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网织红细胞自动化分析与临床应用
网织红细胞(下称网红)是反映骨髓造血功能的重要指标。迄今国内仍多采用显微镜目测法(下称目测法)，可直观细胞形态且不需昂贵设备，不失为诊治贫血的重要实验方法，但操作费工费时，受主观因素影响，计数精确性较差为其不足。近年来，国外多使用自动分析仪代替目测法，无论从实验方法学还是临床应用，均取得了良好效果，本节将对自动化网织红细胞分析技术进展、临床应用简述如下。
一 网织红细胞自动化分析应用进展
㈠ 流式细胞仪在网织红细胞计数的应用
网织红细胞是晚幼红细胞脱核后到完全成熟之间的过渡细胞，由于其胞浆中尚残存嗜碱性物质，在活体染色时可被煌焦油蓝染成蓝色细颗粒或网状物而得名。流式细胞仪(flow cytometer，FCM)的问世，开创了生物细胞研究的新领域， 也为网红计数提供了快速、准确的测试手段，可以通过某些染料(如吖啶橙、派若宁-Y 、噻唑橙）与网红中RNA结合，在FCM 测量时发出特定颜色的荧光， 进行单参数定量RNA，已知在红细胞发育过程中，RNA含量有明显规律性变化，即由原始阶段较为丰富逐渐减低至细胞完全成熟后消失或接近消失。网织红细胞为成熟红细胞前阶段，通过FCM检测RNA可精确表示网织红细胞占成熟红细胞的百分率(RET%)。早在1983年Tanke等就应用FCM行网红计数进行血液病的鉴别诊断和疗效观察取得了满意的结果。Pappas等评价了FCM法与目测法的实验结果，发现前者的测量精度比后者明显提高。
二 网织红细胞计数仪的应用
80年代末期日本东亚电器公司设计和生产的用于网织红细胞计数的新型流式细胞仪Sysmex R-1000，迄今已发展到R-3000型。
与前述的流式细胞仪方法比，主要有两个优点:(1)FCM以派若宁-Y、 吖啶橙、硫磺素T或DioC1 为染料，计数前，标本需要固定和染色，而Sysmex-R 系列网织红细胞计数仪在血液与荧光素直接结合后即可测量。(2)Sysmex-R系列用血量少,一管样本可分别进行自动血液分析仪和流式细胞仪网红计数，它以氩激光束为光源，碱性槐黄O(Auramine O )为染料，与网红内RNA结合后通过波长488nm的激光束时，仪器同时测量前向角光散射密度（Forward scatter）和侧荧光强度（Side scatter fluorescence），前者提供细胞大小的资料，后者显示胞内RNA的浓度，将它们分别作为Y和X两个变量就构成一个二维图像，并由此划分PLT、RBC和RET 的分布
仪器显示出的散点图可以反映网织红细胞的成熟阶段，根据荧光强度，还可将网织红细胞分成低荧光强度网织红细胞（Low Fluorescent Reticulo- cyte 简称LFR）、中荧光强度网织红细胞（Middle Fluorescent Reticulocyte简称MFR ）和高荧光强度网织红细胞（High Fluorescent Reticulocyte 简称HFR）三部分.幼稚的网红显示最强的荧光，反之成熟红细胞极少或没有荧光。
近年来对R系列网织红细胞计数仪的评价文献屡有报道。Tichell等较全面探讨了其性能，证实(1) 精确度高：在正常或高值的网红病例中网织红细胞和红细胞测量CV分别小于 5%和1.5%，但在低比例网红值中，其CV可达14.4%。
㈢ 全自动血液分析仪检测网织红细胞
全自动网织红细胞计数仪的临床应用价值已被公认。但由于其仅能测试网织红细胞，常给临床诊断带来不便。1993年以来，可进行网红计数的血液分析仪相继问世，使血细胞分析仪应用进入了新的阶段，其代表是Coulter Maxm型和Technicon H.3型及CD-3500型，Coulter型采用了两种试剂，一为新亚甲蓝着染红细胞内RNA，另一为"透明"剂使红细胞内血红蛋白溢出，成为"影细胞"减少测试的干扰。处理后的血液在仪器上通过VCS(电导、射频、激光)的原理进行网织红细胞的检测， 该仪器不但能检测有关白细胞、红细胞、血小板的18项测量参数，还可得出RET绝对值、RET%、网红平均体积(MRI)和网红成熟指数(MI)。实验证明其测试结果与FCM法呈高度相关。(r=0.961)
Technicon H.3测试网织红细胞采用另一种原理，先将3μl 血液加入已标准化的染液中孵育15分钟，将仪器转换到网织红细胞计数程序，即可得到网织红细胞的实验参数。包括RET绝对值(网织红细胞计数)、RET%、平均体积(MCVr)、 体积分布宽度(RDWr)、血红蛋白分布宽度(HDWr)、血红蛋白浓度(HCR)、平均血红蛋白浓度(MCHCr)、血红蛋白分布宽度(HDEr)及网织红细胞分类(LFC、MFC 、 HFC) ， 应用Technicon H.3丛玉隆等(1996)对64例正常国人进行了分析其结果见表13-1。 这些指标与成熟红细胞相应指标的综合分析将给临床工作带来何种裨益尚需进一步探讨。
表13-1 64例正常人网织红细胞检测结果
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网织红计数 LFR MFR HFR MCVr RDWr HDWr
(%) (%) (%) (%)
──────────────────────────
x 1.0 86.1 11.3 2.6 111.8 17.75 33.4
s 0.41 4.77 4.14 1.73 5.3 2.35 5.2
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二 网织红细胞计数临床应用进展
130年以前Feb观察到贫血病人的 RBC 中的颗粒并用苦味酸显示了它们， 而后Erhich用亚甲蓝染色后发现了网状结构并建立了网织红细胞目测法，一个多世纪以来这种方法在贫血的诊断、疗效估计、鉴别诊断中的重要作用众所周知，笔者不再赘述。现将仪器法进行网织红计数近年来的临床应用简述如下。
Pappas等报道用FCM和TO可以准确地定量网织红中的RNA，后者与细胞成熟程度呈负相关。因此从仪器分析阳性细胞RNA 分布直方图中可以得到网织红细胞成熟指数(reticulocyte maturation index，RMI)，研究发现RMI虽与网织红计数不相关，但确是指示红系增殖状态的敏感指标，特别是在骨髓移植后恢复期的观察，过去将粒细胞绝对值(ANC)作为早期指标，今发现RMI具有同样的作用而且不受机体某些状态(如临床或亚临床感染)的干扰，更适临床应用。
骨髓移植(BMT)
外周血粒细胞计数增高是移植开始的早期测量依据，但是粒细胞绝对值可能受同时发生的感染或移植排斥反应等影响，预防性输入血小板影响了对移植早期血小板制造的能力监测，因此二者均不理想。网织红细胞计数是一个独立监测骨髓造血恢复的附加参数。第21天RET数>15×109/L，常与移植并发症无相关， 而感染和输血都不会影响网织红细胞计数的趋势。但若<15×109/L并伴随中性粒和血小板的部分上升，可能提示骨髓移植失败。
Lazaruss等分析了骨髓移植后细胞动力学的变化，动态观察了23例自体异体移植患者血小板、中性粒细胞、白细胞、网织红细胞及网织红计数(目测法)在移植后恢复的天数，其结果(均值)分别为16.4天、16.8天、16.2天、13.7天、14.8天，其中10例网织红计数早于其它三项指标。其中两例早于其它指标9天和10 天（分别为31、22、22、13天和19、17、17、9天)，显而易见，网织红细胞计数(FACS)对骨髓移植恢复的估计有一定价值。丛玉隆观察了5 例自体移植网织红细胞数与白细胞数动态变化，结果表明5例移植后网织红细胞均较白细胞提前3～4天恢复。
移植后RET绝对值和RET%产生的波动，并不能完全说明骨髓功能的变化， 比如说要考虑到RBC输入的干扰。RET数单项升高也不意味着造血功能的恢复，RBC 生成正常的情况下,用R-3000/R-2000很难在外周血中查见HFR这样的幼稚的网织红细胞，但造血受到刺激时，较多的不成熟细胞就从骨髓释入外周血，因此HFR 的增长暗示着RBC生成的开始.也就是说，HFR变化较网织红细胞总数变化具有更重要的意义。
Batjer JD等就此得出了深入的结论，他们用R-1000观察了30例异体、8例自体骨髓移植病人移植后44天内各项血液数变化，发现MFR+HFR在13.31天均值开始回升，其次为WBC(14.8天)，仪器法RET绝对值(16.21天)和目测法RET绝对值(16.5天)，提示MFR+HFR是估计移植后造血恢复的早期指标。
J.Kanold等发现，自体、异体移植后HFR的出现（至少两次成功计数达到2%或
0.1×109/L)早于RET绝对值达到20×109/L，也比单核细胞达到0.05×109/L、 RET绝对值达20×109/L，以及中性粒细胞达到0.5×109/L都要早，如图13-7所示。 所以，评估BMT后的红细胞生成情况，HFR计数提供了早期测量依据，同时也比监测单核细胞水平更为精确和实际。
贫血
对骨髓移植患者的研究证实HFR 和LFR 可能是反映造血功能的关键的新参数。Kojima等人在贫血患者也得出同样的结论，以Hb 120～160g/L、MCV 90～100fl 、MCH 27～34pg的患者作为健康组；WBC<3×109/L、PLT<50×109/L 的化疗后红细胞生成抑制者为骨髓抑制组，以慢性溶血性贫血患者为溶贫组，测得的网织红细胞数、HFR及LFR三项参数有力地支持了上述结论.与贫血组相似， 血液透析组HGB为100g/L或更低，HFR上升，LFR下降，但是RET数不升高；因此，可将网织红细胞计数及其分类作为鉴别诊断的初筛指标。老年健康组与健康对照组具有相似的特征，说明这些参数无年龄差异。老年贫血组RET数减少，但RET% 却与健康组相似。上述结论在图13-9中一目了然。图中依次为：健康组、骨髓抑制组、溶贫组、治疗前IDA组、治疗后IDA组、血液透析组，老年无贫血组（70 岁以上 Hb 120 ～160g/L、MCV 90～100fl、MCH 27～34pg）、老年贫血组（70岁以上Hb不足 110g/L且无明显病因的个体）。
放疗与化疗
通过流式法网织红细胞分析可获得骨髓增生特别是红系增生及放、化疗的细胞毒副作用的信息。在造血反应中(如叶酸和Vit B12) 治疗后或化疗后造血恢复中可见网织红细胞短暂迅速的增高。
当HGB下降、组织氧化受阻时，EPO生成增多，EPO 促使干细胞向原始红细胞分化，也加速网织红细胞释放。因此，EPO增加，HFR也增多，并伴有网织红细胞的增多。化疗后骨髓EPO功能恢复早期，HFR增多比网织红细胞总数恢复早，这种反应时间的不同体现了EPO与HFR之间的密切关系。
另有实验表明长期接受Cisplatin化疗的卵巢癌患者网织红细胞计数往往在HGB减少之前上升。Mugurama等应用Sysmex R-1000系统观察了27 例白血病和淋巴瘤患者化疗期间网织红细胞亚群的变化，发现有14例(3.89%)在化疗开始时HFR和（或）MFR早于LFR，中性粒细胞及血小板降低，HFR、MFR与其它参数同时降低为57.2% ，在骨髓恢复期,52.8%的病例HFR和/或MFR迅速升高。WBC、PLT同时升高的仅占25%，提示幼稚网织红细胞变化是造血系统肿瘤化疗时，骨髓受抑制和恢复较敏感指标。
如图13-10所示，抗白血病药物对红细胞生成的抑制使RET绝对值降至几乎为零，HFR显著上升提示着患者进入恢复期。
Kageoka等用R-3000 分析发现末梢血网织红计数优于白细胞计数和血小板计数分析骨髓造血状态。在化疗后，骨髓抑制的恢复早期末梢血HFR升高出现较早， 骨髓RET%高于末梢血的3倍，巨幼贫、MDS或DIC的病人骨髓RET% 均较末梢血有明显的增高。
RMI与RPI
网织红细胞成熟指数（RMI），其计算公式为RMI=(MFR+HFR)/LFR×100，与RET绝对值、RET%、RBC计数和HGB浓度不甚相关，故被认为是独立变化的；其参考值见表13-2。
表 13-2 正常参考值
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RET绝对值(10000/ul) RET% RMI(%)
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男性 3.17-7.69 0.65-1.69 9.1-32.2
女性 2.57-7.50 0.64-1.52 12.8-33.7
总体 2.87-7.50 0.67-1.55 10.3-34.0
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RMI与年龄相关性很小，女性略呈负相关。高RMI可见于溶血性贫血、原发性血小板紫癜(ITP)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和一些急性白血病患者，真性红细胞增多症、再障和MDS患者RMI稍有增高。把健康者分为50岁以上和49岁以下两组，老年组RBC和RET绝对值都较低；老年男性RMI趋于增高。急性白血病、CLL、恶性淋巴瘤、MDS、溶血性贫血、再障、ITP和真性红细胞增多症患者 RMI值范围较宽，上限接近正常者，强抗癌化疗过程中RMI降低。如急性白血病化疗前RET绝对值正常而RMI 较高，化疗中则RET绝对值和RMI都低；溶贫出现溶血危相时RET绝对值和RMI都高；真性红细胞增多症RET绝对值和RMI都低；ITP则RET绝对值正常RMI高。总之， 两指数交叉分析有助于判断红细胞活动度。RMI增高与骨髓移植、慢性溶血、 近期出血或疗效反应相关，RMI降低通常与骨髓衰竭或无效造血有关，如巨幼红细胞贫血(叶酸或Vit B12缺乏)。
三 网织红细胞计数自动化分析的质量控制
㈠ 质控物的选择
前已述及，网织红细胞计数自动化分析快速、准确、省时，是贫血诊断的理想方法。但准确的结果必须有性能良好的仪器保证，除了准确的仪器校正外，良好的质控物随时监测仪器的状态是搞好质控的重要条件，遗憾的是迄今尚未发现此类物质。为此Tsuda观察了保存血网织红细胞变化，用含有ACD保存液的袋子收集10例正常人血液(RET%范围0.5-1.5%)，取血1小时后，用R-1000进行网织红细胞计数,作为基准值，然后4℃保存3周，其间不断进行网织红计数。第7天时， 网织红值是基准值的80%，随后下降速率减慢，第21天时，网织红计数仍为基准值的60%，如果将下降速率转换成log值，回归分析显示两者呈极好的负相关，r=-0.9972，Y=-0. 011X±1.992。作者建议可将贮存血作为校准和监测仪器的物质。
㈡ 抗凝剂及标本贮存时间对结果的影响
为了观察不同抗凝剂及标本保存时间对实验结果的影响。Kazuhide将５份新鲜血分别加入含有EDTA-Na2(15mg/ml blood)、肝素９IU/ml血液或枸橼酸-磷酸盐-糖(CPD: 0.14ml/ml血液)抗凝管中放入室温(EDTA管同时放入4℃)并在取血后0、24、48小时后用R-1000测量网织红值，结果显示室温下保存，CPD管受影响小，24 小时后网织红值减少5%左右，48小时后减少15%。EDTA管受影响明显，24小时、48 小时分别减少28%、40%。不同温度保存的EDTA血液,网织红值也有差异。24、48小时后，4℃保存仅减少4%、18%，室温保存则减少27%和32%。Andre报告室温下的标本， 12小时即有明显下降的趋势，4℃保存血液36小时同测定值基本相同，Fergason 等使用FACS和TO对EDTA-K3抗凝血的研究表明4℃保存，0、24、48小时结果无明显差异
(均值分别为2.67、2.81、2.91)，22℃保存的，24小时后即现增高(分别为1.67、
1.91)。但John的报告相反，4℃贮存血24小时，21℃贮存6小时后， 网织红值明显下降，笔者以为尽管不同文献，不同实验方法表现的结果不同，但贮存血影响测定值是肯定的。因此，及时处理标本，尽早测量对保证实验质量是必要的。
㈢ FACS-TO法染色孵育时间对结果的影响
Fergason证实不同染色孵育时间，测定值不同，随时间延长网织红细胞增加。半小时与1小时之间相差0.21%，虽有差异但无临床意义，而４小时后差异明显，可增加0.49%(1.46%→1.95%)，孵育温度不需严格控制，Van报道37℃孵育1小时， 室温2小时均可得到满意的染色结果。
使用R-2000/R-3000测定不会涉及这个问题，但是对测定环境温度提出了要求。
㈣ 干 扰 物 质 的 影 响
Kojima等探讨了某些物质对R-1000-AO法的干扰作用，提示白细胞增多、 红细胞增多、血小板增多、高胆红素症、高脂血症、部分溶血、部分凝血标本对网织红计数均无影响.
血液中存在抗坏血酸浓度为120mg/ml、维生素B12为20mg/ml、核黄素2 U/ml、deoxyoyoline HCl 20mg/ml、酚红2mg/dl时，网织红细胞测定值分别为4.71 %、3.93%、4.79%、6.02%、5.79%。FACS法使用的TOI是多核苷酸标记物,RNA、DNA 均可被结合，因此含H-J小体、 疟原虫的红细胞及有核红细胞均可与之结合干扰网织红计数（见图13-14）。Van报道白细胞增高、 血小板增多、 巨型血小板存在也可使FACS-TO法出现网织红值阶段性增高.
随着流式细胞仪的使用，特别是临床型FCM的问世，新的荧光素不断出现， 流式法网红计数使用水平不断提高应用更广泛。在我国较大医院的中心实验室甚至检验科逐步普及，流式细胞术将对我国基础医学的发展和临床医学水平的提高发挥重要作用。
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