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一．荧光的原理
1 ．荧光的定义：物质的发光随照射光停止而立即消失的叫荧光。
荧光寿命：10-8-10-9秒 磷 光：10-4秒
2．荧光的产生：光物质分子吸收能量激发到第一电子激发状态及其它电子激发态的各个能级 回到单线第一电子激发态的最低振动能级向基态各能级跃迁发光（荧光）。
从此可见，任何能发荧光的物质都有两种特征光谱：激发光谱和吸收光谱，前者表示不同波长的激发光产生荧光的效率，后者表示物质发射出不同波长光线的相对强度。
二．描述荧光的参数：
1．荧光寿命 ：去除激发光后 ，荧光强度降到激发时最大强度的e-1需要的时间。
2．荧光效率 ：即发射量子数与吸收量子数之比。 ф=发射量子数 / 吸收量子数
3．荧光强度：F=KI0clzфF:荧光强度 K:仪器常数 I0:激发光强度
C：样品物质 L：样品池厚度 Z：物质吸光系数 ф：荧光效率
三．荧光分析的特点：
1．高灵敏度：荧光分析的灵敏度比分光光度计法大 2 ～ 3 个数量级。
分光光度法通常在 10-7 级 ，而荧光的灵敏度达10-9。
2．强选择性：荧光物质具有2种特征光谱：激发光谱和吸收光谱，分光光度法通过测定物质的吸收光谱来分析，而荧光可根据激发光谱和发射光谱来鉴定物质。
3．信息量丰富：能提供荧光物质的多种参数。
4．不足之处：①很多物质本身不发荧光；②荧光的产生与化合物结构的关系不明确；③干扰因素多，光分解、氧淬灭、易污染。
四．荧光分析的常用方法：
1．直接测定法：利用物质本身发出的荧光来进行测定。因为大部分物质不发荧光，该法少用。
2．间接测定法：物质本身不发荧光，跟荧光探剂结合后转变成荧光物质进行测定。
3． 荧光探针探剂的条件：⑴ 探剂与被测物质分子的某一微区必须有特异性结合且牢固；
⑵ 探剂的荧光必须对环境条件灵敏；
⑶ 结合的探剂不会影响被测物质的分子结构和特性；
⑷ 能利用荧光淬灭和光分解等对荧光进行有效定量和定性分析。
五．影响荧光测量的几种因素：
1．温度影响：一般说来，荧光随温度升高而强度减弱，温度升高1℃，荧光强度下降1～10%不等。测定时，温度必须保持恒定。
2．PH值影响：PH 值影响物质的荧光，应选择最佳PH制备样品。
3．光分解对荧光测定的影响：
荧光物质吸收紫外可见光后，发生光化学反应，导致荧光强度下降。因此，荧光分析仪要采用高灵敏度的检测器，而不是用增强光源来提高灵敏度。测定时，用较窄的激发光部分的狭缝，以减弱激发光。同时，用较宽的发射狭缝引导荧光。荧光分析应尽量在暗环境中进行。
4．散射光的影响：
主要是瑞利散射光和拉曼散射光的影响较大。校正办法：先用短的激发光激发，检出溶液的拉曼峰，然后进行荧光光谱校正。因为荧光光谱不随激发光波长的改变而改变，而拉曼光却随之改变。
5．高浓度样品的影响：
1）当激发光照射高浓度样品时，在激发光入口附近产生荧光，但这些荧光并不能进入荧光检测器。
2）高浓度的分子之间相互作用而发生活性阻碍现象。
3）荧光的再吸收：即荧光光谱的短波长端和激发光谱的长波长端如果相互重叠，则发生荧光再吸收。 总之，高浓度样品进行荧光分析时，应进行稀释。
六．荧光分析仪的基本结构：
基本结构：激发光源、激发单色器、样品室、发射单色器及检测系统。
荧光分析仪与紫外分光光度计的结构主要区别有两点：
1）检测器的检测方向，
2）检测器前面有无单色器。
1．光源：
1）汞灯：发射强度大、稳定、不需复杂电源，但谱线不连续，数目少。主要用于滤片荧光计。
2）氙灯：发出射线的强度大，谱线连续，分布于250～700nm光域内，且在300～400nm波段内射线强度几乎相等。但该灯的电源功率要求大，且电源稳定，因此电源结构复杂。
2．滤光片和单色器：
1）滤光片 ：用于滤片荧光计中
a.激发光滤片：放在光源和液槽和检测器之间，滤去不需要的光线；b.荧光滤片：放在液槽和检测器之间，滤去反射光，瑞利散射光、拉曼光以及溶液杂质所发荧光等，让被测物发出的荧光通过且照射到检测器上。
2）单色器：
光栅：是单色器的主要元件。优点：a.对所有波长产生衍射，且谱线分布均匀，有相同的分辨率。b.入射光80%的能量在一级光谱中。C.灵敏度高、便宜。缺点：有部分光栅谱干扰分析，可加前置滤片加以消除。
狭缝：是单色器的重要组成部分，直接影响到分辨率。狭缝宽度越小，单色性越好，但光强度也随之减少。分辨率BP满足下列公式：
BP= W/FDW：狭缝宽度 F：焦距 D：色散率
3．样品池：常用玻璃和石英制成，有正方形和长方形两种。 材料要求：不发荧光或低荧光。
4．检测器：主要有硒光电池、光电管和光电倍增管等。 选择光电倍增管要考虑：响应波长、灵敏度和噪声水平。蓝敏管对蛋白质、核酸的测量适用，而红敏管则适用于荧光染料检测。
[此贴子已经被作者于2004-8-20 23:52:22编辑过]
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