[转发]流式细胞仪及流式细胞术教程

流式细胞术的历史
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。

　　1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。1953年Crosland –Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。

　　1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。

　　现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新设想：（1）细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。（2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。换句话说，对同一细胞可以同时获得有关不同组分的多方面信息，用作鉴别细胞的依据。

　　流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是Van Dilla和美国的Los Alamos小组。他们在1967年研制出流液束、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首次用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。Gohde 和Dittrich接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。（下图为一DNA直方图）

将待测细胞染色后制成单细胞悬液。

用一定压力将待测样 品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲 液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。

流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。

（如下图：FSC&SSC）

前向角散射，即FSC与细胞直径平分正相关，所以我们平时上机的时候，有时用FSC做阈值，排除碎片及其它颗粒，避免干扰。
侧向角散射，即SSC是指与激光束正交90度方向的散射信号，它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可以提供细胞内结构及颗粒性质的信息！
因此，仅根据FSC/SSC，我们就可以分开全血样本中的淋巴细胞，单核细胞和中性粒细胞！（如下图）

这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。

　　这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模／数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。（下图为光学系统）

检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。

单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。

对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图(histogram)，也可以选择二维的散点图(dot plot)、等高线图(contour)或三维立体视图(pseudo 3D)。

（上面有一个直方图了，下图为散点图及三维立体图）

细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。 在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。也就是高中学过的带电粒子在电场中运动的原理！

补充细节1：关于荧光素

荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。
自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子(例核黄素、细胞色素等)的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。

当应用流式细胞术对细胞表面或内部抗原进行检测时，除必要的抗体外，应用各种荧光素也是必不可少的，它包括单标记抗体荧光索、双标记抗体荧光素、三标记抗体荧光素等。荧光素发射荧光基本原理是：荧光素受到一定波长(激发波长)的激光激发后，其原子核外的电子由于吸收了激光的能量，由原本运动处于基态轨道跃迁到激发态轨道上运动，然后当电子由激发态重新回到基础态时，释放出能量并发射出一定波长(发射波长)的荧光。

不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发，所以要选择正确的激光器。例如，FITC和FE等的微发光波长均为488nm，所以可用产生可见光的氩离子激光器，而APC和PC5等的激发波长在红光范围，需使用发射630nm波长红光的氦—氖激光器。

此外，各种荧光素的发射波长也十分重要，可以据此确定其检测所需光电倍增管性质。如FITC，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管(即PMTl)；PE则发射橙包光，需用第二光电倍增管(即PMT2)；PC5和PcrCP等发射的是深红色光，这时需选择第二甚至第四光电倍增管(即PMT3或PMT4)等。

一定要注意激发波长和发射波长的区别！

常用荧光素

流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm）。488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。他们的激发光和发射光波长分别是：
激发光波长（ηm） 发射光峰值（ηm）
FITC 488 525（绿）
PE 488 575（橙红）
PI 488 630（橙红）
ECD 488 610（红）
CY5 488 675（深红）
PreCP 488 675（深红）

FITC和PI
PI和EB 都具有嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中并有与碱基对结合的特异性。为了获得特异的DNA分布，染色前必须用RNA酶处理细胞，排除双链RNA的干扰。PI和EB不能进入完整的细胞膜，因此又可以用于检测死细肥。PI和EB各种理化性质相似，但PI比EB的发射光光谱峰向长波方向移动，因而在作DNA和蛋白质双参数测量时，PI的红色荧光和FITC的绿色荧光更易于区分和测量。另外，Pl比EB测得的DNA分布的变异系数(CV值)低，所以PI得到更广泛的应用。
FITC 为一种小分子荧光素，其效率(即荧光强度)取决于溶液的pH值，因此在使用FITC时应注意溶液的酸碱度。

一些流式常用名字的概念和意义：
Amplifier 放大器 Electronic component of a flow cytometer that increases the signal by an adjustable factor.

Aneuploid 异倍体 Having an abnormal number of chromosomes. Aneuploid cells may also have an abnormal DNA content.

Average The mean value, which is the total amount divided by the number of contributors.

Channel 常说的荧光道数 The measured value of a parameter, representing the signal intensity of an event after amplification. To appear on a plot, data for an event must fall into one of either 256 channels (0-255) or one of 1024 channels (0-1023) depending on the resolution of the plot.

Compensation （荧光）补偿 An electronic calculation that removes signal overlap which the optical system cannot remove. Fluorescence compensation works for specific pairs of fluorescent parameters; for example, FL1 and FL2.

Cursor For FACScans: a highlight appearing in a data field that indicates you can modify this field. On a dot plot, a crosshair for drawing a polygon gate. On other flow cytometers: a line separating regions on single parameter histograms that are treated statistically separate. See marker.

%CV CV值！表示其集中分散趋势。Percent coefficient of variation is a measure of peak distribution. The percent coefficient of variation is the standard deviation of the peak divided by the mean channel number of the peak, times 100.

Diploid 二倍体Having the normal number of chromosome pairs for non-reproductive, mammalian cells. The amount of DNA in diploid cells defines the normal DNA content for the species.

DNA Index The ratio of GO/G1 peak channel in a DNA histogram of the experimental sample to the GO/G1 peak channel of the reference sample, when normal human diploid cells or nuclei are the reference. This is a measure of DNA aneuploidy, or abnormal DNA content.

Dot Plot A two parameter data graph used for acquisition and analysis. Each dot on the display represents one event that the flow cytometer analyzed.

Doublet 分选中常用的概念。 Two particles stuck together, which a flow cytometer records as one larger event. Particles may also occur in triplets and higher associations.

Event A unit of data representing one particle or cell. An event has a relative intensity value and channel number for each parameter.

Filter An optical device used to attenuate particular wavelengths or frequencies while passing others.

FL1, Green Fluorescence signal received by the photomultiplier tube (PMT), FL1. The range of the signal detected is dependent on the filters associated with the PMT. For FACScans and FACSCaliburs, FL1 measures light in the green range of the spectrum (515 to 545 nm).

FL2, Orange-Red Fluorescence signal received by the photomultiplier tube, FL2. For FACScans and FACSCaliburs, FL2 measures orange-red light (564-606 nm).

FL3, Red Fluorescence signal received by the photomultiplier tube, FL3. For FACScans, FL3 measures red light (above 650 nm). For FACSCaliburs, FL3 measures red light (above 670 nm).

FL4, Red-Orange Fluorescence signal received by the photomultiplier tube, FL4. For FACSCaliburs, FL4 measures red-orange light (653-669 nm).

Fluorescence A property of molecules to absorb light at one wavelength and emit light at a longer wavelength. Flow cytometers detect Fluorescence emission at a 90 degree angle to the exciting light beam.

Forward Scatter (FSC) 前向角 A parameter measuring light scattered less than 10 degrees as a cell passes through the laser beam. The FSC measurement is related to cell size.

G0 Phase of cell cycle designating cells that are quiescent and have not yet entered the growth cycle. Normal cells in this phase have exactly one set of chromosome pairs.

G1 Phase of cells cycle in which cells are committed to division. These cells have the same number of chromosomes and the same amount of DNA as GO phase cells. They are about to enter S phase where they synthesize DNA.

G2 Phase of cells cycle in which proliferating cells have duplicated their DNA and formed two sets of chromosome pairs, in preparation for division. G2 follows the S phase and precedes the M (mitosis) phase.

Gain 增益 An adjustment that modifies amplifier responses. Increasing the gain increases the electronic pulse (and the relative fluorescence intensity value and the channel value) in response to a light signal.

Gate 翻译过来后还是觉得称之为“gate”好！A boundary that defines a subset or sub-population of events. Gates are set by drawing boundaries around the subsets on data plots (dot plots or histograms). Use gates either for data acquisition or analysis. Inclusive gates select only the events that fall within (and on) the boundary. Exclusive gates select only the events that fall outside of the boundary.

Live gate 与上面的“gate”不同，是作为记录的条件的gate，不在gate之内的数据不被存入电脑！Gate through which any data from the flow cytometer/computer parallel interface must pass before acquisition. Any data outside the gate does not enter the computer.

Haploid 单倍体 Having one set of single chromosomes. Reproductive cells, like eggs and sperm, are haploid.

Histogram A data plot of a single parameter. This displays either the relative fluorescence intensity value or the channel number on the x axis and the number of events on the y axis.

Linear scale 线性The scale on which the output is directly proportional to the input. When the control is set at Linear, the voltage measured is directly proportional to the channel into which the event falls.

Logarithmic scale 对数 The scale on which the values increase logarithmically. This scale is used when the instrument is set to LOG. There are four decades across the 1024 channels on FACScan (256 channels per decade). The scale ranges from 1 to 10,000. For FACScan, the number of decades is fixed.

M Phase of the cell cycle, mitosis, during which a cell divides into two. This precedes GO/G1 and follows G2. M phase and G2 cells contain the same amount of DNA and the same number of chromosomes. In normal cells, this is the tetraploid number (4N) of chromosomes.

Marker 就是第五篇中的一张图上面的M1，M2等。作为统计时的分界区域限制。A line separating regions on single parameter histograms that are treated statistically separate. See cursor.

Parameter A measurement of light intensity, either scattered or emitted fluorescence, from a particle as it passes through a laser beam. For all five parameters (FSC, SSC, FL1, FL2, FL3) the height of the electronic pulse that is generated is used. In addition, for cell cycle analysis CellQuest software can measure either FL2 area and FL2 width (for staining with propidium iodide) or FL3 area and FL3 width (for staining with 7-amino-actinomycin D).

Photodiode 光电二极管，将光信号转化为电信号。A semiconductor device used to detect light and generate an electrical current. Typically used in forward scatter (FSC) detection.

Photomultiplier 光电倍增管 A photodetector, with adjustable voltage, that translates optical tube (PMT) signals into electrical current. PMT detectors are used for SSC and fluorescence parameters. Increasing the PMT voltage, increases the output signal for a given amount of light.

Ploidy 倍性 The number of chromosomes present in the cell. The amount of DNA in a cell gives an indication of the ploidy, but is not directly proportional. See Haploid, Diploid, and Aneuploid.

Pulse 不是脉搏，是脉冲！The electronic signal generated by a particle (cell or nucleus) in the flow cytometer.

Rate The number of events per second processed by the computer.

Reference Sample 就是作为一个内标的样本，通过它可以对一些物质进行定量检测！（这就是为什么在一些帖子里面，我们总是说流式是个定性，半定量工具，要做到半定量或定量，需要内标。不是所有的数据都可以定量的。） A sample of known DNA content mixed with an experimental sample to provide an internal standard.

S Phase of the cell cycle, DNA synthesis, in which the cell duplicates its DNA.

Scale The maximum number of events displayed for a channel in a histogram. A low scale number magnifies the data.

Side Scatter (SSC) Also called 90o scatter or right angle scatter. Light scattered at a 90 degree angle as a cell passes through the laser beam. This measurement is related to the internal granularity or complexity of a particle.

Singlet A single particle (cell or nucleus), which a flow cytometer records as one event.

Threshold 阈值，在流式中，这是个很重要的概念！ The lowest channel number for a selected parameter for which an event may be recorded. The flow cytometer sends to the computer only events above the threshold level.
安全问题及流式细胞术的应用

安全问题

既然要学习流式，操作流式，在了解了流式的历史和基本原理后，我们认为最终要的就是安全问题，因为在操作流程中间还是有许多环节存在各种安全隐患，需要我们谨慎操作的，现不完全列出！

1，电安全问题：偏振板，激光供电等都是高电压，要特别小心。仪器内部应该只有厂家人员及相关工作人员才能操作，试验人员不要冒险！！
2，激光安全问题：流式的激光有相应的cover来保护，不要打开，否则危险！某些仪器操作时必须关上相应的门！不要直视激光室内不要有反光物体。不要试图用什么阻断激光束！
3，生物学安全问题：如病毒，细菌，致癌物质等，倒废液桶时要注意！不要用手或身体其它部位直接接触有可能有危险的东西，提高警惕！
4，财产安全问题：流式是贵重仪器，液流系统，激光系统，电脑系统都价值昂贵！大家在操作时千万要严肃，嘻笑不适合在流式旁！

流式细胞术的应用
流式细胞术址检测细胞各种成分的重要细胞生物学工具。它不但可以定量检测细胞膜、细胞质和细胞核中的各种细胞成分，而日可以研究细胞的各种功能状态(细胞增殖，细胞凋亡、细胞分化、酶活性、细胞膜通透性、氧化还原状态、吞噬性等)。目前还叫以定量检测血清中的各种可溶性生物分子成分。

细胞膜：脂质双层分子结构中具有多种蛋白质分子——细胞表面抗原，表面糖类、表面受体，细胞因子，膜电位．膜结合钙离子，细胞表面电荷等，这对确定细胞的性质及其功能是十分重要的。
细胞质：各种细胞成分，包拈蛋白质、RNA、各种细胞器中的特殊成分、各种抗原、基因编码蛋白，细胞质内钙离子、pH值等。
细胞核：DNA，RNA，蛋白质．各种基因表达蛋白、抗原蛋白等。（摘自《实用流式细胞术彩色图谱》）

学看流式图

流式数据可以用一维直方图、二维散点图、等高线图、密度图等来表示，下面逐一附图说明。

1.单参数直方图：

每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布，以直方图的方式来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数，可以是线形（line）或者对数（log）。纵坐标一般是细胞数（count）！如下图：

上图中2N代表G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，两者中间代表S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图
下图为含有大量非整倍体细胞G0/G1(2.8N)和G2/M(5.6N)。

直方图当然不仅仅是用来表示DNA含量的，例如：

上图中101～102（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞。
这里有一个在常见的问题：如何做M1阴性界限？！实际上，这个M1的划分完全是根据阴性对照来的！如下图：红色部分代表阴性对照，即：您所检测的物质在阴性组中的基础表达量，可以理解为背景、静息状态下、基础水平、未受刺激时等。蓝色部分即阳性组，也就是接受刺激后，功能状态下、药物作用后等。

因为我们可以人为地将电压，放大调到相应的大小以达到阴性的右边界在某一个值上，这样后期做sample时好看！当然您也可以调到10的2次方，3次方。

只要机器电压允许，阳性组还有地方放得下。

2.散点图：

用一个例子来说明：

左上：CD4＋
右下：CD8＋
左下：CD4－/CD8－
右上：CD4＋/CD8＋

散点图常被用来分析多参数数据，如上面CD分子的表达，以及凋亡周期特异性，早期凋亡的检测等！如下图：Annexin V-FITC/PI染色。

关于Annexin V-FITC/PI染色右上角的意义，现在有几种说法：
1）坏死＋晚期凋亡
2）晚期凋亡
3）坏死（如下图）

4）其它：（如下图）

我们实验室倾向与第一种说法！大家做实验时要注意！！

散点图可以用来进行多参数分析，上面已经提到。至于参数选择，就可以自己选择了，也许您可以发明一种新的方法来作为试验平台呢！比如这篇文章：《New method for the analysis of cell cycle-specific apoptosis》就是在tunnel法的原理上进行的变化，产生了一种新的细胞周期特异性凋亡的分析方法：API法。

下载链接：
1.膜联蛋白V 与碘化丙啶用于细胞.周期特异性凋.亡的检测
2.New Method for the Analysis of Cell Cycle–Specific Apoptosis

3.等高线图和密度图

这两种图其实就是密度图的变化，等高线图和地图一样。密度图则与等高线图密切联系，密度高的地方颜色就偏红些。

常用流式软件介绍及相关下载

1.cellquest

cellquest是BD公司推出的针对流式的试验数据获取和分析软件。界面友好，操作简单，是目前流式相关软件中应用最多的软件之一。但该软件没有free版本，故无在家学习的可能。因此就不多介绍了！

cellquest中文使用说明：
CELLQUEST软件的使用手册

cellquest 英文使用说明下载地址：
CellQuest使用手册电子书（CellQuest Software Reference Manual）

2.Modfit分析软件

ModFit 是由美国Verity Software House公司设计，专门用于流式细胞术中进行细胞周期分析的软件。它通过对DNA含量直方图进行曲线拟合，能快速计算出各种倍体细胞的含量、细胞周期各时相及亚二倍体细胞所占的比例、DNA指数、G0/G1期峰的变异系数等。此外，2.0版本还增加了“同步化分析”和“增殖分析”的功能，可分别进行同步化细胞和增殖细胞的研究。

在本版内经常出现一些运用Modfit软件进行DNA分析的图。有一些存在软件使用方面的问题，因此，软件使用操作方法将在以后的时间里在生物秀实验频道陆续介绍。

3.WinMDI流式分析软件

这个软件也许是朋友们最感兴趣的一个了，因为它是free版！下载地址我就不使用自己的空间了，因为网上到处都是，就是相关说明比较少，有cellquest使用经验的朋友们上手当然要快一些！

主程序与使用说明下载地址：
WinMDI ver 2.9 下载

使用这个软件可以使原本只能在实验室完成的工作可以转移到家里去进行。软件操作简单，内存占用少，而且是免费的，没有什么版权问题，是值得强力推荐的一个流式分析软件！

4.其它：

如FCSExpressV3Full是个很好的软件，生成图形漂亮，可惜30d的试用期，我重装系统后一直不舍得安装，等需要的时候再安装使用吧。
还有testDNA、analyse、Winlist等，均可以作为辅助软件进行流式资料分析。

关于补偿和gate

关于补偿

在流式荧光之间有相互干扰时，补偿就显得尤为重要了，版内经常有如Annexin V－PI染色检测细胞凋亡的流式图片，但是可以看出，一部分的补偿没有调整好，轻则影响数据准确性，重则出现错误结果！

以下是一个如何学习补偿的PDF，和流式彩色图谱里的基本相同！

关于gate

gate是流式分析中的一个“人为因素”很强的分析过程。很多战友对gate如何做存在疑问。实际上，gate和compensation一样，是有依据的，而不是“人为”的。

比如：全血细胞中想用流式分出淋巴细胞，需要在FSC/SSC上做gate。这个gate就是根据全血细胞中各种细胞的大小、颗粒性分出来的。在图上可以将它们分为几个区域，每个区域由于细胞大小，颗粒性的不同而集中在一起。我们可以画一个gate分出目的细胞。

相关内容很多，不同的试验根据不同的原理，做不同的gate。下面是一个关于gate的PDF！

能否发给有关调补偿的技巧？多谢哈！

谢谢分享

很详实的介绍，能补充流式细胞仪的关键风险点就更好了。