[转发]影响FAME全自动酶免分析系统检测因素探讨

朱阳泉徐长根戴瑞娣 胡乔
作者单位：212001 江苏省镇江市中心血站

作者简介：朱阳泉(1967-)，男，江苏镇江人，主管技师，本科，
主要从事输血传播疾病和血型研究。电话：0511—5021106，E-mail：yangquanzhu@yahoo corn．

【摘要】 目的探讨3种常见的影响全自动酶免分析系统检测结果的因素，提高EI ISA法检测结果的准确性。方法(1)随机选择对照组和实验组各44份无偿献血者血样，分别进行两种不同方式的抗凝，应用FAME全自动酶免分析系统进行HBsAg、抗一HCV、抗一HIV、TP 4个项目检测，比较两组检测结果。(2)在全自动加样仪的加样高度设置中，不断增加加样高度，观察FAME对4个质控血清平行孑L的检测效果。(3)在不同温度的FAME洗液下，对88份正常的无偿献血者血样进行4个项目检测，观察不同温度的洗液对检测结果的影响。结果 (1)除抗一HCV外，实验组中其他3项检测结果均有假阳性出现，且阴性标本的S／CO值明显高于对照组(P<O．001)。(2)当加样高度低于9．1 mm时，抗一HCV有假阴性出现，4项检测的CV值均较高，均一性差。(3)洗液温度低于l4℃时，除抗一HCV外，其他3项检测结果有假阳性出现，CV值较高，均一性差。结论标本的抗凝效果、全自动加样仪的加样高度和洗液温度对全自动酶免检测结果均有影响，只有在血样充分抗凝、加样高度和洗液温度适当等条件下，才能获得准确的检测结果。
【关键词】FAME全自动酶免系统 EI ISA 影响因素
【中图分类号】R446．1 R446．61 【文献标识码】A 【文章编号】l671—2587(2004)04—0254—03
Study of the influential factors on ELISA using the microlab FAME system ZHU Yangquan，X Changgen，DAI Ruidi，
et a1．Zhenjiang Blood Center of Jiangsu Province，Zhenjiang 212001
[Abstract] Objective To study the three types of common factors which influence the results of the microlab FAM E system on EI ISA．M ethods (1)There were 44 random samples in experimental group and control group respectively，which were anti—curdled in different levels．Then FAME was used tO test HBsAg。anti—HCV，anti—HIV and TP respectively and the difference between the two groups were compared．(2)W hile increasing the dispensing height of the AT plus 2 in series on the basis of original default，the effects caused by them were assayed after using FAME through four items of parallel quality—controlled sera．(3)The results were detected using FAM E under the different temperature of wash solution，through 4 items of EI ISA on 88 samples of normal voluntary donors．Results (1)In the experimental group ，fault positive results emerged in three items except anti—HCV ，and the S f Co of negative samples was much higher than that i,I control group (P< 0.001)．(2)W hen dispensing height was lower than 9.1 mm ．fault positive results emerged in anti-HCV ，and the CV of four items were higher than norma1．(3)W hen the wash solution temperature was lower than l4℃ ，the fault positive results emerged and CV were higher than usual except anti—HCV．Conclusion The accurate resuits can be gained only when the blood samples were anti—curdled thoroughly，the dispensing height and the wash solution temperatures were suitable．
[Key words] Microlab FAME system ELISA Influential factors

近年来，很多采供血机构相继引进了全自动酶免分析系统用于酶联免疫吸附试验(ELISA)检测，全自动酶免检测设备在过程处理的速度、准确性精密度和重复性方面均优于手工操作。本站于1999年引进FAME全自动酶免分析系统及配套AT plus 2全自动加样仪，在使用中发现，除了检测试剂本身的稳定性、灵敏度和特异性等因素影响检测结果外，很多操作方面的问题，如样本抗凝处理、加样高度设置及不同洗液温度等环节都会对检测结果的准确性造成不同程度的影响，甚至得到假阳性或假阴性结果，现报告如下。

材料与方法

1 仪器与试剂DL一5低速离心机(上海安亭科学仪器厂)；AT plus 2全自动加样仪及FAME全自动酶免分析系统(瑞士HAMILTON公司)；FAMEV2．1C和AUSLAB V2．5应用软件由北京AUS—BIO公司提供；HBsAg、抗一HCV、抗一HIV、TP等4种免疫检测试剂盒由厦门英科新创科技有限公司提供，均在有效期内使用。操作程序的编制严格按试剂盒说明书要求进行，4个项目的室内质控血清由卫生部临床检验中心提供，浓度分别为HBsAg 1ng／ml、抗一HCV 2 NCU／ml、抗一HIV 4 NCU／ml、TP 2 NCU／ml，批号0309。

2 方法
2．1 样本抗凝方法对检测结果的影响：将88份无偿献血者血样随机分为两组，对照组和实验组各44份，对照组血样(m1)和肝素(u)的比例为1：10，实验组血样(m1)和肝素(U)的比例为1：2。室温下，两组血样经3 000 r／min离心5 min后均有较好的分层，血浆呈液态，肉眼观察两组血样无区别。分别在HBsAg、抗一HCV、抗一HIV和TP等4项ELISA检测项目的酶标板上设空白对照2孔、阴性对照3孔、阳性对照2孑L、质控1孔，其余88孔用于两组血样的检测。若检测结果为阳性，重新取样后用相同试剂双孔复测，若双孔均为阴性，则确定原检测结果为假阳性。
2．2 加样高度设置对检测结果的影响：在AT plus 2容器参数编辑过程中，精确测量酶标板的孔径和高度，并进行加样定位，确保12根一次性加样针均在对应微孔的中央。在加样程序编辑中，加样步骤及加样体积按试剂说明书要求进行，加样高度在软件缺省值(8．1 mm)的基础上分别增加0．5、1．0、1．5、2．0和2．5 mm。检测样本用4个室内质控血清替代，各项试验平行检测2孔，对照用手工加样，保证CUT OFF值计算准确。观察检测结果是否有假阴性及原始OD值的变异系数(CV)。
2．3 洗液温度对检测结果的影响：用10℃蒸馏水对浓缩洗涤液进行20倍稀释，充分混匀，待完全溶解后加入FAME洗液桶，并用37℃水浴箱分别对其水浴加热至14℃、18℃、22℃ 、26℃后用于检测。
样本选用88份正常的完全抗凝的无偿献血者血样，为降低因试剂造成的误差，4个项目在不同洗液温度下的检测均采用同一批号的试剂，于2周内完成。观察检测结果是否有假阳性及原始OD值的变异系数。

3 统计学处理采用t检验。
结 果

1 不同抗凝条件下的两组血样经FAME处理后的4项检测结果见表1。实验组4个项目的检测结果中，除抗一HCV外，其他3个项目均有阳性结果出现，经双孔复测后为阴性，表明均为假阳性，两组阴性结果的S／CO值比较，除抗一HCV外，其余3项的差异均有显著性(P<0．001)。


2 不同加样高度下，4种质控血清的检测结果见表2。在5种加样高度中，前3种加样高度(含缺省值)对检测结果影响较大，尤其是抗一HCV检测，有假阴性结果出现。当加样高度大于9．1 mm时，对4项指标的影响较小，CV≤15 。


3 不同温度的洗液对4项EILSA检测结果的影响见表3。88份正常血样标本中，抗一HCV的检测结果在不同温度洗液下差别不大，未出现假阳性，表明洗液温度对抗一HCV的检测结果影响较小。而另外3个检测项目在洗液温度低于14~C时，结果均一性差，部份标本的s／co值≥1，出现假阳性结果。


讨 论
FAME全自动酶免分析系统克服了手工操作的局限性，避免了人为因素带来的偶然误差，使试验的精密度、重复性、灵敏度、特异性有所提高。但在临床检验工作中，各实验室的实际情况不尽相同，如果对各实验环节进行标准化，排除潜在的影响因素，可以最大限度地降低检测的系统误差。标本处理的质量直接影响检测结果的准确性，收缩良好的非溶血、非脂血，且经过充分离心的血清样本是ELISA试验的理想标本。但在血站日常工作中，ABO正定型、Rh血型等项目的检测往往采用抗凝血样。肝素因抗凝效果好、配制和使用方便而被首选。但肝素抗凝血的稳定性差，随血样保存时间和温度改变而有所变化。当肝素比例不充分或血样保存时间较长时，血浆样本经FAME孵育后会发生部分纤维蛋白析出，在酶标板微孔中呈凝胶状，直接影响检测结果，甚至导致FAME吐板。而抗一HCV因样本用量少(10 ul)，且被多倍稀释，故所受影响不明显。由于FAME为封闭式处理系统，此现象不易被操作者发现。因此，用肝素抗凝血样时，抗凝剂必须充足，标本应尽量在24 h内检测。在加样的准确性方面，加样仪的加样高度设置是重要环节之一。不同厂家生产的试剂中，酶标板的孑L径、高度及精密性都有差异，因此，不同厂家的试剂应具体对待。在加样编程中，加样高度应反复摸索，缺省高度只能作为参考。当加样高度较小时，由于血样表面的张力作用，易在加样针尖形成微小挂珠，导致加样误差，如果加样体积较小，则会发生漏加现象(表2中的抗一HCV)，造成假阴性结果；当适当增加加样高度后，即缩短了加样针尖与微孔底部的距离，挂珠的血样接触到孔底或样本稀释液，在重力和液体表面张力的双重作用下，样本被完全加入微孔中。但加样高度的设置不易过高，应随检测项目而定，过高会导致不同检测项目之间样本稀释液的交叉污染，可能对检测结果造成影响。
恰当的洗涤液温度对保证FAME的洗板效果及检测结果的重复性有重要意义。在无偿献血者标本中，常常会有较多的不同程度的脂血样本，一般认为溶血、脂血样本对ELISA 检测结果影响不大L3 。但经进一步研究后发现，洗液在较低温度下(小于14℃)，FAME的洗板效果明显减弱，阴性样本的检测曲线变宽，严重脂血样本可能会出现假阳性。在寒冷的冬季，当实验室温度低于14℃时，即使采取了升温措施，使实验室温度很快达到预定的室温，但洗液温度的上升会存在严重的滞后现象。因此，有必要对FAME洗液桶进行适当的水浴预温，使洗液温度达到18℃后再用于检测，对保证FAME检测结果的准确性起重要作用。

参考文献
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