[转发]流式细胞仪--- FACSCanto之基本原理与应用

作者：刘益年 来源：美商必帝公司

大纲

•实验设计原理

•流式细胞仪运作原理

实验设计原理
1.藉由荧光抗体标识细胞之抗原特性

淋巴球免疫分型

FITC	PE	使用原理
CD45	CD14	仪器可自动依据CD45 与CD14 之免疫荧光染色，测量三群白血球的比例，淋巴球(CD45 Bright /CD14-/Low FSC/ Low SSC) ，单核球(CD14+/CD45 Intermediate/High FSC/Intermediate SSC) ，颗粒性球(CD14 dim/CD45 dim/High FSC/High SSC) ，细胞碎片与红血球应是(CD14-/CD45-/Low FSC/Low SSC) 。
IgG1	IgG1	根据阴性对照组之染色程度来划分阳性/阴性之界线，依此界线在阴性 对照的样品中，假阳性(Quardrant1+2+4)不得超过百分之二。
CD3	CD19	T 细胞必须表达有CD3+ 抗原， B 细胞表达有CD19+ 抗原。此两群细 胞与NK 细胞之总和应约略等于淋巴球的总数，可作为品管的指标。
CD3	CD4	CD4+ T 细胞必须同时表达有CD3+ 与CD4+ 抗原。
CD3	CD8	CD8+ T 细胞必须同时表达有CD3+ 与CD8+ 抗原。
CD3	CD16+ or CD56+	NK 细胞必须不表达有CD3 抗原，同时表达有CD16+ 或CD56+ 抗 原。NK 细胞与T & B 两群细胞之总和应约略等于淋巴球的总数，可 作为品管的指标。

2.藉由荧光化合物标识细胞特性

Annexin V Assay


3.藉由荧光染剂标识细胞特性

DNA 特异性染剂

细胞周期位相的决定

Sub G1

Mitochondria Membrane Potential

细胞增殖反应

4.Cytometry Beads Array
Cytometric Beads Array (CBA)


Beads Provide Beads Provide a Flexible Platform
Beads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometer
Advantages of Bead-Based Immunoassays
•Analyze multiple analytes simultaneously
•Reduced sample volume requirements
•Reduced hands-on time by parallel analysis of samples
•Wide dynamic range of fluorescence detection (requires fewer sample dilutions)

Proteins Measured
A. Interleukin (IL)-2
B. IL-4
C. IL-5
D. IL-10
E. Tumor Necrosis Factor-α
F. Interferon-γ

BD FACSCanto^TM

流式细胞仪的工作原理

流式细胞仪能测量:
•散射光
–细胞大小(前方散射光)
–细胞折射率(侧方散射光)
•各色荧光

综合三个系统的功能:
‧液流系统:将细胞依序送到测量区受检。
‧光学系统:产生并收集荧光、光散射等信号。
‧电子系统:
–将光学讯号转换成电子讯号。
–分析所输出的电流讯号，以脉冲高度、宽度、积分面积显示。
–量化讯号并传至计算机。

液流系统

FACSCanto 的液流系統

10,000 events/sec

光學系統
Sensitivity : 100 FITC MESF, 50 PE MESF

Cuvette Flow Cell & Fiber Optics

螢光濾片




FACSCanto 的光學系統


BD FACSCanto –Default dyes

電子系統

實驗數據的呈現

常見的數據呈現
散點圖反映細胞形態

直方圖分析報告

散點圖分析報告

儀器之調試
•設閾參數
•閾值
•FSC / SSC 散點圖
•螢光信號接受器FL 1-4
•自動化色差補償

User Log In

FACSDiva Workspace

常用螢光染劑

Instrument Set Up

閥值的調整

散射光信號的調整

散射光信號的調整 Cell Line

自體螢光信號的調整

自體螢光信號的調整2-3C

螢光補償調整(The Problem)

大纲

•实验设计原理

•流式细胞仪运作原理

实验设计原理
1.藉由荧光抗体标识细胞之抗原特性

淋巴球免疫分型

FITC	PE	使用原理
CD45	CD14	仪器可自动依据CD45 与CD14 之免疫荧光染色，测量三群白血球的比例，淋巴球(CD45 Bright /CD14-/Low FSC/ Low SSC) ，单核球(CD14+/CD45 Intermediate/High FSC/Intermediate SSC) ，颗粒性球(CD14 dim/CD45 dim/High FSC/High SSC) ，细胞碎片与红血球应是(CD14-/CD45-/Low FSC/Low SSC) 。
IgG1	IgG1	根据阴性对照组之染色程度来划分阳性/阴性之界线，依此界线在阴性 对照的样品中，假阳性(Quardrant1+2+4)不得超过百分之二。
CD3	CD19	T 细胞必须表达有CD3+ 抗原， B 细胞表达有CD19+ 抗原。此两群细 胞与NK 细胞之总和应约略等于淋巴球的总数，可作为品管的指标。
CD3	CD4	CD4+ T 细胞必须同时表达有CD3+ 与CD4+ 抗原。
CD3	CD8	CD8+ T 细胞必须同时表达有CD3+ 与CD8+ 抗原。
CD3	CD16+ or CD56+	NK 细胞必须不表达有CD3 抗原，同时表达有CD16+ 或CD56+ 抗 原。NK 细胞与T & B 两群细胞之总和应约略等于淋巴球的总数，可 作为品管的指标。

治癌药物


2.藉由荧光化合物标识细胞特性

Annexin V Assay

3.藉由荧光染剂标识细胞特性

DNA 特异性染剂

细胞周期位相的决定

Sub G1

Mitochondria Membrane Potential

细胞增殖反应

4.Cytometry Beads Array
Cytometric Beads Array (CBA)


Beads Provide Beads Provide a Flexible Platform
Beads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometer

Advantages of Bead-Based Immunoassays
•Analyze multiple analytes simultaneously
•Reduced sample volume requirements
•Reduced hands-on time by parallel analysis of samples
•Wide dynamic range of fluorescence detection (requires fewer sample dilutions)

Proteins Measured
A. Interleukin (IL)-2
B. IL-4
C. IL-5
D. IL-10
E. Tumor Necrosis Factor-α
F. Interferon-γ

BD FACSCanto^TM

流式细胞仪的工作原理

流式细胞仪能测量:
•散射光
–细胞大小(前方散射光)
–细胞折射率(侧方散射光)
•各色荧光

综合三个系统的功能:
‧液流系统:将细胞依序送到测量区受检。
‧光学系统:产生并收集荧光、光散射等信号。
‧电子系统:
–将光学讯号转换成电子讯号。
–分析所输出的电流讯号，以脉冲高度、宽度、积分面积显示。
–量化讯号并传至计算机。

液流系统

FACSCanto 的液流系統

10,000 events/sec

光學系統
Sensitivity : 100 FITC MESF, 50 PE MESF

Cuvette Flow Cell & Fiber Optics

螢光濾片

FACSCanto 的光學系統


BD FACSCanto –Default dyes


電子系統

實驗數據的呈現

常見的數據呈現
散點圖反映細胞形態

直方圖分析報告

散點圖分析報告



儀器之調試
•設閾參數
•閾值
•FSC / SSC 散點圖
•螢光信號接受器FL 1-4
•自動化色差補償

User Log In

FACSDiva Workspace

常用螢光染劑

Instrument Set Up

閥值的調整

散射光信號的調整

散射光信號的調整 Cell Line

自體螢光信號的調整

自體螢光信號的調整2-3C

螢光補償調整(The Problem)

螢光補償調整(The Problem)

螢光補償調節

Create Compensation Controls

選擇“Instrument>Instrument Setup>Calculate
Compensation”命令。

FACSCanto 各部構造

正確開機程序
1. 開啟主電源。
2. 開啟電腦。在密碼登錄框中，輸入BDIS，按Enter。
3. 開啟BD FACSDiva 軟體。
4. 確定軟體與細胞儀完成連線。
5. 完成連線後，檢視各項試劑液面是否正常。
6. 等待細胞儀自動完成液流啟動程式。
7. 當液流啟動程式完成後，請點選OK。
8. 檢視雷射是否暖機完成。
整個程序約需5~10分鐘。

上機檢查程序
1. 檢品濃度調至1X106 cells/ml？一般只需0.5 ml。
2. 是否已小心地去除檢品中之細胞團塊。
3. 是否已將檢品放至FALCON 2052 試管中？試管
是否有裂痕？
4. 是否有足量專用鞘液？ 是否已將廢液倒掉？
5. 是否已執行Auto Clean ？
6. 系統氣壓讀數55~65 Psi ？
7. 是否已將液體過濾器中之氣泡排空？
8. 請填寫使用登記表。

建議使用之鞘液液體
1. FACSFlow (BDIS)
2. 經0.22um過濾之自備含0.05%NaN3之PBS
不鼓勵使用下列溶液作為鞘液液體之用：
- Fisher Hematology Diluent
- Isoton III
- Isolac D
- DI water

Low： 樣品流速= 10 l /min
Medium：樣品流速= 60 l /min
High: 樣品流速=120 l /min

檢體吸取區(SIT)


Remove Tube正確步驟
步驟要確實：〔to minimize carry over between samples〕
1. 在Acquisition Controls視窗中，點Remove tube；此時，會出現一個進程顯示對話框。
2. 右手握著小管，左手將Aspirator arm向左搬到底。
3. 取下樣品管。
4. 放開左手，使Aspirator arm回到中央；此時，SIT會自動清洗；清洗完成後，進程顯示對話框會自動消失，在清洗動作完成前，請勿放下一管。

老大，哪有有关发帖方法的说明啊？不大会发帖，加图片后，图总跑到最后，不是你这种一张图一段解释的。

有可以下载的吗

真是好东西

郑工有没一整篇的可以直接下载

额