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检验技术定量的数学模型都是寻找检测信号与检测浓度的数学关系。由于PCR的检测方式和传统检测不同,PCR最终检测出的信号的终产物的信号,而要检测的是初始浓度,因此PCR定量的数学模型较为复杂。 首先,终产物的浓度与荧光信号的关系,与一般荧光定量一致,即终产物浓度与荧光信号成正比,设终产物浓度为Cn,信号强度为Fn,则Fn= ε×Cn,其中ε是常数。
第二,终产物的浓度与初始浓度的关系,设初浓度为C,经过的循环数为n,每次扩增的扩增效率为e,则Cn=C×(1+e)n,其中1≤e≥2。
第三,荧光信号与初浓度的关系为:Fn= ε×C×(1+e)n ,取对数为LogF=Logε+nLog(1+e)+LogC,即LogC= LogFn- Logε-nLog(1+e),其中,n,Fn为已知,所以通过标准曲线求出Logε及Log(1+e),就可以得到LogC=LogF-常数。这就是终点法荧光定量的数学模型。
由于PCR成指数扩增,因此高浓度的会很快达到平台期时,低浓度的信号还不能被检测出,所以终点法测荧光线性范围很小。同时,由于终浓度过高,也偏离了光学定量定律,所以为了改进终点荧光定量,发展出了实时荧光定量。
实时荧光定量每循环都要检测荧光信号,但与普通速率法定量不同,实时荧光定量使用Ct值定量,Ct值是指荧光强度一定时的循环数。
以上公式知道,循环数是n,那么LogC= LogFn- Log -nLog(1+e),其中由于Fn一定,所以logFn-logε是常数,即LogC= a -nLog(1+e),而过程中e也假定是一致的,所以LogC= a –bn,即初浓度C的对数与Ct值n成线性关系。
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