴别的基础是依靠检测pH的变化、底物的利用和细菌存在的条件下经35℃培养16-42小时后的生长状况。
注意事项
1． 仅用于体外诊断。
2． 在整个操作过程中，遵守无菌技术和已经建立针对有关微生物危险的注意事项，尤其注意的是接种板含有潜在性的致病微生物。
3． 所有材料在处理之前应高压灭菌。
贮存
MicroScan®干性革兰氏阴性菌鉴别ID 2接种板贮存在2-30℃。
产品损坏
产品存放在非推荐的贮存环境可能导致抗微生物剂失效和生化试剂失色。不要使用过期的产品。
标本收集和准备
按照临床微生物学手册推荐的操作程序，收集、转运标本，并将标本放置于原代分离物培养液中。
程序
提供的试剂
MicroScan®干性革兰氏阴性菌鉴别ID 2 (B1017-27)
所需要的但未提供的材料
0.5 McFarland硫酸钡混浊标准液
0.5% N,N-甲基-α-萘氨，30ml（B1010-45A）或250ml（B1015-45）
0.8%对氨基苯磺酸，30ml（B1010-44A）或250ml（B1015-44）
0.85% 高压灭菌生理盐水，3ml
10μl或100μl一次性无菌吸头的吸移管仪或10μl 测量环
10%三氯化铁，30ml（B1010-48A）或250ml（B1015-48）
40%氢氧化钾，30ml（B1010-43A）或250ml（B1015-43）
5%α-萘酚，10ml（B1010-42）或30ml（B1010-42A）
心脑浸液（BHI）培养基，0.5ml（B1010-30A）或4ml
覆盖盘（B1010-56B）
一般实验室设备
Ｄ－接种仪器（B1013-4）
接种水，3ml（B1015-2）
带有PLURONIC®商标的接种水，25ml（B1015-7）
Kovac’s试剂，30ml（B1010-41A）或250ml（B1015-41）
手册报告表，
MicroScan®革兰氏阴性细菌生物编码手册（B1010-66D）
矿物油，60ml（B1010-40）
矿物油，250ml－仅用于WalkAway®系统／仪器和WalkAway®S覆盖物（B1010-40A）
氧化酶试剂
人工接种板记录表（仅用于人工阅读结果的记录）
PromptTM接种系统（B1026-10D）
质量控制微生物（参看本手册目录编号的质量控制部分）
质量控制报告表MicroScan®干性革兰氏阴性菌鉴别ID 2 (B1017-27)
Reagent Dropper 试剂盒（B1013-12A）
RENOK®水化器／接种器（B1018-14）或同类仪器
封条（B1010-51）
浊度测量计（B1018-66）
Vortex 震荡器
WalkAway®系统条形码标签（B1011-16）
WalkAway®盘盖（B1011-18）
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Neg ID Type 2
鉴定底物 简写 鉴定底物 简写 |
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葡萄糖 GLU、 3-羟基丁酮从丙酮酸钠 VP
蔗糖 SUC、 半乳糖苷酶 ONPG
山梨醇糖 SOR、 柠檬酸 CIT
棉子糖 RAF、 丙二醇 MAL
鼠李糖 RHA 酒石酸、 ACE
阿拉伯糖 ARA 乙酰胺 TAR
肌醇 INO 氧化－发酵 OF/G
核糖 ADO 硝酸盐 NIT
密二糖 MEL 十六烷三甲基溴化胺 CET
尿素 URE 青霉素 P4
硫化氢 H2S 卡那霉素 K4
吲哚 IND 粘菌素 Cl4
赖氨酸 LYS 头孢菌素 Cf8
精氨酸 ARG 呋喃旦啶 Fd64
鸟氨酸 ORN 妥布霉素 To4
色氨酸脱氨酶 TDA
七叶灵水解 ESC |
程序操作概要
A. 接种板的准备
1. 从贮存处取出接种板。如有下列任何一种情况发生，不要使用接种板：
a. 干燥剂缺少或破损
b. 接种孔的颜色消失（如DCB孔或多种抗生素孔）
c. 包装受损（拆封、刺破或撕裂）
2. 打开包装袋，取出接种板。如果贮存在冰箱中，立即从锡箔包装袋中取出。接种板在复水前应平衡到室温。干净的覆盖盘可放在接种板上面。所有打开的接种板应在当天利用，否则丢斥。
B. 接种物品的准备
（注意：参看操作程序局限性的第9和10项）
NCCLs推荐通过菌落计数定期检测接种菌落的浓度。参照NCCLs资料M7-A４。预期结果大约为3-7×105CFU/ml。
1. 混浊标准液技术－原代接种方法
推荐使用混浊标准液技术直接接种所有的需氧型革兰氏阴性细菌。
a. 在培养18-24小时的非抑制型琼脂接种盘上，利用无菌的木制接种棒或细菌接种环在菌落表面涂抹外形相似的4-5个大的或5-10个小的菌落。
b. 接种在3ml的接种水（高压灭菌的蒸馏水）中。最终的混浊度相当于0.5McFarland硫酸钡标准液的。盖紧塞子。
c. 震荡悬浮液2-3秒。
d. 吸取0.1ml（100μl）标准悬浮液放入25ml PLURONIC®接种水。旋紧盖子，倒置8-10次混合。
２．快速系统（Prompt Systrm）
快速系统可用于接种革兰氏阴性菌。为了正确应用快速系统，请参看快速接种操作程序手册。
３．对数期技术
对数期技术是指在稀释到所需浓度之前将细菌悬浮液放入相当于浊度为0.5McFarland的硫酸钡标准液中。本技术推荐用于生长相对缓慢的细菌或延迟到达的标本。
a. 在非抑制型琼脂接种盘上，利用消毒的木制接种棒或细菌接种环从培养18-24小时的的菌落表面涂抹外形相似的4-5个大的或5-10个小的单孔菌落。
b. 接种在4ml的BHI培养基，并在35℃下培养2-4小时。这就是所称谓的细菌悬浮液的对数期。
c. 培养后，在接种前反复震荡悬浮液2-3秒。
d. 利用BHI培养基将对数期悬浮液稀释到混浊度相当于0.5McFarland硫酸钡标准液。
e. 吸取0.1ml（100μl）标准悬浮液放入25ml PLURONIC®接种水。旋紧盖子，倒置8-10次以便混合。
４．静止期技术
静止期技术可用于生长快速的革兰氏阴性细菌
a. 在非抑制型琼脂接种盘上，利用消毒的木制接种棒或细菌接种环从培养18-24小时的菌落表面涂抹外形相似的4-5个大的或5-10个小的单孔菌落。
b. 接种在0.5ml的BHI培养基。旋紧塞子。
c. 震荡悬浮液2-3秒。
d. 旋松试管塞子，在35℃下培养4-6小时
e. 培养后，在接种前反复震荡悬浮液2-3秒。
f. 如果培养后培养基混浊，吸取0.1ml（100μl）标准悬浮液放入25ml PLURONIC®接种水。旋紧盖子，倒置8-10次以便混合。
Ｃ.氧化酶试验
在接种接种板之前，作氧化酶试验。在记录表的适当位置或按照说明记录结果。推荐的氧化酶试剂是四甲基－p－次苯基联胺－二氢氯化物。
D.接种板复水／接种
利用带有D－接种器的RENOK®系统进行复水和接种。参照RENOK®操作手册进行。如果采用其它系统，用115±10μl接种水（PLURONIC）复水。接种孔的最终细菌浓度应达到3-7×106CFU/ml。为确保被检测细菌的活度和纯度，准备一个盛放血琼脂的纯净接种皿，将接种物在上面划痕，并培养16-20小时。如果两种或以上类型的菌落生长，则重新分离菌落和测试。
E.生化试剂覆盖
1. 利用滴瓶，用三滴矿物油覆盖葡萄糖、尿素、硫化氢、赖氨酸和DCB。（这些接种孔在接种板中有底画线）。
2. 接种孔中的培养液必须完全被矿物油覆盖，但不要溢出接种孔。
注意：WalkAway®系统／仪器（并且WalkAway®仪器已升级到矿物油自动覆盖的特性）自动将矿物油覆盖到适当的接种孔。
F.封条
仅用于氧化酶阳性的微生物。将封条覆盖在CIT、MAL、ONPG、TAR、ACE、CET、OG/G、OF/B和DCB孔。封条中的四分之一英寸的定位孔应当与DCB孔排成一行。对WalkAway®系统，盖子取代封条。
G.培养
1. 确保在培养过程中温度分布均匀，将接种板迭放成3-5组。
2. 为了防止蒸发，将干净的覆盖盘放在每组接种板的表面。覆盖盘可以反复利用。不要用酒精消毒覆盖盘。可用肥皂去污，用水冲洗，空气风干。
3. 接种板在不含二氧化碳的培养箱中培养至少16小时。
H．阅读接种板
利用MicroScan®微量观察仪人工阅读接种板，并将结果记录在人工接种板记录表上或MicroScan®观察测量仪器上（touchSCAN®-SR、autoSCAN®-4、WalkAway®-系统）。参照合适的操作手册，运用MicroScan®观察测量仪阅读接种板。
1. 培养16-20小时后，从培养箱中取出接种板。
2. 用祛除棉花的薄纸将接种板底部存在的任何凝露或碎片擦掉。
3. 仅在生长孔发生混浊时，阅读接种板。如果对照孔混浊或者生长孔没有生长，孔中央呈白色纽扣状或整孔呈细颗粒状生长。细菌生长不足或不生长表现为孔呈轻微白色状或培养液清亮。
4. 如果人工阅读结果，将结果记录在适当的记录表上。
5. 阅读鉴别底物
a. 除了十六烷三甲基溴化胺和抗生素用于鉴别底物（青霉素、卡那霉素、粘菌素、头孢菌素、呋喃旦啶、妥布霉素）在黑色（间接光照）背景下阅读外，其它所有鉴别底物在白色背景下阅读。
b. 葡萄糖发酵菌－ 培养16-24小时后，如果葡萄糖呈强黄色，这种细菌是一种葡萄糖发酵菌，并且应当阅读24种葡萄糖发酵菌试验。如果葡萄糖反应呈橙色或红色，这种微生物葡萄糖非发酵菌。有些非发酵菌种类可产生金黄色，应当视为阴性。有些变形杆菌如在覆盖矿物油后在含有葡萄糖孔中并不生长，但可发酵蔗糖（SUC）和（或）山梨糖醇（SOR）。如果葡萄糖孔不生长并且蔗糖和（或）山梨糖醇反应阳性，应当视为是葡萄糖发酵菌。
c. 葡萄糖非发酵菌－葡萄糖非发酵菌在培养16-24小时后可被阅读，如果下列任何一个联合试验呈阳性：（１）精氨酸与氧化－发酵／葡萄糖（OF/G）或者精氨酸与十六烷三甲基溴化胺，（２）赖氨酸，或（３）鸟氨酸。如果所有这些反应呈阴性并且在生长孔发生生长，记录被用于鉴别底物的最低抑菌浓度（MIC）、十六烷三甲基溴化胺和抗生素。在作最后阅读和鉴别底物时，应再培养24小时。
d. 再培养后，如果微生物仍不发生反应，检查确保微生物在含有酚红的碳水化合物已经生长（尤其是，如果在Mueller-Hinton生长控制培养基生长差或不生长）。如果在含有酚红的碳水化合物中不生长，应当怀疑是生长条件苛刻的微生物如嗜盐弧菌或耶尔森氏鼠疫杆菌，这些细菌在25℃生长最好。或者是变形杆菌／放线杆菌。革兰氏染色应当重复进行，确定是革兰氏阴性菌。
如果怀疑是嗜盐弧菌，将几个菌落接种在3ml 0.85%无菌生理盐水中。最终混浊度应相当于0.5 McFarland硫酸钡浑浊标准液。利用RENOK®系统用25ml未接种过的PLURONIC接种水对接种板复水。用无菌转移管滴加一滴（40-50μl）生理盐水悬浮液到每个鉴别底物孔包括生长孔、黏菌素、头孢菌素孔。接种板在35℃培养16-24小时。
e. 在阅读前，滴加如下试剂：
1) 在福格斯－普罗斯考尔试验（VP）孔滴加一滴40%氢氧化钾，然后再滴加一滴5%萘酚。至少20分钟后，等待VP 反应。
2) 滴加一滴10%三氯化铁到色氨酸脱氨酶（TDA）孔 。立即发生颜色变化。
3) 滴加３滴MicroScan®Kovac’s试剂到吲哚（IND）孔。立即发生颜色变化。
4) 对所有质量控制（QC）和临床非发酵菌孔，滴加一滴0.8%对氨基苯磺酸，然后再滴加一滴0.5% N,N-甲基-α-萘氨到硝酸盐（NIT）孔。至少５分钟后，观察硝酸盐发生反应。
f. 参看结果部分中的生化解释部分。 | 
