[转帖]第三节 化学发光免疫测定

　　化学发光反应参与的免疫测定分为二种类型。第一种是以发光剂作为酶免疫测定的底物，通过发光反应增强测定的敏感性；第二种是以发光剂作为抗体或抗原的标记物，直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的含量。

　　一、化学发光酶免疫测定

　　从标记免疫测定来看，化学发光酶免疫测定（chemiluminescentenzymeimmunoasssay，CLEIA）应属酶免疫测定。测定中2次抗原抗体反应步骤均与酶免疫测定相同，仅最后一步酶反应所用底物为发光剂，通过化学发光反应发出的光在特定的仪器上进行测定。两种常用的标记酶，辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）均有其发光底物，由此建立的CLEIA均在临床检验中应用。

　　（一）HRP标记的CLEIA

　　常用的底物为鲁米诺或其衍生物。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，通常以0.1mol/LpH8.6Tris缓冲液作底物液，鲁米诺和H₂O₂在无HRP催化时也能缓慢自发发光，而在最后光强度测定中造成空白干扰，因而宜分别配制成2瓶试剂溶液，只在用前即刻混合。

　　HRP催化鲁米诺氧化的反应可被某些酚试剂（如邻－碘酚）或萤火虫荧光素酶等加强。加强剂的作用是增强发光和延长发光时间，由此可提高敏感度。

　　（二）AP标记的CLEIA

　　在以AP为标记酶的CLEIA中，应用的底物为adamantyldioxetasephosphate，有不少衍生物的商品试剂如PPD可供应用。发光反应的反应式如下：

　　二、化学发光标记免疫测定

　　化学发光标记免疫测定亦称化学发光免疫测定（chemiluminescentimmunoassay，CLIA），是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方法。用作标记的化学发光剂应符合以下几个条件：①能参与化学发光反应；②与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂；③偶联后仍保留高的量子效应和反应动力；④应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫活性。鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是常用的标记发光剂。

　　鲁米诺类的发光反应须有催化剂（例如过氧化物酶）催化，且与蛋白质或肽结合后其发光作用减弱，因此鲁米诺类在CLEIA中是很好的底物，但已较少用于CLIA的标记。吖啶酯类对CLIA更为适用，其显著的优点是：①氧化反应不需催化剂，只要碱性环境中就可以进行。反应物在加入H₂O₂后再加氢化钠溶液，发光反应迅速，本底低。②在氧化反应过程中，结合物被分解，因此游离的吖啶酯的发光不受抑制。试剂稳定性好。

　　三、电化学发光免疫测定

　　在电化学发光免疫测定（electrochemluminescenceimmunoassay，ECLI）中应用的标记物为电化学发光反应的底物三联吡啶钌，其衍生物N-羟基琥珀酰胺（NHS）酯可通过化学反应与抗体或不同化学结构的抗原分子结合，制成标记的抗体或抗原。ECLI的测定模式与ELISA相似，分二个步骤进行。以双抗体夹心法测定抗原为例，第一步在试管中进行，反应物为Ru(bpy)₃²⁺标记的抗体、吸附在磁性微球上的固相抗体以及受检的标本，反应式如图18-2。

图18-2 ECLI中的抗原抗体反应

　　反应后除由标记抗体、固相抗体与标本中的抗原形成的夹心复合物外，尚有多余的标记抗体和固相抗体。第二步是将反应液输入特殊的检测仪器的反应室中（图18-3），随即用含三丙胺（TPA）的缓冲液冲洗。反应室电极下有磁铁。含磁性微球的夹心复合物及游离的固相抗体被吸附在电极表面，游离的标记抗体随冲洗液流出。此时在反应室中即发生如图18-1的电化学发光反应。发出的光由光电倍增管转为信号，通过电信号的测定反映标本中抗原的含量。

图18-3 ECLI中的ECL反应

　　ECLI具有以下优点：①标记物在再循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定；②敏感度高，可达pg/ml或pmol水平；③线性范围宽，＞10⁴；④反应时间短，20min以内可完成测定；⑤试剂稳定性好，2～5℃可保持一年以上。

　　四、在医学检验中的应用

　　放射免疫分析因标记物的放射性在应用中存在不少问题。为替代这一广被采用的测定方法，近年来创立了多种新的标记免疫技术。化学发光免疫测定具有明显的优越性：①敏感度高，甚至超过RIA；②精密度和准确性均可与RIA相比；③试剂稳定，无毒害；④测定耗时短；⑤测定项目多；⑥已发展成自动化测定系统。因此化学发光免疫测定在医学检验中不仅能取代RIA，而且可得到更为广泛的应用。