[转帖]第三节 仪器法血细胞检查

　　前面章节已经介绍了手工操作的血细胞计数方法。可发看出，由于操作地程的随机误差，实验器材的系统误差及测方法本身的固有误差，手工法细胞良数不但费时费力，实验结果的精神桷性、准确性也受影响。50年代初期，美国的库尔特研制了电阻抗血细胞分析仪器开创了血细胞分析的新纪元，随着基础医学的发展、高科技技术的应用，特别是计算机技术的引用，血细胞分析仪的测量水平不断得高，测量参数不断增加。不但得高了医学检验水平，还为临床提供了更多的有用的实验指标，对于某些疾病的诊断与治疗具有重要的临床意义。

　　 一、电阻抗法血细胞分析仪测试原理

　　（一）白细胞分析原理

　　50年代初，库尔特（W。H。Coulter）发避孕药并申请了粒子计数技术的设计专利，其理是根据血细胞埋传导的怀质，以电解质溶液中悬浮的白细胞在通过计数时引起的电阻变化进行检查为基础，进行血细胞计数和体积的测定，这种方法称为电阻抗法，也称为库尔特原理（图2-7）

图2-7 电阻抗法血细胞计数原理

　　把用等渗电解质溶液（被称为稀释液,diluent）稀释的细胞悬液侄入一个不导电的容器中，将小孔管插到细胞悬液中。小孔管是电阻抗法细胞计数的一个重要的组成部分，其内侧充满了稀释液，并有一个内电极，外侧细胞悬液中有一个外电极。检测期间，当电流以接通通后，位于小孔两侧的电极产生稳定的电流。稀释液通过小孔孔管壁上固有的小孔（直径一般<100μm.厚度为75μm左右）向小孔内部流动。因为小孔这壁充满了具有专导性的液体，其电子脉冲是稳定的。如果供给电流I和阻抗Z是稳定的，根据欧姆定期律通过小孔的电压E也是不变的（这时E=IZ）。当有一个细胞通过小孔时，由于细胞的导电性质比稀释液要低，在电路中小孔感应区内的电阻的增加，于瞬间能上能下起了电压变化而出现一个脉冲信号，自然数为通过脉冲。电压增加的变化的程度取决于非传导的细胞占据小孔感应区的体积，即细胞体积越大，引起的脉冲越，产生的脉冲振幅越高，脉冲信号经过下列步骤，得出细胞计数结果。

　　1．放大：由于血细胞通过微孔时产生的脉搏冲讯号非常微弱，不能直接触发计数电路，因此必须通过电子放大器械，将微伏讯号放大为优级脉冲扭号。

　　2．甄别：通过微孔时的各种微粒均可产生相应脉冲讯号，讯号电平（脉冲幅度）与微粒在小成正比。因除血细胞外，血中细胞外，血中细胞碎片、稀释液中杂质微粒均可产生假讯号，使计数结果偏高。所谓甄别就是利用甄别器根据阈值调节器提供的参考电平，将低于参考电平的假讯号去掉，以提高细胞计数的准确性。

　　3．阈值鹿茸：在一定范围内调节参考电平的大小，使计数结果可能符合实际。

　　4．整形：经过放大和甄别后的细胞脉冲讯号波形尚不一致必须经过整形器作用，修整为形伏一致标准的平顶波后，才能触发电路。

　　5．计数：血细胞的脉冲信号，经过放大、甄别、整形后，送入计数系统。各型血液分析仪器计数系统甄别方式不同，通过各种方式得出计数结果。（图2-8）

图2-8 仪器监测屏上显示白细胞通过脉冲

　　目前很多仪器在给出细胞数据结果之外，是时提供细胞体积分布图形，这些可以表示出细胞群体分布情况的图形，称为细胞分布直方图（图2-9）。直方图是由测量通过感应区的每个细胞脉冲累积得到的，是在计数的同时进行分析测量的。如图2-8所示，示波器显示的是所分析的细胞的脉冲大小，图2-9是相应的体积分布直方图，横坐标为体积，纵坐标是血细胞的相对数量，血细胞分析仪在进行细胞分析时将每个细胞的脉冲根据其体积大小分配并存在相应的体积通道中，每个通收集的数据被统计出相对数并表示在“Y”轴上。体积数据以飞机升（fl）为单位，表示在X轴上。

　　在进行白细胞体积分析时，仪器计算机部分可以将白细胞体积从35-450fl 分为256个通道(channal)，每个通道为1.64fl，细胞根据其大小被分别放在不同的通道中，从而得到白细胞体积分布的地直方图。（图2-10）

图2-9 细胞体积直方图

图2-10 三部法血液分析仪白细胞分布直方图

　　经过溶血剂处理后的白细胞可以根据体积大小初步确认其相应的细胞群：第一群是小细胞区，主要是淋巴细胞。第二群是单个核细胞区，也被称为中间细胞（MID），包括单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞，核象左移或白血病可有各阶段幼稚细胞及白血病细胞。第三群是大细胞区，主要是中性粒细胞（GRAN）。仪器根据各亚群占总体的比例计算出各亚群的百分率，如果与该标本的白细胞总数相乘，即得到各类细胞的绝对值。可以看出，电阻法只是根据细胞体积的大小，将白细胞分成几个群体。在一个群体中，可能发某种细胞为主（如小细胞区主要是淋巴细胞），但由于细胞体积间的交叉，可能还有其它细胞的存在。显然习惯上甩称的“三分类、”“二分类”血细胞分析仪达个名称是不够确切的。国外多采用“三部法”（3-part）或“二部法”(2-part)称之。国内也有专家建议使用“三分群”或“二分群”描述电阻抗法血细胞分析仪的白细胞分类。

　　（二）红细胞测试原理

　　根据各项参数在血液分析仪检测原理的不同，检测大致分为三个部分。

　　1．红细胞数和红细胞比积迄今，绝大多数血液分析仪使用电阻抗法进行红细胞计数和红细胞比积测定，其原理同白细胞一样。红细胞通过小孔时，形成的相应的脉冲的多少即红细胞的数目，脉冲的高度代表单个脉冲细胞的体积。脉冲高度叠加经换算即可得到红细胞的比积（有的仪器先以单个细胞高度计算平均红细胞容积（MCV），再乘以红细胞的数得出红细胞比积。）稀释的血液进入红细胞检测通道时，其中含有白细胞，因此，红细胞检测的各项参数均含有白细胞因素，但正常血液有形成分中白细胞比例很少，故其影响可忽略不计，要某种病理情况下，如白血病，白细胞数明显增加而又伴严重贫血时，即可使所得务项参数产生明显误差。根据所测单个红细胞体积及相同体积细胞占总体的比例，可打印出红细胞体积分布直方图。

　　2．血红蛋白测定：任何类型、档次的血细胞分析仪，血红蛋白测定原理是相同的。被稀释的血液的加入溶血剂后，红细胞溶解，释放血红蛋白，后者与溶血剂结合形成血红蛋白衍生物，进入血红蛋白测试系统，在特定波长（一般在530-550nm）下比色，吸光度的变化与液体中Hb含量成比例，仪器便可显示Hb浓度。不同系列血液分析仪配套溶血剂配方不同，形成的血红蛋白衍生物亦不同，吸光度各异但最大吸收峰均接近540nm .这是因为ICSH推荐的氰化高铁法，HICN最大吸收峰在540nm。校正仪器必须以HICN值为标准。大多数系列血液分析仪溶血剂内均含有氰化钾，与血红蛋白作用后形成氰化血红蛋白（注意不是氰化高铁血红蛋白），其特点是显色稳定，最大吸收峰接近540nm，但吸收光谱与HICN有明显的不同。此点在仪器校正时应十分注意。

　　为了减少溶血剂的毒性，避免含氰化的血红蛋白衍生物检测后的污物处理，近年来，有些血液分析仪使用非氰化溶血剂（如SLS-HB）实验证明，形成的衍生物与HICN吸收光谱相似，实验结果的精确性、准确性达到含有氰化物溶血剂同样水平。既保证了实验质量又避锡了试剂对分析人员的毒性和环境污染。

　　3．各项红细胞指数检测原理：同一手工法一样，MCV、平均红细胞血红蛋白量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞体积分布宽度（RDW）均是根据仪器检测，的红细胞数、红细胞比积和血红蛋白量的实验数据，经内存电脑换算出来的。

　　RDW由血液分析仪器测量后获得，是反映外周血红细胞体积异质性的参数。简言之，是反映红细胞大小不等的客观指标。多数仪器用所测红细胞体积大小的变异系数来表示，即RDW-CV，也有的仪器采用RDW-SD报告方式。

　　红细胞通进小孔的一瞬间，计数电路得到一个相应的大小的脉冲，脉冲的高度是由细胞体积大小决定的，不同大小的脉冲的信号分别贮存在仪器内装计算机的不同通道内，计算出相应的体积及细胞数后，统计处理而得RDw 值。由于RDw 来自十几秒内近万个红细胞的检测数据，不但愿可以克服测量红细胞直径时人为制片因素和主观因素等影响，还较P-J曲线更能直接、客观、及时地反映红细胞大小不等程度，对贫血的诊断有重要意义。RDW的正常参考范围见表2-4。

表2-4 RDW正常参考范围

作者	例数	RDW（<1.64SDX）	报告时间（年）
Bassman	229	<13.9
McClure	90	<14.8	1985
Robert	29	<12.1	1985
Marti	61	<48(RCSDW)	1987
丛玉隆	81（儿童） 70（成年） 60（老年）	<14.6 <14.0 <13.8	1990
丛玉隆等	2013	<14.9	1996

　　*为北京协作组六家医院使用五种型号全自动血细胞分析仪调查2013例成人（男1013例，女1000例）RDW结果。

二、血细胞分析仪检测参数的临床意义

　　（一）细胞直方图的应用

　　1．白细胞直方图变化的临床意义，前已述及，在进行白细胞计数时，细胞根据体积大小分配在不同计算机通道中，从而得到白细胞体积分布直方图。反之从图形的变化可以会计被测血液中细胞群体的变化。这种变化细胞图形并无特异性。比如中间细胞群可包括大淋巴细胞、原始细胞、幼稚细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞，其中任何一类细胞的增多，均可使直方图产生相似变化，只是提示检查者粗略者判断细胞比例变化或有无明显的异常细胞出现，进而在显微镜下检查中注意这些变化或在正常人体栓中，筛选是否需要进一步作血涂片检查。图2-11显不的是各种血液学异常时，直方畋的变化，可以看出，尽管引起血液学变化的病因不同、细胞形态变化不同，但直方图型很相似，说明白细胞直方图形变化并无特异性。

图2-11 不同疾病白细胞分布直方图

　　图中横坐标为细胞体积，纵坐标为细胞相对数量，黑色区域是正常细胞分布图

　　（a）来自末梢血淋巴细胞增多（其中大颗粒淋巴细胞占42％） （b）为急性非淋巴细胞性白血病（M₂）（其中幼稚细胞占72％）的图形 （c）为急性淋巴细胞白血病（L₂）（幼稚细胞63％）的图形

　　另外，白细胞直方图的变化也可反映某些人为的或现变化扰白细胞计数和分类计数的情况，比如外周血出现有核红细胞或巨大血小板，采血时由于技术大兵在造成血小板聚集或某些病理因素使红细胞膜对溶血剂有抵抗作用，使红细胞溶血不完全，以至测检标本中大量红细胞膜碎片等情况，均可使白细胞直方图在50fl以下区域出现一个或大或的小峰。因此当实验结果出现这种图形时，提示白细胞计数和分类计数均不准确，需在采取相应的手段进一步检测。

　　2．红细胞体积直方图的临床意义：与白细胞直方务图意义不同，某些贫血红细胞体积直方图的其特点，此种图形变化再结合其它参数进行分析，对鉴别诊断颇有价值。分析时，要注意观察图形的位置，峰底的宽度、峰顶的形态及有无双峰出象。

　　下面介绍几种贫血时图形变化：

　　（1）缺铁性贫血的直方图（2-12A）：其特点为曲线波峰左移，峰底变宽，显示小细胞不均一性。

　　（2）轻型β-血红蛋白合成障碍（β-珠蛋白障碍性贫血）的直方图图形表现为小峰左移，峰底变窄，典型的小细胞均一性贫血。

　　（3）铁粒幼细胞性贫血的直方图显示红细胞呈典型的“双形”性改变（即同时存在着两类型的红细胞，一种是低色素红细胞，另一种是正常形态的红细胞）多见于铁粒幼细胞性贫血。在缺铁性贫血经治疗有效时，也可出现类似的图形，但峰底要更宽些。

　　（4）顺酸缺乏引起的巨连续剧细胞性贫血治疗前与治疗后的直方图治疗前直方图波峰右移，峰底增宽，显示明显的大细胞不均一性，是叶酸或维生素B₁₂缺乏引起巨连续剧细胞性贫血的重要直方图特征。给予叶酸或维生素B₁₂后，幼稚细胞分化成熟正常，正常红细胞逐步释放入血液，而病理细胞并完全消亡，检测时即再出现双峰形，说明治疗有效。

　　应该指出，不同型号仪器其特点及使用稀释液不同，红细胞直方图的形态亦异常，但反映病理变化基本特征是相同的，不同实验室应根据本室仪器的图形进行对比分析。

　　3．血小板直方图的变化：血小板测量结果是根据血小板直方图得出的，微机根据直方图形态，绘出拟合曲线，决定大血小板数目的补偿并计算MPV、PCT、PSW各项参数。当测标本中小细胞增多或出现细胞碎片或血小板凝聚时影响实验结果，血小板体积直方图均能反映这些变化。因此在发出血小板报告之前，首先要观察其图形是否正常，如为异常的图形（见图2-13），均为检查血液是整流器有血小板凝聚，必要时作血涂片检查是否有小红细胞或大血小板增多现象。

图2-12 不同类型贫血红细胞体积分布直方图 （图中横会标是细胞体积（fl），纵坐标代表红细胞相对数量。黑色区域是正常图形） （A）缺铁性贫血图形 （B）轻型珠蛋白生成障碍性贫血 （C）铁粒幼细胞贫血图形 （D）、（E）治疗前后巨幼细胞性贫血图形

图2-13 不同情况血小板体积直方图 图中横坐标为血小板体积（fl）纵坐标代表血小板相对数量，黑色区域是正常图形 （a）标本中含有大量红细胞碎片引起图形变化 （b）标本中有多数血小板聚集 （c）由于标本中小红细胞增多所致

　　（二）RDW的临床意义

　　1．鉴别缺铁性贫血和β-珠蛋白生成障碍性贫血，由于Hb合成障碍，缺铁性贫血和轻型β-珠蛋白生成障碍性性贫血均可表现为小细胞低色素性贫血，但前者红细胞形态明显小于不等，后者形态大小较为均一。Bassman曾分析了两类贫血患者的RDW变化，发出53例缺铁性贫血RDW全部增高（异常率为100%），而44例轻型β-珠蛋白生成障碍性贫血中38例中RDW正常（正常率为88%）他认为RDW可作为此两类贫血筛选及鉴别指标。

　　2．诊断向导铁性贫血：鉴于95%以上的缺铁性贫血的RDW均异常，一般认为，如果患者血液检查表现为小细胞低色素性贫血而RDW正常，此类病人患缺铁性贫血的可能性不大。

　　3．进行贫血的新形态学分类（MCV/RDW分类）根据不同病因引起的贫血的红细胞形态特点不同，Bassman（1983）观察各种贫血红细胞参数变化，提出了MCV、RDW贫血分类法（见表2-5）将其分成六类。实践症明：这种分类方法更能反映贫血的病理变化对贫血的鉴别诊断有一定参考价值。

表2-5 MCV、RDW 贫血分类法

MCV		减低	正常	增高
RDW	正常 异常	小细胞均一性 小细胞不均一性	正细胞均一性 正细胞不均一性	大细胞均一性 大细胞不均一性

　　（三）血小板测量参数的临床意义

　　1．涸小板各项参数的正常参考范围：有文献报道国内2013例正常人成人血小板计数参考范围大致为（100-300）×10⁹/L，而MPV和参考值并非一个统一的范围。Bassmen测量683例年龄为20-34岁正常人积压小板数和MPV值，发现人种及性别间无显明差异，但MPV的正常范围地随群体中不同血小板数量而变化的，根据检测结果设计了一个关于血小板数和血小板体积的列线图（见图2-14），用于分别估计每个人的结果是否异常。

图2-14 血小板数与MPV的关系

　　2．血小板各项参考测定的临床意义

　　（1）血小板计数的临床意义：见第三章

　　（2）MPV变化的临床意义：各种疾病PLT 与MPV可出现以下几外方面结果：1）血小板数低而MPV增升高：骨髓自身正常，但外周血血小板破坏增多造成血小板降低的刺激后反应性增生时，巨核细胞DNA倍体数及细胞大小都增加， MPV也增高。由于骨髓受抑制而造成血小板减少的病人在恢复初期MPV也升高，这主要因外周血血小板数减低应激性地致使巨核细胞倍体数增加所致。

　　2）血小板数高、MPV正常：骨髓增生性疾病如血小板增多，红细胞增多但MPV正常。

　　3）血小板数与MPV值均下降：AIDs （艾滋病）病毒直接影响巨核细胞并导致血小板减少。大约2/3的病人血小板数降低，92%的病人MPV值下降，与骨髓受抑时的血小板状态相似。患发育不良性贫血的病人积压小板数通常都降低，其MPV值也低，但 PDW升高。当骨髓纤维化或被脉冲瘤细胞浸润危及正常造血时，血小板数减少，随即MPV值也降低。再生障碍性贫血，骨髓瘤或白血病化疗后，败血症所致血小板沽少等骨髓受抑性疾病中，虽然仍可能有一些大血小板，但血小板的平均体积减小。

　　4）MPVE值与血小板数都升高：反应性血小板增多症病人中，其MPV值升高，因血液的流失和本内损伤造成的急性大失血都可使血小板值上升。

　　5） MPV值升高而血小板正常：慢性髓细胞性白血病、骨髓纤维化、脾切除均可周到MPV升高，慢性髓细胞性白血病和骨髓纤维化主要使骨髓增生异常，两种疾病中，血小板体积经常增大并大小不均。外周血涂片中可出现大血小板。半数α-型和β-型珠蛋白生成障碍性贫血的患者有4种明显的血液学改变；血小板大小改变、红细胞大小改变、肝珠蛋白改变和对疟原虫抵抗力改变。其MPV值增高而血小板数正常。

　　另外，因为MPV先于 PLT变化，因此，可用于观察病情变化。白血病化疗时，MPV上升是 BM恢复的第一特征。在感染时 Lelie等认为，局部炎症的 MPV正常而败血症中则一半病人有MPV增加；并认为 MPV持续低时，说明存在感染未控制而继续抑 PLT抑生成，如MPV随 PLT数持续下降则为骨髓衰竭的特征。 MPV越小越严重，直到 MPV上升，PLT数才恢复。 Elder每日检测 MPV并观察结果，以了解出血性素质病人的变化，发现有出血倾向者MPV显著低于无出血倾向者，即使严重 PLT下降者，如 MPV>6.4fl，出血发生率也低。Thompson研究结果表明MPV与PLT体外功能之间明显相关，对佼原和凝血酶诱导的PLT聚集，其速度信程度随MPV增加而增加。

　　三、方法学评价

　　白细胞计数及分类有两种方法：一种是显微目视法，一种是血液分析仪方法。显微镜法是基础，血细胞分析仪在要根据显微镜法准确计数结果进行校正后方能使用，但这种计数不同于常规工作进行的白细胞计数，根据统计学研究白细胞计数结果的总变异系数为：

　　（公式中nb为所见实际数目，nc为用计算盘的次数，np为用吸管的次数）。

　　在一个标本中，只有使用多支吸管，使用多次（个）计数盘，计数细胞数量达到一定程度时，才能避免细胞在计数盘分布的固有误差，计数盘和吸管的系统误差和操作随机误差的影响，使计数结果接近真值。一般在进行血细胞分析仪校正时，应使用这种方法。但实常规检验中，目视法很难达一上述在求。由于上述各方面误差的影响，白细胞计数的重复性和准确相对较差。经过严格校正的血细胞分析仪，由于计数细胞多，计数的每个步骤都可标准化，便于质量控制（特别是全自动血液分析仪），计数的精确性、准确性均较高（CV可在2%以下）。这一点在红细胞计数和血小板计数时也是相似的。

　　仪器法白细胞分类有两大类：一类是电阻抗法，这类仪器是根据溶血剂作用后的白细胞大小，人为地分成几个部分，显然这种分类是不够准确的。另一类是利物用各种高科技技术联合对同一白细胞的体积、细胞核形状及胞质中颗粒进行检测，综合分析后，进行细胞分类。这种多方位检测分类法，可较准确地进行白细胞分类，但仍不能准确地检查白细胞形态的病理变化，特别是对幼稚白细胞的检测。因此必须强调，仪器法白细胞分类计数，只能提供正常血液标本（血红蛋白、白细胞数、血小板数均正常）中各种白细胞数目的大致分布情况或为常规工作进一步镜检提供筛选的信息，而决定不能完全代替油浸显微镜下进行的白细胞分灯检查，另外由于目视法与仪器法实验方法的不同，且全自动力血液分析仪多使用静脉血检测，仪器法测定值的参考范围与传统使用的目视法的参考值有所差异，表2-6是近年来国内外文献介绍的静脉血全自动血细胞公析仪的正常参考范围。

表2-6（1） 血细胞分析仪检测静脉血各项参数胡考值

	WBC（109/L）	WCV（FL）	WCH（pg）	WCHC（g/l）	RDW（%）PLT（109/L）
	男 女	男 女	男 女	男 女
周子秋 （台湾1993）	3.9～9.7 3.5～9.1	83～101 80～101	28.2～34.7 26.4～34.3	31.8～36.4 31.3～36.1
Williams(纽约1995)	4.4～11.3	80～96.1	27.5～33.5	334～355	11.5～14.5172～450
丛玉隆等（北京1996）	3.48～9.48	80～98	27.2～34.3	320～360	10.9～15.398.7～302.9
Bassman	3.7～8.5	81～100	27～31.2	318～354	12.4～14.8142～424

表2-6（2） 血细胞分析仪检测静脉血各项参数参考值 [续表（1）]

	RBC（1012/L）			Hb(g/L)		Hct
	男	女		男	女	男	女
周子秋	4.5～5.7	3.8～5.1		135～170	115～150	0.40～0.51	0.345～0.44
Williams	4.5～5.9		4.1～5.1	140～175	123～153	0.42～0.50	0.36～0.45
丛玉隆等	4.3～5.86		3.77～5.17	137～139	116～155	0.40～0.517	0.367～0.467
Bassman	4.7～6.13			141～181		0.437～0.583

　　1）摘自：周子秋主编，实用临床检查，1993 　　2）摘自：Williams 主编，hematology，第15版，1995 　　3）摘自：北京市成人静脉血正常参考值调查，中华医学检验杂志，1996（3） 　　4）摘自：Bassmen主编， Automateb Blooc Blood Countw and Differentials，1986

虽然血液分析仪提高了实验结果的精确性和准确性，但先进的仪器应用，必须有一套全面质量管理措施，性质在有高素质的技术人员。这方面包括：

　　1．操作人员上岗前的培训

　　（1）上岗前在接受良好的培训。要对仪器的原理、操作规程、使用注意事项、异常报警的含义、引起实验误差的因素及如何维护要有充分的了解，掌握ICSH推荐的标准方法校正仪器的每一个测试参数的程序。

　　（2）注意在分析前、中、后每一步的质量控制，注意病人生理或病理因素给实验造成的误差或服用药物的干扰作用。随时监控仪器的工作状态，注意工作环境的电压变化和磁场、声的干扰。根据质控图的变化及时进行仪器的调试，测试后要根据临床诊断、直方图变化、各项参数的关系，确认无误后方能发出报告。

　　2．仪器的鉴定：新仪器安装后，或每次维修后，必须对仪器的技术性能进行测试和评价，这对保证检验质理将起到重要作用。ICSH公布了对电子血球计数仪的评价方案。在细胞计数和血红蛋白测定方面在鉴定仪器测试杯本的总变异、携带污染率、线性范围、可比性和准确性。一般而言，白细胞计数总变异在3%以睛，携带污染率小于2%，线性范围较宽，重复性小于3%时，可满足临床测试需在。在电阻抗法白细胞分类部分应注意细胞分类结果的重复性，与显微镜检查的相关程度及能否在直方图显示血液中存在一定数量异常细胞等。

　　3．仪器的校正：仪器经鉴定全格且，需要进一步校正，校正方法根据不同仪器的要求进行。校正时最好使用经参考（此仪器已用国际参考方法校正）标定的新鲜血液。在无参考仪器的单位，应用严格手工法得出各项参数值后，进行仪器校正。

　　4．标本的采集和运送：全自动血细胞分析仪一般在求用抗凝的静脉血，尽可能不用皮肤穿刺采血，因为不同部位皮肤穿刺血的细胞成分和细胞与血浆的比例常不一致与静脉血的差别则更大，从技术角度讲，毛细管采血时较少，特别对一些全自动的仪器，不易采到足够量血，更不能在有疑问时重复检查。因此除少数不易取得静脉血，如婴儿、大面积烧伤及某些需要经党采血检查的病例（如血液病、肿瘤化疗等）外，均就用静脉血做实验。使用半自动血液分析仪时也可用手指血进行。

　　上述抗凝血在室湿下，WBC、RBC、PLT可稳定24h，白细胞分类可稳定6-8h，血红蛋白可稳定数日。但镜下白细胞分类，2小时后粒细胞形态即有变化，故需作镜检下分类者，应及早推制血片。虽然4⁰C条件可延长血液贮存期，但血小板不宜在低温下贮存，因会影响PLt MPV值，故如不能及时检查时，血液应在室温保存。

　　5．操作有员在分析中应注意的几个问题

　　（1）测试时试剂的温度对结果的影响：血液分析仪细胞计数最适温度为18-22⁰C，低于15⁰C，高于30⁰C抱歉对结果有影响。其原因可能是由于温度不同，致使细胞体积发生变化，而影响体积的测量，进而改变细胞粘度分布曲线，影响细胞计数。

　　（2）溶血剂的用量及溶血时间，对血小板、白细胞计数影响：全自动俯器由于在机内自动加溶血剂并定时检测可避免其影响，但使用半自动仪器进行血细胞计数时，是要血液预稀释后加入溶血剂，溶血后进行血细胞计数和分类计数，因此溶血剂量及溶血的时间至关重要。加溶血剂的量不同或加后放置时间过短，以致使溶血不完全；或放置时间太久使白细胞明显变形（阻抗法仪器分类是以白细胞体积作为分群依据的，加溶血剂后白细胞膜溶解，胞质大部分溢出，整个细胞体积缩小，仅留下核和部分颗粒），均可导致计数误差，甚至用仪器不能进行分群计数。

　　（3）仪器的半堵孔现象：根据检测器上微孔堵塞的程度，通常将其分为完全堵孔和不完全堵孔两种。如发生完全堵孔，血细胞不能通过微孔计数，也不显示结果，有的仪器还同时在屏幕上显示clog，所以完全堵孔很容易判断。不完全堵孔主要通过下述方法判断：①观察计数时间；②观察示波动器波形；③看计数批示灯闪动，如该灯闪动无规律常是不完全堵孔表现。

　　（4）病理因素对血液分析仪使用的影响：①由于多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、淋巴系统增殖性疾病、转移癌、自身免疫性疾病、感染及某些原因不明疾病血中含有冷球蛋白，或骨髓瘤、癌症、白血病、妊娠、血栓疾病、溏尿病病人血中存在有冷纤维蛋白等，均可导致血液中某些物质凝集，致使血细胞计数增高。此时将稀释标本放在37⁰C水浴10分钟后立即计数可消除此影响；②血液中白细胞显著增高而影响红细胞计数划有核红细胞出现而影响白细胞计数；③低色素必贫血或红细胞内含大量sHb或HbCO而抵抗溶血剂作用时，红细胞溶解不完全；④某些新生儿或某些肝病病人红细胞膜质类异常，抗溶血剂作用，导致红细胞溶血剂不完全；⑤多发性骨髓瘤的M蛋白增多时，Ph低的情况下，M蛋白可与溶血剂发生反应而使结果偏高；⑥各种病顺引起的血栓前状态使血小板易于聚集，机时影响结果。

　　6．分析后注意事项

　　（1）根据直方图及参考数变化确定计数结果是否准确及是否需要显微镜检查：前已述及，标本中出现小的凝块或血小板聚集时可影响白细胞、红细胞及血小板计数。这些影响可在直方图中显示出来，因此在发生白细胞分灯的结果吸是在正常人体格检查世界形势血液检查务项参数均正常时，作为白细胞分类的参考。

　　（2）分析实验结果各参数之间的关系：实验结果的各项的胡数之间有内在联系，比如RBC、HCT（红细胞压积）与MCV；HB、RBC与MCH之间，又如RDW与涂片的红细胞形态变化之间，都有明显的相关关系。加外还可以分析实验结果与临床资料的相关关系，相关检查对于实验中出现的未预料的结果，是否可以从临床角度加以解释，或是否与其它实验有关的分析均十妥重要，例如Hb值过高或过低，是否可用输血、大量失水或出血、溶血来解释。此外，MCHC的高或低与瑞特染色的血片上红细胞中血红蛋白量情况是否一致；白细胞与血小板计数值是否与血片上白细胞、血小板公布情况相一致等相互参照，对保证质量均有重要价值。

　　（3）定期征求临床医护人员对本室结果的评价：临床医生对实验结果的评价也是质理控制的重要环节，临床医生最熟悉病人的病情变化和疾病的发展过程，实验数据是否符合临床也是衡量结果正确与否的重要依据之一，因此，实验室要经常定期听取临床医生的意见，以不断改进实验室的工作。

　　 四、血细胞分析仪应用进展

　　随着高技术的引用和基础医学的发展，各种类型的血液分析仪相继问世。其进展主要表现在以下几方面：

　　（一）仪器测试原理的改进

　　这些仪器主要体现在白细胞分类部分的改进，即电阻抗法的三分群发展为多项技术联合同时检测一个细胞，综合分格实验数据，得出的较为准确的白细胞分群结果。迄今，世界上应用的这类仪器主要有以下四种类型。

　　1．容量、电导、光散射（VCS）白细胞分类法VCS(volume conductivity lightscantter)技术可使血细胞在未经任何处理，与体内形态完全相同的自然状态下得出检测结果。首先在标本内中入只作用于红细胞的溶血剂使红细胞溶解，然后加入抗溶血剂，起中和前述溶血剂的作用，使白细胞表面、胞质及细胞大小等特征仍然保持与体内时间相同的状态。

　　根据流体力学的原理使用鞘流技术使溶血后液体内剩余的白细胞单个通过检测器，VCS三种技术的同时检测，体积的测量使用的是电阻抗原理。电导性是根据细胞壁能产生高频电流的性能，采用高频电磁探针测量细胞内部结构 — 细胞核、细胞质的比例，细胞骨的化学成分，以此来帮助鉴别细胞。因此电导性可辨别体积完全相同的而性质量同的两个细胞群。如小淋巴细胞和嗜酸性粒细胞两者直径均为9-12μm，当前高频电流通过这两种细胞时，由于他们的核与胞质比例不同，而呈现出不同的信号，借此可把他们区分开来，光散射（scatter,S）是除了体积和电导性以外，又从细胞表面光散射的特点提供细胞类型的鉴别方式，来自激光光源的单色光束直接进入计数池的敏感区，在10⁰-70⁰时对每一个细胞进行扫描分析，提供细胞结构、形态的光散射信息。光散射特别具有对细胞颗粒的构型和颗粒质量的区别能力。细胞粗颗粒挑散射要双细颗粒更强，所以通过光散射可帮助仪器将粒细胞分开。

　　根据以上三种方法检测的数据，经计算机处理得出细胞分布图（图示-15）进而计算出实验结果。图中各圈内的范围均代表正常细胞和异常细胞在图中可能出现的位置，数字代表细胞的类型。

图2-15 VCS法细胞分布图 1．幼稚细胞　2．杆状核粒细胞 3．单核细胞　4．单核细胞或淋巴细胞 5．淋巴细胞　6．变异淋巴细胞 7．小型非典型淋巴细胞　8．有核红细胞 9．巨大血小板　10．血小板凝块

　　2．阻抗与射频技术联合的白细胞分类法这尖仪器白细胞计数通过四个不同检测系统完成。

　　（1）嗜酸性粒细胞检测系统：血液进入仪器后，经分血器使血液与嗜酸性粒细胞特异计数的溶血的剂混合，由于其特殊的PH，使除嗜酸性粒细胞以外的所有细胞溶解或萎缩，含有完整的嗜酸性粒细胞液体的通过小孔时，使计数电路产生脉冲而被子计数。

　　（2）嗜三性粒细胞检测系统：计数原理与嗜酸性粒细胞相同，由于碱性溶血剂只能保留与血液中嗜碱性的粒细胞，因此根据脉冲的多少即可求得嗜碱性粒细胞数。上述二种方法除需要使用专一的溶血剂外，还需特定的作用温度和时间。

　　（3）淋巴、单核、粒细胞（中性、嗜碱性、嗜酸性性）的检测系统：这个系统采用电阻与射频联合检测的方式。使用的溶血剂的作用较轻溶血剂穿透细胞膜时仅使少量的胞质溢出，对核的皱缩作用也较轻微，细胞形态改变不大。在小孔的内外电级上存有直流和高频两个放射器，在小孔周围存在直流电及射频两小及颗粒的多少。因此细胞进入小孔时产生两个不同的脉冲信号，脉站的高低分别代表细胞的大小和核及颗粒的密度，以DC信号为横丛标，RF为纵坐标，就可根据2个信号把同一个细胞定位于二维的细胞散射图上。由于淋巴细胞、单核细胞及粒细胞的细胞大小、细胞质含量，胞质内颗粒的大小与密度、细胞核的形态与密度不同，DC及EF的脉冲信号有较大的差异，定位在各自散射的区域，通过扫描技术得出各类细胞比例（见图2-16）。

图2-16 电阻抗与射频联合检测白细胞分布图

　　（4）幼稚细胞检测系统：此胞膜上脂质较成熟细胞少的现象，在细胞悬液加入硫化氨基酸后，由于细胞上脂质占位不同，故结合在幼稚细胞的硫化氨基酸较成熟的细胞多，且对溶血剂有抵抗作用。当加入溶血剂后，成熟细胞被溶解，如果悬液中存在细胞细胞，其形态不受契约坏，因此可通过电阻抗的方法检测出来。（图2-17）。

图2-17电阻抗与射频联合检测白细胞、幼稚细胞、屏幕细胞分布图

　　3．光散射与细胞化学技术联合应用于白细胞分类计数：联合应用激光射的过氧化物酶染色技术来进行白细胞分类计数。嗜酸性粒细胞有很强的过氧化物酶活性，中性粒细胞有较强的过氧化物酶活性，单细胞资助之，而淋巴细胞和嗜碱性粒细胞均无此酶。将血兴高采烈经过氧化物酶染色后，胞质内即可出现不同的酶化学反应，由此构成了此种血液分析仪的分析基础，化妆品的分血器将血加入到含有清洗剂和甲醛的高渗液体内（21倍稀释）并孵育（40⁰～70⁰）20秒钟。其中清洗剂（含有非离子表面活性剂）使细胞破坏，甲醛使白细胞质内酶被固定，此后发生第二步反应，即加入过氧化氢和4氯=蔡酚，并加热13秒，此时如果待测细胞质中含有过氧化酶即可分解H₂O₂产生[O]，后者可使4氯-蔡酚显色并沉积定位于酶反应部位，此类细胞通过测试区时，由于酶反应强度不同（阴性、弱阳性、强阳性）和细胞体大小不同，激光束射互细胞上的前向角和散射角有所不同，以X轴为吸光率标记（酶反应强度），Y轴为光散射（细胞大小）。每个细胞产生的两个信号结合定位在细胞图上（图2-18）。每秒钟仪器可测上千个细胞。计算机系统对存储的资料进行分析处理，并结合嗜好碱性粒细胞或分叶核粒细胞通道结果计算出白细胞总参数和分类良数。

图2-18 激光与细胞化学联合检测白细胞直方示意图

　　4．多角度偏振光散射白细胞分类技术（multi — Angle polatised scatter separation of white cell,MAPSS）其原理是一定体积的全血标本用鞘流液按适当比例稀释。其白细胞内部结构近似于自然状态，因嗜碱性粒细胞嘌粒具有吸湿的特性，所以嗜碱性粒细胞的结构有轻微改变。红细胞内部的渗透透压高于鞘兴高采烈的渗透压而发生改变，红细胞内的血红蛋白从细胞内游离出来，而鞘液内的水分进入红细胞中，细胞膜的结构仍然完整，但此时的红细胞折炮指数与鞘液的相同，故红细胞不干扰白细胞检测。

　　在水动力系统的作用下，样本被集中为一个直径为30μm的小股液流，该液流将稀释细胞单个排列，因是单个通过激光束，故在各个方向都有其散射光。可以从四个角度测定散射光的密度（见图2-19）：①0⁰：前角光散射（1⁰～3⁰）粗略地测定细胞大小；②10⁰：狭角光散射（7⁰～11⁰）测细胞结构及其复杂性的相对特征；③90⁰：90⁰消偏振光散射（70⁰`～110⁰），基于颗粒可以将垂直角度的偏振激光消偏振的特性，将嗜酸细胞从中性粒细胞和其它细胞中分离出来。④90⁰：垂直光散射（70⁰～110⁰）主要对细胞内部颗粒和细胞成分进行测量。可以从这四个角度同时对个白细胞进行测量，同一种特定的程序自动储存和分析数据，将白细胞分为嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞5种。

图2-19 MAPSS测量原理

　　（二）仪器自动化水平的提高

　　80年代以前，血细胞分析仪主动脉要是半自动型。此类仪器需要将标本经机外预稀释后才能检测，惚受干扰，随机误差也很大。随着全自动型仪器不断涌现，血液直接被入血细胞分析仪后的在机内自动稀释、自动加溶血剂、定时检测，提高了仪器的精确度和准确度。

　　最近，“联合型血液分析系统‘问世，这个系统将先进的血细胞分析仪、涂片机、染色下、网织红细胞仪串联在一起。血液先经血细胞分析仪检测，根据红细胞情况决定是否做网织红计数；根据HCT来改变推片机的角度和速度，以保证血涂片的合格。根据实验数据和直方图的变化，计算机选择是否需要一步显微镜检查。特别是自动加样系统和真空采血管的应用。不但可能避免实验的随机误差，提高工作效率，而且可避免某些实验环节造成的血行感染，对工作人员的劳动保护起以关键作用，成为仪器发展和使用的潮流。

　　（三）各种特殊技术的应用

　　为了保证实验结果的准确，不同仪器使用不同的特殊技术：①为了使细胞计数准确采用“三次计数“表决；②采用热敏电阻装置，监测试剂温度；③为了使积压小板计数准确，采用流技术及鞘流；④为同避免小细胞和大血小板干扰血小板计数，采用浮动界标技术；⑤仪器自动保护技术、采用了燃烧电路、管道和过样针的自动清洗及故障碍自检功能；⑥各种方式的质控制资料储存和处理（比如X-B质控法）。这些技术对于质量控制起了关键作用。

　　以上介绍了近年来五分类法血细胞分仪白细胞分类的原理及临床应用价值。不难看出，由于高科技的应用，使细胞分析更精确、更准确，为临床诊断与治疗提供了重要依据，也大大提高了实验室工作效率。但应指出，各类仪器仍有其不足之处，如不能对单个细胞完全识别，特别是白血病细胞和正常单核细胞、异常不典型淋巴细胞，因为五分类法仪器的白细胞分类只是严格根据筛选标准报告实验结果，必要时仍需以显微镜涂片检查进行复检。